Abstract
El olfato está altamente conservada entre las especies y se requiere para la reproducción y la supervivencia.
En los seres humanos, el olfato es también uno de los sentidos que se ve afectado con el envejecimiento y es un fuerte predictor de enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, las pruebas de olfato se utiliza como un método de diagnóstico no invasivo para detectar déficits neurológicos desde el principio. Con el fin de comprender los mecanismos subyacentes de sensibilidad olfativa red, la investigación olfativa en roedores ha cobrado impulso en la última década.
A continuación, presentamos un método muy simple, eficiente en tiempo y reproducible prueba olfativa de innata percepción del olor y la sensibilidad en los ratones sin la necesidad de cualquier restricción de alimentos o agua antes. Las pruebas se realizan en un ambiente familiar a los ratones, requieren sólo los olores y una sesión de 2 minutos de exposición odorante. Se lleva a cabo el análisis, post-hoc, utilizando comandos asistida por ordenador en ImageJ y puede ser, por lo tanto,, Llevado a cabo de principio a fin por un investigador.
Este protocolo no requiere ningún hardware o configuración especial y está indicado para cualquier laboratorio interesado en probar la percepción olfativa y sensibilidad.
Introduction
El olfato es una de las funciones sensoriales más desarrollados e importantes en los mamíferos. Cualquier alteración en la actividad olfativa puede afectar la ingesta de alimentos, el comportamiento social y, en el peor de los casos, incluso la supervivencia. En los seres humanos, el deterioro del olfato es dependiente de 1 año y es considerado un fuerte predictor de trastornos neurológicos 2-6. La prueba de identificación del olfato desarrollado por la Universidad de Pennsylvania representa actualmente una de las pruebas más utilizadas, no invasivos y cuantificables, de diagnóstico que pueden evaluar los déficits neurológicos primeros 7 y predecir con alta probabilidad la progresión de la demencia 8,9.
La accesibilidad del sistema olfativo y la prominencia del olfato en los roedores, ha desatado una intensa línea de investigación frente a los mecanismos de las funciones olfativas subyacentes 10. Hemos demostrado anteriormente que la pérdida de la función del recept señalizacióno Notch1 afecta evitar olfativa 11. En este protocolo que utilizamos ratones que carecen del ligando de señalización, Jagged1, en neuronas o células gliales para estudiar el rendimiento olfativo.
Olfato innato se define por tres parámetros como la percepción, la discriminación entre los olores y la sensibilidad olfativa 4. Pruebas olfativas en roedores se puede hacer en una variedad de maneras y algunos estudios de comportamiento hacer uso de olfatómetros, que proporcionan el olor al animal en un concentraciones de vapor específicas y en un marco de tiempo precisa 12 - 14. Sin embargo, esta instrumentación es caro y puede estar disponible sólo en instalaciones especializadas. En nuestro trabajo, ofrecemos un protocolo de prueba olfativa simple, rápida y reproducible, que se lleva a cabo utilizando aromas volátiles. Las pruebas descritas percepción medida para un atrayente o un olor repelente y evaluar la discriminación entre el olor y 11,15,16 agua. Usando la misma configuración, wE también puede medir la sensibilidad a un olor a diferentes concentraciones 16,17. El procesamiento post-hoc asistida por ordenador de vídeo, inspirado en la obra de la página y sus colegas 18, ofrece resultados sin la necesidad de cegamiento experimental y permitiendo una sola persona para llevar a cabo todo el experimento.
Este protocolo está destinado a proporcionar un punto de partida para estudiar el comportamiento olfativo en ratones.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales están en conformidad con la Directiva de la UE 2010/63 / UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y son aprobados por el Comité local de Cuidado de Animales (Cantón de Friburgo, Suiza).
