Abstract
تم الحفظ الشم كبيرة بين الأنواع ومطلوب للتكاثر والبقاء على قيد الحياة.
في البشر، الشم هي أيضا واحدة من الحواس التي تتأثر مع الشيخوخة وغير مؤشرا قويا على أمراض الاعصاب. وبالتالي، يتم استخدام اختبار الشم كوسيلة من وسائل التشخيص غير الغازية للكشف عن عجز العصبية في وقت مبكر. من أجل فهم الآليات الكامنة حاسة الشم قابلية الشبكة، وقد اكتسب البحوث حاسة الشم لدى القوارض الزخم في العقد الماضي.
هنا، نقدم، الوقت الفعال وقابلة للتكرار طريقة اختبار حاسة الشم بسيط جدا من التصور الفطري رائحة والحساسية في الفئران من دون الحاجة إلى أي نوع من الطعام أو الماء تقييد مسبق. يتم إجراء الاختبارات في بيئة مألوفة للفئران، لا يتطلب سوى الروائح وجلسة 2 دقيقة من التعرض الرائحة. يتم إجراء هذا التحليل، بعد خاصة، وذلك باستخدام الأوامر بمساعدة الحاسوب على يماغيج ويمكن أن يكون، ول، نفذت من البداية الى النهاية من قبل أحد الباحثين.
لا يتطلب هذا البروتوكول أي معدات خاصة أو الإعداد ويشار لأي مختبر ترغب في اختبار إدراك حاسة الشم والحساسية.
Introduction
الشم هي واحدة من الوظائف الحسية الأكثر تطورا ومهمة في الثدييات. أي انخفاض في النشاط حاسة الشم قد تؤثر على تناول الطعام، والسلوك الاجتماعي، وفي أسوأ الحالات، حتى البقاء على قيد الحياة. في البشر، وتدهور حاسة الشم هو العمر تعتمد 1، ويعتبر مؤشرا قويا على الاضطرابات العصبية 2-6. اختبار تحديد حاسة الشم التي وضعتها جامعة بنسلفانيا يمثل حاليا واحدة من والاختبارات التشخيصية الأكثر استخداما، غير الغازية وقابلة للقياس والتي يمكن قياس العجز العصبية المبكرة 7 والتنبؤ باحتمالية عالية تطور الخرف 8،9.
إمكانية الوصول إلى نظام حاسة الشم، وأهمية الشم لدى القوارض، وأثار خط مكثف للبحوث تتناول آليات وظائف الشم الأساسية 10. لقد أظهرنا سابقا أن فقدان وظيفة للباستقبال الإشاراتأو Notch1 يؤثر على تجنب حاسة الشم 11. في هذا البروتوكول نستخدم الفئران التي تفتقر إلى يجند الإشارات، Jagged1، في الخلايا العصبية أو الدبقية لدراسة أداء حاسة الشم.
ويعرف الشم الفطري من قبل ثلاثة المعلمات كما تصور والتمييز بين الروائح وحساسية الشم 4. ويمكن أن يتم اختبار حاسة الشم لدى القوارض في مجموعة متنوعة من الطرق وبعض الدراسات السلوكية الاستفادة من olfactometers، والتي توفر رائحة للحيوان في تركيزات بخار محددة وفي إطار زمني دقيق 12-14. ومع ذلك، فإن هذا القياس مكلفة ويمكن أن يكون متاحا إلا في المرافق المتخصصة. في عملنا، ونحن نقدم حاسة الشم بروتوكول اختبار بسيطة وسريعة وقابلة للتكرار، التي نفذت باستخدام الروائح المتطايرة. ووصفت اختبارات قياس الإدراك إلى جاذبة أو طاردة رائحة ويقيم التمييز بين رائحة و11،15،16 المياه. باستخدام نفس الإعداد، ثه أيضا يمكن قياس حساسية رائحة بتركيزات مختلفة 16،17. وبعد خاص بمساعدة الحاسوب معالجة الفيديو، مستوحاة من عمل الصفحة وزملاؤه 18، ويوفر نتائج مشاركات من دون الحاجة إلى عمى التجريبية والسماح لشخص واحد لتنفيذ التجربة برمتها.
