Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Le proprietà meccaniche e composizione della matrice extracellulare sono molto variabili tra i tipi di tessuto. Questo connettivo diversità stroma del tessuto notevolmente comportamento impatti cella per regolare i processi normali e patologiche tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la segnalazione di adesione e la migrazione direzionale. A questo proposito, la capacità innata di certi tipi di cellule a migrare verso un substrato matrice rigida, o meno compatibile è indicato come durotaxis. Questo fenomeno ha un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l'invasione delle cellule tumorali. Qui, descriviamo un test semplice per studiare durotaxis, in vitro, utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) substrati. Preparazione del descritto durotaxis camere crea un'interfaccia tra la rigidità relativamente morbido gel PDMS e un vetrino di vetro rigida. Nell'esempio fornito, abbiamo usato queste durotaxis alloggiamenti per dimostrare un ruolo per il Cdc42 / Rac1 GTPasi prote attivazionein, cdGAP, in mechanosensing e durotaxis regolazione nelle cellule umane U2OS osteosarcoma. Questo test è facilmente adattabile ad altri tipi e / o atterramento di altre proteine di interesse cellulari per esplorare i loro rispettivi ruoli nel mechanosignaling e durotaxis.
La matrice extracellulare (ECM) è costituito da una serie complessa di proteine strutturali e reticolazione compreso collagene, fibronectina e laminina. Anche se è noto che l'ECM fornisce un importante supporto strutturale per tessuti cellulari, ci sono sempre più prove per indicare che le cellule rispondono attivamente ai cambiamenti fisici nel loro ambiente ECM per regolare i processi cellulari diversi, tra cui la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la migrazione delle cellule. Ad esempio, le differenze nella rigidità della ECM può guidare le cellule staminali mesenchimali verso differenti linee, con i substrati molli (~ 1 kPa) promuovono lignaggi neurogene mentre rigidi (~ 25 kPa) substrati di promuovere la differenziazione osteogenica 1. Analogamente, un aumento della rigidità matrice stromale ha dimostrato di promuovere la tumorigenesi mammaria cellule epiteliali ed invasione nel 2,3 tessuto circostante.
Un aspetto particolarmente interessante di questo mechanosignrisultati dell'attività aling in un processo noto come durotaxis, in cui le cellule migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido 4,5. Le cellule rilevano costantemente le caratteristiche fisiche del loro ambiente extracellulare attraverso recettore integrina legame alla ECM. Questo, a sua volta, promuove l'accumulo di numerose proteine strutturali e segnalazione ai loro domini citoplasmatici per guidare la formazione di strutture adesive note come adesioni focali o contatti focali 6,7. Dal momento che le integrine non hanno attività enzimatica intrinseca, i segnali vengono inoltrati dal ECM attraverso queste proteine accessorie per coordinare la risposta delle cellule al loro ambiente mutevole 8. Di conseguenza, l'identificazione e la caratterizzazione delle proteine chiave coinvolte nella regolazione mechanosignaling e durotaxis è un'importante area di ricerca.
Vari sistemi modello sono stati sviluppati per studiare durotaxis in vitro, ma la maggior parte hannoutilizzati collagene rivestite poliacrilammide substrati 4. Tuttavia, la preparazione dei substrati di poliacrilammide può essere tecnicamente impegnativo e il collagene utilizzato in questi saggi deve essere chimicamente reticolato al substrato 9. Polidimetilsilossano (PDMS) substrati hanno dimostrato di presentare proprietà meccaniche paragonabili ai substrati di poliacrilammide 10. Tuttavia, substrati PDMS vengono preparate semplicemente miscelando un rapporto della base di reticolante e questi substrati possono essere rivestiti con proteine ECM senza la necessità di reticolazione chimica, rendendo così più facile PDMS uno strumento per studiare gli effetti di rigidità sul comportamento cellulare. Qui, si descrive come preparare una semplice camera di durotaxis in cui un substrato morbido PDMS è integrato con un coprioggetto vetro rigido.
Il saggio, come indicato di seguito, fornisce un metodo rapido e semplice per lo studio durotaxis. Per questo studio abbiamo utilizzato cellule di osteosarcoma U2OS umane combinate con siRNA-mediataatterramento di cdGAP per studiare il ruolo di questa proteina di adesione focale durotaxis 11. È importante sottolineare che questo protocollo può essere facilmente adattato alle esigenze individuali. Altri tipi cellulari possono essere sostituiti per le cellule U2OS e qualsiasi proteina possono essere abbassati o overexpressed per determinare gli effetti sul comportamento cellulare durante durotaxis. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per incorporare le proteine fluorescenti tag per analizzare le loro dinamiche e comportamento utilizzando FRAP o preoccuparsi approcci.
Qui descriviamo un semplice test per studiare durotaxis in migrazione delle cellule. Un punto di forza di questo saggio è la facilità di preparazione delle camere durotaxis con PDMS. La rigidità dei substrati può essere facilmente manipolata modificando il rapporto di soluzione di base PDMS a reticolante per consentire lo studio di varie rigidità nel test. Tuttavia, una potenziale limitazione del sistema è che le cellule sono esposte a un solo cambiamento di rigidità del substrato rispetto a sperimentare un gradi…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è sostenuto da NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1.334.493 di CET. Ringraziamo i membri del laboratorio Turner per la lettura critica del manoscritto. Tutti i dati riportati nella presente relazione sono stati riprodotti da permesso da Wormer et al. 2014 11.
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
#1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
6-well plate | Celltreat | 229106 | |
DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
U2OS cells | ATCC | HTB-96 |