1. Preparación Animal
- Los animales experimentales
- Realizar experimentos sobre tipo salvaje adulto de sexo masculino y de ratones transgénicos (C57BL / 6 de fondo) de 3-5 meses de edad. Los tres grupos de ratones corresponden a los controles de tipo salvaje (littermate grupo A, Jagged1 flox / flox 19) y dos líneas condicionales de ratón KO (grupo B, C y Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
- Los ratones en condiciones de laboratorio estándar en una habitación ventilada, con un ciclo de oscuridad / luz controlada 12 horas y proporcionan alimento y agua ad libitum.
2. Configuración Experimental
- Arena Experimental
- Para el ámbito experimental, utilizar una jaula ratón esterilizada limpia (36 cm largo x 20.5 cm de ancho x 13.5 cm de altura) (Figura 1).
- Asigne a cada ratón a una jaula numerada con ropa de cama fresca, 3 cm de alto. Si se vuelven a utilizar jaulas, como en la prueba de sensibilidad al olor, tome las siguientes medidas para evitar la contaminación cruzada entre los olores y ratones.
- Marque el lado del agua.
- Limpiar las paredes estrechas de las jaulas con dos papeles de seda rociadas con 70% de etanol, uno para cada lado.
- Apilar las jaulas de acuerdo con el genotipo de los ratones y almacenar temporalmente bajo una campana laminar.
- Cámara
- Montar una cámara en un trípode personalizada con el objetivo a 58 cm de la parte inferior de la jaula (Figura 1A). Fijar la posición del trípode y la jaula y delimitar con marcas para permitir que la cámara se centra en la parte superior de la jaula.
- Grabar videos en 320 píxeles x 240 píxeles, 15,08 fotogramas por segundo como archivos MOV.
- Olores
- Resuspender el scents, cuando se indique, en el disolvente en el que son solubles.
- Para la prueba de preferencia de uso de mantequilla de maní. Resuspender la mantequilla de cacahuete en aceite de cacahuete (10% w / v).
- Para la utilización prueba de evitación puro 2-metilbutírico (2-MB) ácido (98%).
- Para la prueba de sensibilidad, utilizar orina femenina de la misma colonia ratón y de fondo (C57BL / 6).
- Por conveniencia recoger la orina 1-2 días antes de la prueba olfativa. Restringir y mantenga pulsado el ratón debajo de la capilla con su vientre encima de la rejilla de la jaula. Bajo la rejilla jaula colocar una placa de Petri de plástico para recoger las gotas de orina.
- Recoger la orina de cada mujer en un tubo de 1,5 ml y mezclar todas las muestras de orina para normalizar la variabilidad entre animales. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.
- En el día del experimento, descongelar la orina y realizar 4 diluciones en agua doblemente destilada a un factor de dilución de 10 (1:10, 1: 100, 1: 1.000; 1: 10.000).
3. Las pruebas olfativas
Nota: En este protocolo olores han sido elegidos deliberadamente que se perciben como atrayentes fuertes (mantequilla de maní y orina femenina) o repelente fuerte (ácido 2-MB) 15. Es importante para llevar a cabo la preferencia y las pruebas de sensibilidad a los olores agradables antes de la prueba de evitación para eliminar la posibilidad de cualquier interferencia con el comportamiento olfativo. Sin embargo, en aras de la simplicidad, en este trabajo, prueba de preferencia y la evitación será tanto se describe en la prueba de percepción. Cada sesión de comportamiento comienza con una fase de habituación.
- La habituación fase
- Colocar el animal en la jaula asignado limpia y se deja explorar durante 5 min (Figura 1B). Desde el entorno de la jaula experimental es familiar a la jaula de alojamiento, este corto período de tiempo es suficiente para permitir la habituación.
- Si se completa la prueba de sensibilidad en un solo día, realice habituación sólo una vez antes de la application de la más alta olor diluido. Si la prueba de sensibilidad se lleva a cabo en diferentes días, en cada día se necesita una fase de habituación en una nueva jaula limpia.
- Prueba de Percepción
- Después de la habituación, activar la cámara e inmediatamente pipetear 60 l de la agradable aroma (mantequilla de maní) y 60 l de la olor neutro (agua del grifo) sobre las paredes opuestas de la jaula en alrededor de 10 cm desde la parte inferior (Figura 1C).