ويهدف هذا البروتوكول إلى توفير نقطة انطلاق لدراسة السلوك حاسة الشم في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة الإجراءات الحيوانية وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية والموافقة عليها من قبل اللجنة المحلية رعاية الحيوان (كانتون فريبورغ، سويسرا).
1. إعداد الحيوانية
- حيوانات التجارب
- إجراء تجارب على البالغين النوع البري من الذكور والفئران المعدلة وراثيا (C57BL / 6 الخلفية) من 3-5 أشهر من العمر. ثلاث مجموعات من الفئران تتوافق مع الضوابط البرية نوع littermate (مجموعة A، Jagged1 flox / flox 19) واثنان مشروطة خطوط الماوس KO (المجموعة B، C Jagged1ncKO و، Jagged1gcKO).
- الفئران منزل تحت ظروف المختبر القياسية في غرفة جيدة التهوية، مع سيطرة دورة الظلام / الضوء 12 ساعة وتوفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
2. الإعداد التجريبية
- الساحة التجريبية
- لالساحة التجريبية، استخدم نظيفة معقمة قفص الماوس (36 سم طول × 20.5 سم عرض × 13.5 سم الارتفاع) (الشكل 1A).
- تعيين كل الماوس إلى قفص مرقمة مع أغطية فراش جديدة، 3 سم ارتفاع. إذا تم إعادة استخدام الأقفاص، كما هو الحال في اختبار حساسية رائحة، واتخاذ التدابير التالية لتجنب التلوث المتبادل بين الروائح والفئران.
- بمناسبة الجانب المياه.
- تنظيف الجدران أضيق من الأقفاص مع ورقتين الأنسجة رش مع 70٪ من الإيثانول، واحدة لكل جانب.
- تتراكم أقفاص وفقا لالتركيب الوراثي للفئران وتخزينها مؤقتا تحت غطاء الصفحي.
- كاميرا
- جبل الكاميرا على حامل ثلاثي القوائم المخصصة بهدف في 58 سم من الجزء السفلي من القفص (الشكل 1A). تحديد موقف من ترايبود والقفص وتعيين حدوده مع علامات للسماح للكاميرا أن تركز على الجزء العلوي من القفص.
- تسجيل الفيديو في 320 بكسل × 240 بكسل، 15.08 لقطة في الثانية كملفات MOV.
- الروائح
- Resuspend وscen فيالخبر، عندما أشار، في المذيبات التي كانت قابلة للذوبان.
- لاختبار تفضيل زبدة الفول السوداني استخدام. Resuspend وزبدة الفول السوداني في زيت الفول السوداني (10٪ ث / ت).
- لتجنب اختبار استخدام النقي 2-Methylbutyric (2 MB) حمض (98٪).
- لاختبار الحساسية، استخدام البول الإناث من نفس المستعمرة الماوس والخلفية (C57BL / 6).
- لراحة جمع البول 1-2 أيام قبل إجراء الاختبار حاسة الشم. كبح جماح مع الاستمرار على الماوس تحت غطاء محرك السيارة مع بطنه فوق شبكة القفص. تحت شبكة القفص وضع طبق بتري بلاستيكية لجمع قطرات من البول.
- جمع البول من كل أنثى في أنبوب 1.5 مل وخلط جميع عينات البول لتطبيع للالتباين بين الحيوانات. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- في يوم من التجربة، وذوبان الجليد في البول وإجراء 4 التخفيفات في الماء المقطر المزدوج في عامل التخفيف من 10 (1:10، 1: 100، 1: 1000، 1: 10000).