- Deje que el ratón explorar los olores durante 2 min (Figura 1D). A partir de entonces, apague la cámara.
- En este punto, continúe con la próxima ratón a partir de la fase de habituación. Realizar la prueba de evitación exactamente de la misma manera mediante la aplicación de 60 l de la olor repelente (ácido 2-MB) y 60 l de agua.
- Prueba de sensibilidad
- Evaluar el umbral de atracción de ratones macho a concentraciones crecientes de orina femenina en el siguiente orden: 1: 10.000; 1: 1.000; 1: 100; 1:10 y en la orina pura.
- Después de la habituación, exponer cada ratón para la mayor dilución pipeta por el experimentador como se describe anteriormente en 3.2.1.
- Registre el comportamiento exploratorio de la orina frente de agua, dentro de un plazo de 2 minutos en una cámara de vídeo. Después de todas las cohortes ratones son la prueba de la mayor dilución (1: 10.000), exponerlo a una mayor concentración de la orina, como se indicó anteriormente.
4. Post-hoc de análisis de datos
Nota: Todas las pruebas de comportamiento descritos se procesan post hoc siguiendo las instrucciones de análisis de datos.
- Abrir archivos MOV en ImageJ para sistemas Windows
- Instalar Quick Time para Java usando la configuración personalizada de http://www.apple.com/quicktime/download.
- Instale el plugin de Quick Time desde el sitio web ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
- Importe el QTJava.zip (C: Archivos de programa QuickTime QTSystem) en las extens bibliotecaión de ImageJ (.ImageJ jre lib ext).
- Copiar también el QTJava.zip en la carpeta plugins y cambiarle el nombre como QTJava.jar.
- Instale los seis guiones adjuntos en la carpeta Macros (ImageJ plugins Macros).
- Abrir ImageJ y compilar y ejecutar el plugin de Quick Time, a partir de entonces cerca ImageJ.
- Reabrir ImageJ y abra el archivo MOV utilizando Archivo> Importar> usando Quick Time.
- Ajuste de vídeo
- Una vez que el archivo de vídeo se abre en ImageJ, cortar el vídeo con el fin de obtener una constante exploración 2 min desde el momento en que el experimentador ha pipetearon los odorantes en la jaula (T0). Identificar la estructura correspondiente al T0 y quitar los marcos anteriores utilizando incrementos de 1 (ImageJ imagen Pilas ToolsSlice removedor). Utilice el mismo comando para eliminar todas las tramas que superan la exploración 2 min.
- Asegúrese de que la jaula está centrado y si es necesario, utilice la Imagen> Transformar> comando Rotar para alinearlo.
- Véaseo Procesamiento
Nota: El procesamiento de vídeo es totalmente asistida por ordenador y usa comandos macros que acompañan este documento.- Con el fin de restringir el área en la jaula de un 127 píxeles x 218 píxeles Tamaño de ejecutar el Paso 1 macro desde el Plugin> Macros> Ejecutar comando. Mueva el rectángulo fijo sobre la jaula (Figura 2, Paso 1).
- Recortar el área de la jaula en la región de interés (ROI) con el Paso 2 macro (Figura 2, Paso 2).
- Utilice la macro Paso 3 para extraer la imagen del ratón del fondo mediante la asignación de una señal de umbral, eliminación de puntos y el filtrado de la varianza de la señal. Los valores de salida en la trama eje Z indican los valores de gris medio, correspondiente a la intensidad de la sombra del ratón en movimiento dentro de la ROI de la "cámara de agua" durante la exploración 2 min. Copie los resultados en una hoja de cálculo denominada según el retorno de la inversión en un archivo de hoja de cálculo (Figura 2, Paso 3).
- Utilice el Paso 4 macro paraextraer los valores medios de grises el ratón en la ROI "cámara de olor". Copie los resultados en una hoja de cálculo denominada según el retorno de la inversión en la misma hoja de cálculo como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 4).
- Con el fin de restringir aún más el análisis del movimiento del ratón en el retorno de la inversión "perímetro agua" utilizar el Paso 5 macro. Copie el resultado en la hoja de cálculo llamado según el retorno de la inversión en la misma hoja de cálculo como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 5).
- Para restringir el análisis del movimiento del ratón en el retorno de la inversión "olor perímetro" utilizar el Paso 6 macro. Copie el resultado en la hoja de cálculo llamado de acuerdo con el archivo de hoja de cálculo de retorno de la inversión como en 4.3.3 (Figura 2, Paso 6).
- Procesar todos los vídeos y comprobar la consistencia en el número de fotogramas por animales. Aquí, registrar todos los animales de 1810 tramas correspondientes a una sesión de exploración de 2 min.
- Para cada animal y para cada tipo de ROI con marcos va de gris mediolues mayor que 0. Divide el número de fotogramas por los valores correspondientes a 1 segundo y obtener los segundos transcurridos en cada retorno de la inversión.
5. Análisis estadístico
- Para cada prueba verificar la homogeneidad de la varianza dentro de grupos / genotipos mediante la prueba de Bartlett utilizando la fórmula disponible en http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
- En la prueba de la atracción y evitación, realizar comparaciones entre los tiempos pasados con agua frente olor dentro de un grupo utilizando la prueba t de Student no direccional asumiendo varianzas iguales o desiguales en función de los resultados de la prueba de Bartlett. Compare los tiempos pasados con los olores restados por el tiempo que pasa con el agua entre los genotipos mediante un modelo lineal con la prueba post-hoc de Bonferroni.
- En la prueba de sensibilidad a analizar las comparaciones del tiempo pasado con el olor restado del tiempo pasado con finalesr entre los grupos en un diluciones específicas de la orina por un modelo lineal con la prueba post-hoc de Bonferroni. Comparar la sensibilidad entre los grupos a las concentraciones crecientes de olor en un 2-Way ANOVA con repeticiones con test post-hoc de Bonferroni.
- La interacción entre genotipos y tratamientos en la prueba de la atracción y la evasión son investigados por 2 vías ANOVA con test post-hoc de Bonferroni.
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Representative Results
La prueba mide la percepción de la atracción a la mantequilla de maní y la evitación de ácido 2-MB. Tres grupos de ratones se prueban y el tiempo pasado en el "olor perímetro" se cuantifican en comparación con agua. En la prueba de preferencia, el grupo de control A muestra preferencia significativa al olor en comparación con agua (8 t = 2,52, p <0,05). Por otra parte, el grupo B no muestra ningún interés significativo para la mantequilla de maní y pasa más tiempo con agua (t 6 = 3.22, p <0.05). Por lo tanto, se comporta de manera diferente del grupo de control A (F 1,7 = 26,39, p <0,005). Además, el grupo C no muestra la discriminación y pasa casi al mismo tiempo con el agua y la mantequilla de maní (t 8 = 0,78, p = 0,45). En conjunto, los tres grupos se comportan de manera diferente (F 2,9 = 19,83, p <0,005) y hay una interacción significativa entre el genotipo y el tratamiento (mantequilla de maní y agua) (F 2,1 = 4,90, p <0,005) ( En respuesta a la 2-MB ácido del grupo de control muestra un reflejo de evitación y como resultado pasa más tiempo con agua (8 t = 2.67, p <0.05). De manera similar, el grupo B muestra un reflejo de evitación pronunciada a 2 MB-ácido (t = 6 3,71, p <0,01). Por otro lado, el grupo C no discrimina entre las dos olores y pasa tiempos comparables con 2-MB ácido y agua (8 t = 2,2, p = 0,6) (Figura 3B). En general, la comparación de la respuesta de evitación los tres grupos no se muestran un comportamiento diferente significativa (F 2, 9 = 0,76, p = 0,49) como resultado no hay interacción entre el tratamiento y el genotipo (F 1, 2 = 0,52, p = 0.63). En la prueba de sensibilidad olfativa a la orina femenina, la curva muestra la preferencia a la orina a diferentes concentraciones frente a agua (Preferencia index = tiempo pasado con la orina sustraído por el tiempo que pasa con el agua). En ªes de prueba, se observa que el grupo control A tiene un umbral de atracción a la orina a una dilución de 1: 1000 y muestra el aumento de la atracción a la orina con concentraciones crecientes. Grupo B y C muestran un 100 veces mayor umbral a la atracción (1:10) en comparación con el grupo A (2,9 F = 4,78, p <0,05). Grupo B y C de visualización curvas de sensibilidad comparables (F 1,19 = 0,36, p = 0,55). Comparando la sensibilidad entre los grupos, parece que el grupo A tiene mayor sensibilidad a la orina femenina en comparación con el grupo B y C (F 2,19 = 7,12, p <0,01) (Figura 4). 