3. اختبار شمي
ملاحظة: في هذا البروتوكول الروائح قد تعمدت التي ينظر إليها على أنها جاذبة قوية (زبدة الفول السوداني والبول الإناث) أو طارد قوي (حامض 2-MB) 15. من المهم تنفيذ تفضيل واختبارات الحساسية للروائح لطيفة قبل إجراء الاختبار تجنب للقضاء على إمكانية أي تدخل في السلوك حاسة الشم. ومع ذلك، من أجل البساطة، في هذه الورقة، وتفضيل وتجنب اختبار سيتم حد سواء وصفت تحت اختبار التصور. تبدأ كل دورة السلوكية مع مرحلة التعود.
- التعود المرحلة
- وضع الحيوانات في قفص تعيين نظيف واتركها استكشاف لمدة 5 دقائق (الشكل 1B). منذ البيئة من القفص التجريبي هو مألوف إلى قفص المنزل، وهذه المرة قصيرة بما فيه الكفاية للسماح التعود.
- إذا تم الانتهاء من اختبار حساسية في يوم واحد، نفذ التعود مرة واحدة فقط قبل الطلبات،ن من أعلى رائحة المخفف. إذا تم تنفيذ اختبار حساسية من في أيام مختلفة، في كل يوم هناك حاجة إلى مرحلة التعود على قفص نظيفة الجديد.
- تصور اختبار
- بعد التعود، وتفعيل الكاميرا وماصة على الفور 60 ميكرولتر من رائحة لطيفة (زبدة الفول السوداني) و 60 ميكرولتر من رائحة محايد (مياه الصنبور) على الجدران المقابلة من القفص في حوالي 10 سم من الأسفل (الشكل 1C).
- ترك الماوس استكشاف الروائح لمدة 2 دقيقة (1D الشكل). بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل الكاميرا.
- في هذه المرحلة، والمضي قدما مع الماوس المقبل بدءا من مرحلة التعود. إجراء اختبار تجنب بالضبط بنفس الطريقة عن طريق تطبيق 60 ميكرولتر من رائحة طارد (حمض 2-MB) و 60 ميكرولتر من الماء.
- اختبار حساسية
- تقييم عتبة جذب الفئران الذكور إلى زيادة تركيزات البول الإناث بالترتيب التالي: 1: 10000. 1: 1000. 1: 100؛ 1:10 والبول النقي.
- بعد التعود، فضح كل الماوس إلى أعلى تخفيف pipetted من قبل المجرب كما هو موضح سابقا في 3.2.1.
- تسجيل السلوك الاستكشافي البول مقابل المياه، ضمن إطار زمني 2 دقيقة على كاميرا الفيديو. بعد أن يتم اختبار جميع الأفواج الفئران لأعلى التخفيف (1: 10000)، فضح إلى تركيز أعلى من البول، كما هو مبين أعلاه.
4. ما بعد مخصصة تحليل البيانات
ملاحظة: تتم معالجة جميع الاختبارات السلوكية وصف آخر المخصص اتباع التعليمات تحليل البيانات.
- فتح ملفات MOV في يماغيج لأنظمة ويندوز
- تثبيت وقت سريع للجافا باستخدام إعدادات مخصصة من http://www.apple.com/quicktime/download.
- تثبيت البرنامج المساعد وقت سريع من موقع يماغيج (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
- استيراد QTJava.zip (C: ملفات البرنامج كويك تايم QTSystem) في EXTENS مكتبةأيون من يماغيج (.ImageJ جري ليب تحويلة).
- نسخة أيضا QTJava.zip في مجلد الإضافات وتسميته كما QTJava.jar.
- تثبيت ستة النصوص المرفقة في مجلد وحدات الماكرو (يماغيج الإضافات وحدات الماكرو).
- فتح يماغيج وترجمة وتشغيل البرنامج المساعد وقت سريع، بعد ذلك بالقرب يماغيج.
- إعادة فتح يماغيج وفتح ملف MOV باستخدام ملف> استيراد> باستخدام وقت سريع.
- تعديل الفيديو
- مرة واحدة يتم فتح ملف الفيديو في يماغيج، وقطع الفيديو من أجل الحصول على ثابت استكشاف 2 دقيقة من وقت مجرب وpipetted للعطور في قفص (T0). تحديد إطار المقابلة لT0 وإزالة الإطارات السابقة باستخدام الزيادات من 1 (يماغيج صورة الأكوام ToolsSlice مزيل). استخدام نفس الأمر لحذف كل الإطارات التي تتجاوز التنقيب عن 2 دقيقة.
- تأكد من أن القفص يتركز وإذا كان استخدام ما يلزم من صورة> تحويل> الأمر استدارة إلى محاذاة ذلك.
- بنصيحةس المعالجة
ملاحظة: معالجة الفيديو بشكل كامل بمساعدة الحاسوب ويستخدم الأوامر وحدات الماكرو يرافق هذه الورقة.- من أجل تقييد المنطقة على قفص من 127 بكسل X 218 بكسل حجم تشغيل الماكرو الخطوة 1 من البرنامج المساعد> وحدات الماكرو> الأمر تشغيل. تحريك مستطيل ثابتة على القفص (الشكل 2، الخطوة 1).
- اقتصاص المنطقة من القفص على المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام الماكرو الخطوة 2 (الشكل 2، الخطوة 2).
- استخدام الماكرو الخطوة 3 لاستخراج صورة الماوس من الخلفية عن طريق تعيين إشارة العتبة، despeckling وتصفية الفرق الإشارة. قيم الناتج في مؤامرة Z المحور تشير القيم الرمادية متوسط الموافق كثافة الظل الماوس تتحرك داخل ROI من "غرفة المياه" أثناء التنقيب عن 2 دقيقة. نسخ النتائج في ورقة عمل اسمه وفقا لROI في ملف جدول (الشكل 2 الخطوة 3).
- استخدام الماكرو الخطوة 4 لاستخراج القيم رمادي متوسط من الماوس في ROI "غرفة رائحة". نسخ النتائج في ورقة عمل اسمه وفقا لROI في ملف جدول نفسه كما في 4.3.3 (الشكل 2، الخطوة 4).
- من أجل مزيد من القيود على تحليل حركة الماوس في ROI "محيط المياه" استخدام الماكرو الخطوة 5. نسخ النتيجة إلى ورقة العمل اسمه وفقا لROI في ملف جدول نفسه كما في 4.3.3 (الشكل 2، الخطوة 5).
- لتقييد تحليل حركة الماوس في ROI "محيط رائحة" استخدام الماكرو الخطوة 6. نسخ النتيجة إلى ورقة العمل اسمه وفقا لملف ROI جدول كما في 4.3.3 (الشكل 2، الخطوة 6).
- معالجة كافة ملفات الفيديو والتحقق من وجود تناسق في عدد من الإطارات في الحيوانات. هنا، تسجيل جميع الحيوانات لإطارات 1810 الموافق جلسة التنقيب عن 2 دقيقة.
- لكل حيوان ولكل ROI نوع الإطارات مع متوسط زارة شؤون المحاربين القدامى الرماديزهري أكبر من 0. تقسيم عدد الإطارات التي كتبها القيم الموافق 1 ثانية والحصول الثواني قضى في كل ROI.
5. التحليل الإحصائي
- لكل اختبار التحقق من تجانس التباين داخل المجموعات / المورثات بواسطة اختبار بارتليت باستخدام الصيغة المتاحة على http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
- في جذب وتجنب الاختبار، إجراء مقارنات بين الأوقات التي عشتها مع الماء مقابل رائحة ضمن مجموعة واحدة باستخدام اختبار (ت) لطالب غير اتجاهي لافتراض الفروق متساوية أو غير متساوية اعتمادا على نتائج اختبار بارتليت. مقارنة العصر الذي يقضيه مع الروائح تطرح بحلول الوقت الذي يقضيه مع المياه بين الأنماط الجينية التي كتبها في اتجاه واحد ANOVA مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل.
- في اختبار حساسية تحليل المقارنات من الوقت الذي يقضيه مع رائحة تطرح من الوقت الذي يقضيه مع توفير المياهص بين المجموعات في التخفيفات محددة من البول في اتجاه واحد ANOVA مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل. مقارنة حساسية بين مجموعة من تركيزات رائحة نموا بنسبة 2 في اتجاه ANOVA مع التكرار مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل.