Figura 1: Representación de la configuración utilizada para realizar las pruebas olfativas. (A) de la cámara por encima de la jaula. (B) Los ratones se colocan en una jaula para un período de habituación 5 minutos. (C) El odorantes se pipetean en la pared de la jaula. (D) La actividad exploratoria de un odorante comparación con el agua se pone a prueba en una ventana 2 min. 
Figura 2:.. De flujo de trabajo de procesamiento de vídeo asistida por ordenador mediante comandos de macros en ImageJ El ejemplo se refiere a un ratón del grupo A se expone a la orina a una dilución 1:10 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3:. Los resultados representativos de las pruebas de preferencia y de evitación olfativas Los ratones de los tres grupos (n = 5 para el grupo A, n = 4 para el grupo B y n = 5 para el grupo C) se han expuesto a (A) de maní, peroter y ácido (B) 2-MB para una sesión de exploración de 2 min. Se representa el tiempo total de explorar el olor (círculos negros) frente a agua (círculos grises). Las diferencias significativas en el comportamiento olfativo entre los grupos se indican mediante barras horizontales negras y asteriscos. Diferencias significativas en los tiempos entre el olor y el agua dentro de los grupos olfateando se muestran por bares y asteriscos horizontales grises. * P <0,05, ** P <0,01, *** p <0,01 (barras horizontales grises, la prueba t de Student; barra horizontal negro, un modelo lineal). Las barras de error son los errores estándar de la media (SEM). 
Figura 4:. Los resultados representativos de las pruebas de sensibilidad a concentraciones crecientes de orina femenina La curva de índice de preferencia, propuesta por el tiempo de exploración con orina a diferentes concentraciones restados por el tiempo que pasa con el agua, muestra que el grupoA (n = 5) tiene la mayor sensibilidad a la orina en comparación con el grupo B (n = 4) y C (n = 5). * P <0,05 (barras horizontales negras, ANOVA de una vía). Las barras de error son SEM.
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Discussion
Las pruebas que se proponen en este protocolo permiten evaluar diferentes aspectos del comportamiento olfativo innata en ratones: la percepción de los olores, la discriminación entre los olores frente a agua y la sensibilidad a los olores. Este protocolo se puede aplicar a cualquier olor de acuerdo con la preferencia y la escala de evitación previamente demostrado 15. Dado que el protocolo se basa en la actividad exploratoria es importante que los ratones no muestran ningún deterioro motor o la ansiedad que puede afectar su movimiento e interferir con la exploración olfativa. Las pruebas descritas están destinadas a ratones macho adulto sin embargo se pueden adaptar para investigar el olfato también en hembras adultas o ratones de edad.