- يتم التحقيق في التفاعل بين الأنماط الجينية والعلاجات في جذب وتجنب اختبار بنسبة 2 في اتجاه ANOVA مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقيس اختبار التصور جذب لزبدة الفول السوداني وتجنب لحمض 2-MB. يتم اختبار ثلاث مجموعات من الفئران والوقت الذي يقضيه في "محيط رائحة" وكميا مقارنة بالمياه. في اختبار تفضيل، تعرض المجموعة الضابطة تفضيل كبير لرائحة مقارنة بالمياه (ر 8 = 2.52، p <0.05). من ناحية أخرى، مجموعة B لا تظهر أي جاذبية كبيرة لزبدة الفول السوداني وتنفق المزيد من الوقت مع الماء (ر 6 = 3.22، p <0.05). وهكذا، فإنه يتصرف بشكل مختلف عن المجموعة الضابطة A (F 1،7 = 26.39، P <0.005). بالإضافة إلى ذلك، مجموعة C يظهر أي تمييز، وتنفق في الوقت نفسه تقريبا مع الماء وزبدة الفول السوداني (ر 8 = 0.78، P = 0.45). على العموم، فإن المجموعات الثلاث تتصرف بشكل مختلف (F 2،9 = 19.83، P <0.005)، وهناك تفاعل كبير بين النمط الجيني والعلاج (زبدة الفول السوداني والمياه) (F 2،1 = 4،90، ف <0.005) ( ردا على 2-MB حمض تعرض المجموعة الضابطة لتجنب رد الفعل ونتيجة لذلك تنفق المزيد من الوقت مع الماء (ر 8 = 2.67، p <0.05). وبالمثل، مجموعة B يظهر رد الفعل تجنب وضوحا ل2-MB حمض (ر 6 = 3.71، p <0.01). من ناحية أخرى، مجموعة C لا يميز بين الروائح اثنين ويقضي أوقات مقارنة مع 2-MB الحامض والماء (ر 8 = 2.2، P = 0.6) (الشكل 3B). على العموم، ويقارن بين استجابة تجنب المجموعات الثلاث لا تعرض سلوك مختلف الكبير (F 2، 9 = 0.76، P = 0.49) نتيجة لعدم وجود تفاعل بين العلاج وراثى (F 1، 2 = 0.52، ص = 0.63). في اختبار حساسية الشم البول الإناث، يعرض منحنى تفضيل البول بتركيزات مختلفة مقابل المياه (الرقم القياسي = وقت الأفضلية الذي يقضيه مع البول تطرح بحلول الوقت الذي يقضيه مع الماء). في الهو اختبار، نلاحظ أن المجموعة الضابطة A ديه عتبة جذب البول في التخفيف من 1: 1000 وعرض زيادة جذب البول مع ارتفاع تركيزات. المجموعة B و C عرض 100 أضعاف أعلى عتبة لجذب (1:10) بالمقارنة مع المجموعة (أ) (F 2،9 = 4،78، ف <0.05). المجموعة B وعرض C منحنيات حساسية قابلة للمقارنة (F = 1،19 0.36، ع = 0.55). مقارنة حساسية بين المجموعات، يبدو أن مجموعة A ديه حساسية أعلى للالبول الإناث بالمقارنة مع مجموعة B و C (F = 2،19 7.12، p <0.01) (الشكل 4). 
الشكل 1: تمثيل الإعداد المستخدم لإجراء اختبارات الشم. (A) كاميرا فوق القفص. يتم وضعها (B) الفئران في قفص لفترة التعود 5 دقائق. (C) وODOو pipetted الصاخبة على جدار القفص. (D) النشاط الاستكشافي من الرائحة مقابل المياه يتم اختباره في نافذة 2 دقيقة. 
الشكل 2:. سير العمل لمعالجة الفيديو بمساعدة الحاسوب باستخدام أوامر وحدات الماكرو في يماغيج يشير المثال إلى ماوس من المجموعة (أ) تتعرض لالبول في 1:10 تخفيف الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل (3): أن يكونوا قد تعرضوا ممثل النتائج من حاسة الشم تفضيل وتجنب اختبارات الفئران من المجموعات الثلاث (ن = 5 للمجموعة A، ن = 4 لمجموعة B ون = 5 للمجموعة C) إلى (A) الفول السوداني ولكنثالثا وحمض (B) 2-MB لدورة الاستكشاف 2 دقيقة. ويمثل إجمالي الوقت استكشاف رائحة (الدوائر السوداء) مقابل المياه (الدوائر الرمادية). يشار إلى اختلافات كبيرة في سلوك حاسة الشم بين الجماعات التي كتبها الحانات، والنجمة أفقية سوداء. وتظهر فروق ذات دلالة إحصائية في استنشاق مرات بين الرائحة والمياه داخل الجماعات التي كتبها الحانات، والنجمة الأفقية الرمادية. * P <0.05، ** P <0.01 *** P <0.01 (قضبان أفقية الرمادية، ر الطالب اختبار؛ العقلة السوداء، في اتجاه واحد ANOVA). أشرطة الخطأ هي الأخطاء المعيارية للمتوسط (SEM). 
الرقم 4: ممثل النتائج من اختبارات الحساسية لزيادة تركيزات البول الإناث منحنى مؤشر التفضيل، التي قدمها الوقت الاستكشاف مع البول بتركيزات مختلفة تطرح بحلول الوقت الذي يقضيه مع الماء، وتبين أن مجموعةA (ن = 5) لديه حساسية أعلى للالبول بالمقارنة مع المجموعة الثانية (ن = 4) وC (ن = 5). * P <0.05 (قضبان أفقية سوداء، في اتجاه واحد ANOVA). أشرطة الخطأ هي SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاختبارات المقترحة في هذا البروتوكول تسمح لتقييم جوانب مختلفة من السلوك الفطري حاسة الشم في الفئران: إدراك الروائح والتمييز بين الروائح مقابل المياه والحساسية للروائح. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي رائحة وفقا لتفضيل وعلى نطاق وتجنب أظهرت في وقت سابق 15. منذ يستند بروتوكول بشأن النشاط الاستكشافي فمن المهم أن الفئران لا تعرض أي إعاقة حركية أو القلق التي قد تؤثر على حركتهم وتتداخل مع استكشاف حاسة الشم. وتهدف الاختبارات وصفها لالفئران الذكور البالغين إلا أنها يمكن تكييفها لتحقيق الشم أيضا في الإناث البالغات أو الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين.
قبل البدء في هذه الدراسة التحقيق الشم في الفئران من المهم الالتفات إلى الجوانب التالية: 1) إجراء كل اختبار في الفترة الفاصلة من 3 أيام على الأقل. وينبغي اختبار فسخ العقد وآخر للحد من التدخل من الذاكرة الشمية 20؛ 2) القيام البريدxperiments في نفس الوقت من اليوم، ويفضل أن يكون ذلك في وقت متأخر بعد الظهر، عندما الفئران في دورة النشطة 21 واستخدام مصدر الضوء خافتا. وبالإضافة إلى ذلك، وتحديد مواعيد اختبار حاسة الشم في بعض الأحيان الضوابط المحددة لإجراء تغييرات الساعة البيولوجية المحتملة في وظائف الشم 22؛ 3) قبل البدء في اختبار الابطال، والذي يستخدم عطر طارد، مثل الأحماض، وجلب قفص واحد في ذلك الوقت في جناح تجريبي والحفاظ على قفص تحت غطاء الصفحي. هذه الخطوة مهمة لتجنب التعود على الرائحة والحصول على استجابة أكثر تجانسا في نفس المجموعة. 4) فصل الفئران التي تم اختبارها حتى يتعرض كل الفئران من نفس القفص إلى الرائحة، للحد من التلوث الرائحة مؤقتا. 5) استخدام الحيوانات من نفس السلالة، منذ سلالات مختلفة يمكن أن تتصرف بطريقة غير متجانسة عندما تتعرض إلى الرائحة 23؛ 6) يجب أن المجرب ارتداء معطف المختبر في جميع الأوقات، وتغيير القفازات بين الحيوانات لمنع رائحة الاختلاط؛ 7)بعد pipetting لالمشغل يجب أن تتحرك ببطء بعيدا عن القفص على مسافة 1.3 متر لمنع أي التباس التحفيز للفئران أثناء التنقيب عن حاسة الشم. ينبغي استبعاد 8) الفئران التي تظهر القيم الرمادية يعني فقط في غرفة واحدة من الدراسة، حيث من المتوقع الفئران لاستكشاف مجلسي بدرجات مختلفة.