Antes de comenzar un estudio de investigación de la olfacción como en ratones, es importante prestar atención a los siguientes aspectos: 1) realizar cada prueba en un intervalo de al menos 3 días. Evitar debe ser probado en último para minimizar la interferencia de la memoria olfativa 20; 2) realizar el correoxperimentos al mismo momento del día, de preferencia en la tarde, cuando los ratones se encuentran en su ciclo activo 21 y utilizan una fuente de la luz tenue. Además, la programación de la prueba olfativa a veces los controles definidos para los posibles cambios circadianos en funciones olfativas 22; 3) antes de comenzar la prueba de evitación, que utiliza odorantes repelentes, tales como ácidos, traer una jaula en el tiempo en la suite experimental y mantener la jaula bajo una campana laminar. Este paso es importante para evitar la habituación a la odorante y obtener una respuesta más homogénea en el mismo grupo; 4) separar temporalmente los ratones que se han probado hasta que todos los ratones de la misma jaula están expuestos a la sustancia odorífera, para minimizar la contaminación odorante; 5) utilizar animales de la misma cepa, ya que diferentes cepas pueden comportarse de una manera heterogénea cuando se expone a un odorante 23; 6) el experimentador debe usar una bata de laboratorio en todo momento y cambiar los guantes entre los animales para evitar el olor de mezcla; 7)Después de pipetear el operador debe moverse lentamente lejos de la jaula a una distancia de 1,3 metros para evitar cualquier confusión estimulación a los ratones durante la exploración olfatorio; 8) los ratones que muestran valores de gris medias sólo en una de las cámaras deben ser excluidos del estudio, ya que se espera que los ratones para explorar ambas cámaras en diferentes grados.
El método descrito ofrece varias ventajas sobre otros protocolos: es muy fácil de configurar, utiliza materiales de bajo costo, es de finalización rápido y se aprovecha de software de código abierto, como ImageJ. Además, proporcionamos macros están listos para ser instalados y que pueden ser utilizados, a medida y adaptarse a cualquier escenario y más de 2 perímetros de olor. Se ha de señalar que sólo el tiempo pasado en el olor perímetro asignado es una medida de la actividad olfativa. Considerando que el tiempo empleado en cada cámara da una lectura de la actividad exploratoria del ratón y es sólo una estimación aproximada del comportamiento olfativo. Al igual que con otros métodos, el poder estadístico puede ser adquirida por el aumento del número de animales por grupo.
En comparación con la prueba olfativa usando olfatómetros, que puede controlar automáticamente por presión de vapor y el tiempo de entrega 12 - 14, el protocolo propuesto está menos controlada. Sin embargo, todos los olores se aplican en volúmenes iguales, a una distancia definida y por la misma ventana de tiempo. Por lo tanto, manteniendo estas variables constante, en esta prueba de un olfatómetro no es necesario. Hay otra limitación potencial de este protocolo que consiste en el tiempo requerido para el ajuste y el corte de cada vídeo para obtener un número fijo de tramas. Sin embargo, el mismo análisis asistido por ordenador se puede utilizar también en configuraciones más sofisticadas con los puertos de olor entregar el olor en momentos específicos. En este caso, el corte de vídeo se podría establecer de forma automática.
En comparación con otros protocolos que utilizan almohadillas de algodón impregnated con olor para probar la atracción y la evitación, el presente protocolo proporciona una información adicional sobre la discriminación olfativa entre una novela olor y un olor neutro (agua) 15,16 en una sola sesión experimental. Por otra parte, el protocolo no requiere cegamiento experimental y puede ser completamente realizado por un solo investigador mediante el análisis asistido por ordenador imparcial.
Estas pruebas simples se pueden utilizar para controlar la progresión de los déficits neuronales en modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer o de Parkinson y para investigar los mecanismos de transmisión olfativo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Italplast (Italy) | 1144B | 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height |
| Chipped wood bedding | Abedd (Austria) | LTE E-001 | 3 cm high |
| Peanut butter | Migros (Switzerland) | NA | 1:10 |
| 2-Methylbutyric | Sigma Aldrich (Switzerland) | W269514 | Pure |
| Female urine from fertile females of same mouse strain | NA | NA | Dilution series |
| Camera | Olympus (US) | Camedia C-8080 | MOV files |
| Quicktime for Java (Windows) | Apple (USA) | NA | video plugin for visualizing MOV files |
| ImageJ for Windows | NIH (USA) | NA | Video Processing/Analysis |
References
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