الطريقة الموصوفة يقدم العديد من المزايا أكثر من غيرها من البروتوكولات: أنها بسيطة للغاية لاقامة، يستخدم مواد غير مكلفة، فمن الانتهاء بسرعة ويستفيد من البرمجيات مفتوحة المصدر، مثل يماغيج. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم وحدات الماكرو التي هي على استعداد ليتم تثبيتها والتي يمكن أن تكون مخصصة استخدامها وتكييفها مع أي ساحة وأكثر من 2 محيط رائحة. لا بد من الإشارة إلى أن فقط من الوقت الذي يقضيه في محيط رائحة تعيينه هو مقياس للنشاط حاسة الشم. في حين أن الوقت الذي يقضيه في كل غرفة يعطي قراءات من النشاط الاستكشافي للفأرة وما هو إلا تقدير تقريبي للسلوك حاسة الشم. كما هو الحال مع أساليب أخرى، القوة الإحصائية يمكن الحصول عليها عن طريق زيادة عدد الحيوانات في المجموعة.
بالمقارنة مع اختبار حاسة الشم باستخدام olfactometers، والتي يمكن التحكم تلقائيا لضغط البخار ووقت التسليم 12-14، وأقل ضبطا البروتوكول المقترح. ومع ذلك، يتم تطبيق كافة الروائح بكميات متساوية، على مسافة محددة وللإطار نفس الوقت. وهكذا، وحفظ هذه المتغيرات ثابتة، في هذا الاختبار لolfactometer غير مطلوب. هناك قيود محتملة أخرى لهذا البروتوكول التي تتكون في الوقت اللازم لتعديل وقطع كل فيديو للحصول على عدد محدد من الإطارات. ومع ذلك، فإن نفس التحليل بمساعدة الحاسوب يمكن أن تستخدم أيضا على الاجهزة أكثر تطورا مع منافذ رائحة تسليم رائحة في أوقات محددة. في هذه الحالة، يمكن وضع قطع الفيديو تلقائيا.
بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات باستخدام منصات القطن طmpregnated مع رائحة لاختبار جاذبية وتجنبها، ويوفر هذا البروتوكول على معلومات إضافية حول التمييز بين حاسة الشم رائحة جديدة ومحايدة رائحة (الماء) 15،16 في جلسة واحدة تجريبية واحدة. وعلاوة على ذلك، لا يتطلب البروتوكول عمى التجريبية ويمكن أن تتم بالكامل من قبل المجرب واحد باستخدام التحليل بمساعدة الحاسوب متحيز.
هذه التجارب بسيطة يمكن استخدامها لمراقبة تطور العجز العصبية في نماذج الفئران مرض الزهايمر أو الشلل الرعاش والتحقيق في آليات نقل حاسة الشم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Italplast (Italy) | 1144B | 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height |
| Chipped wood bedding | Abedd (Austria) | LTE E-001 | 3 cm high |
| Peanut butter | Migros (Switzerland) | NA | 1:10 |
| 2-Methylbutyric | Sigma Aldrich (Switzerland) | W269514 | Pure |
| Female urine from fertile females of same mouse strain | NA | NA | Dilution series |
| Camera | Olympus (US) | Camedia C-8080 | MOV files |
| Quicktime for Java (Windows) | Apple (USA) | NA | video plugin for visualizing MOV files |
| ImageJ for Windows | NIH (USA) | NA | Video Processing/Analysis |
References
- Doty, R. L., Kamath, V. The influences of age on olfaction: a review. Cognitive Science. 5, 20 (2014).
- Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Archives of Neurology. 55 (1), 84-90 (1998).
- Moberg, P. J., et al. Olfactory Dysfunction in Schizophrenia: A Qualitative and Quantitative Review. Neuropsychopharmacology. 21 (3), 325-340 (1999).
- Kovács, T. Mechanisms of olfactory dysfunction in aging and neurodegenerative disorders. Ageing Research Reviews. 3 (2), 215-232 (2004).
- Barrios, F. A., et al. Olfaction and neurodegeneration in HD. Neuroreport. 18 (1), 73-76 (2007).
- Doty, R. L. Olfaction in Parkinson’s disease and related disorders. Neurobiology of Disease. 46 (3), 527-552 (2012).
- Doty, R. L., Shaman, P., Dann, M. Development of the University of Pennsylvania Smell Identification Test: a standardized microencapsulated test of olfactory function. Physiology & Behavior. 32 (3), 489-502 (1984).
- Devanand, D. p, et al. Olfactory Deficits in Patients With Mild Cognitive Impairment Predict Alzheimer’s Disease at Follow-Up. American Journal of Psychiatry. 157 (9), 1399-1405 (2000).
- Conti, M. Z., et al. Odor Identification Deficit Predicts Clinical Conversion from Mild Cognitive Impairment to Dementia Due to Alzheimer’s Disease. Archives of Clinical Neuropsychology. 28 (5), 391-399 (2013).
- Keller, A., Vosshall, L. B. Better Smelling Through Genetics: Mammalian Odor Perception. Current opinion in neurobiology. 18 (4), 364-369 (2008).
- Brai, E., et al. Notch1 activity in the olfactory bulb is odour-dependent and contributes to olfactory behaviour. European Journal of Neuroscience. 40 (10), 3436-3449 (2014).
- Larson, J., Hoffman, J. S., Guidotti, A., Costa, E. Olfactory discrimination learning deficit in heterozygous reeler mice. Brain Research. 971 (1), 40-46 (2003).
- Alonso, M., et al. Olfactory Discrimination Learning Increases the Survival of Adult-Born Neurons in the Olfactory Bulb. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10508-10513 (2006).
- Wesson, D. W., Keller, M., Douhard, Q., Baum, M. J., Bakker, J. Enhanced urinary odor discrimination in female aromatase knockout (ArKO) mice. Hormones and behavior. 49 (5), 580-586 (2006).
- Kobayakawa, K., et al. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450 (7169), 503-508 (2007).
- Witt, R. M., Galligan, M. R., Despinoy, J., Segal, R. Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse. Journal of Visualized Experiments JoVE. (23), (2009).
- Lee, A. W., Emsley, J. G., Brown, R. E., Hagg, T. Marked differences in olfactory sensitivity and apparent speed of forebrain neuroblast migration in three inbred strains of mice. Neuroscience. 118 (1), 263-270 (2003).
- Page, D. T., et al. Computerized assessment of social approach behavior in mouse. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 3, 48 (2009).
- Nyfeler, Y., et al. Jagged1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal. Embo J. 24 (19), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386" 3504-3515 (2005).
- Tong, M. T., Peace, S. T., Cleland, T. A. Properties and mechanisms of olfactory learning and memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Steinlechner, S. Chapter 2.12 - Biological Rhythms of the Mouse. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179 383-407 (2012).
- Corthell, J., Stathopoulos, A., Watson, C., Bertram, R., Trombley, P. Olfactory Bulb Monoamine Concentrations Vary with Time of Day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Lehmkuhl, A. M., Dirr, E. R., Fleming, S. M. Olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51804 (2014).
