Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis doi: 10.3791/52949 Published: August 27, 2015

Abstract

تكوين والميكانيكية خصائص المصفوفة خارج الخلية تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة. هذا الضام سدى النسيج التنوع إلى حد كبير سلوك الخلية الآثار لتنظيم عمليات طبيعية ومرضية بما في ذلك تكاثر الخلايا، والتمايز، التصاق الإشارات والهجرة الاتجاه. في هذا الصدد، والقدرة الفطرية لبعض أنواع الخلايا إلى الهجرة نحو أشد، أو أقل المتوافقة ويشار إلى durotaxis الركيزة المصفوفة. هذه الظاهرة تلعب دورا مهما أثناء التطور الجنيني وإصلاح الجرح وغزو الخلايا السرطانية. هنا، نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis، في المختبر، وذلك باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز. إعداد وصف durotaxis غرف يخلق واجهة صلابة بين هلام PDMS لينة نسبيا وساترة الزجاج جامدة. في المثال المقدمة، وقد استخدمنا هذه durotaxis غرف لإثبات دور للcdc42 / RAC1 GTPase تفعيل المتواجدفي، cdGAP، في mechanosensing وdurotaxis التنظيم في خلايا عظمية U2OS الإنسان. هذا الاختبار هو قابلية للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى و / أو ضربة قاضية للبروتينات أخرى من المصالح لاستكشاف دور كل منهما في mechanosignaling وdurotaxis.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وتتألف المصفوفة خارج الخلية (ECM) من مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية ويشابك بما في ذلك الكولاجين، فبرونيكتين و laminin. على الرغم من أنها راسخة بأن ECM يوفر الدعم الهيكلي المهم لأنسجة الخلوية، وهناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تستجيب بشكل فعال للتغيرات الفيزيائية في البيئة ECM لتنظيم العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك بقاء الخلية، التمايز والهجرة الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن الاختلافات في صلابة ECM تدفع الخلايا الجذعية الوسيطة نحو الأنساب مختلفة، مع ركائز لينة (~ 1 كيلو باسكال) تعزيز الأنساب العصبية بينما شديدة (~ 25 كيلو باسكال) ركائز تعزيز التمايز عظمي المنشأ 1. وبالمثل، قد أظهرت زيادة في صلابة انسجة مصفوفة لتعزيز الثدي تكون الأورام الخلايا الظهارية والغزو إلى 2،3 الأنسجة المحيطة بها.

مما يثير الاهتمام في هذا mechanosignنتائج النشاط aling في عملية تعرف باسم durotaxis، التي تهاجر الخلايا بشكل تفضيلي نحو الركيزة أكثر جمودا 4،5. الخلايا تستشعر باستمرار الخصائص الفيزيائية للبيئتهم خارج الخلية من خلال إنتغرين مستقبلات ملزمة لECM. وهذا، بدوره، ويشجع على تراكم العديد من البروتينات الهيكلية ويشير إلى المجالات الخاصة بهم حشوية لدفع تشكيل هياكل لاصقة المعروفة باسم التصاقات تنسيق أو اتصالات التنسيق 6،7. منذ integrins ليس لها النشاط الأنزيمي الأصيل، يتم ترحيل الإشارات من ECM من خلال هذه البروتينات التبعي لتنسيق استجابة الخلية لتغيير بيئتهم 8. وفقا لذلك، وتحديد وتوصيف البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم mechanosignaling وdurotaxis هو مجال هام من مجالات التحقيق.

وقد تم تطوير نظم نموذج مختلف لدراسة durotaxis في المختبر، ولكن معظم لديهاتستخدم المغلفة الكولاجين ركائز بولي أكريلاميد 4. ومع ذلك، فإن إعداد ركائز بولي أكريلاميد يمكن أن يكون تحديا فنيا ويجب أن يكون الكولاجين المستخدمة في هذه المقايسات crosslinked كيميائيا لالركيزة 9. وقد ثبت Polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز لعرض خصائص ميكانيكية مشابهة لركائز بولي أكريلاميد 10. ومع ذلك، يتم ببساطة عن طريق خلط نسبة من القاعدة إلى crosslinker إعداد ركائز PDMS ويمكن أن تطلى هذه ركائز مع بروتينات ECM دون الحاجة إلى يشابك الكيميائي، مما يجعل PDMS أداة أسهل لدراسة آثار صلابة على سلوك الخلية. هنا، نحن تصف كيفية إعداد غرفة durotaxis بسيطة التي تم دمج PDMS الركيزة لينة مع ساترة الزجاج جامدة.

الفحص، على النحو المبين أدناه، يوفر طريقة سريعة وبسيطة لدراسة durotaxis. لهذه الدراسة استخدمنا خلايا عظمية U2OS الإنسان جنبا إلى جنب مع سيرنا بوساطةضربة قاضية من cdGAP لدراسة دور هذا البروتين التصاق التنسيق في durotaxis 11. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لتلبية الاحتياجات الفردية. قد تكون بديلا أنواع الخلايا الأخرى للخلايا U2OS ويمكن طرقت أي بروتين أسفل أو overexpressed لتحديد الآثار المترتبة على سلوك الخلية أثناء durotaxis. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لإدراج البروتينات الموسومة fluorescently لتحليل ديناميتها والسلوك باستخدام FRAP أو الحنق النهج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد Durotaxis الدوائر

  1. لإعداد احدة 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة، الفارغة التوازن مع أنبوب مخروطي 50 مل. تزن بها حوالي 10 غرام من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 50 مل (الحل هو لزج جدا).
  2. ل90: 1 الركيزة (الامتثال لل~ 1 كيلو باسكال)، تقسيم الوزن يقاس من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 90 لتحديد المبلغ الصحيح من حل crosslinker الحاجة. إضافة كمية محسوبة من الحل crosslinker PDMS إلى نفس الأنبوب.
    مثال: 10 جم / 90 = 0.11 غرام. إضافة 0.11 غرام من حل crosslinker PDMS إلى حل قاعدة PDMS.
    كلاهما قدم قاعدة وcrosslinker الحلول في عدة PDMS: ملاحظة.
  3. مزيج بقوة PDMS خليط قاعدة / crosslinker لمدة 5 دقائق على RT باستخدام ملعقة صغيرة. في هذه المرحلة سوف تحتوي على خليط عدد كبير من فقاعات الهواء.
  4. أجهزة الطرد المركزي الركيزة PDMS في جهاز للطرد المركزي الفوق لمدة 5 دقائق في 50 x ج في RT لإزالة صغيريBLES. إذا لا يزال هناك فقاعات بعد 5 دقائق، الطرد المركزي مرة أخرى.
  5. ماصة 1 مل 90: 1 PDMS الركيزة في كل بئر من زراعة الأنسجة المعالجة لوحة 6 جيدا. كل ما تبقى من فقاعات الهواء الموجودة في PDMS يمكن القضاء عليها في هذه المرحلة التي ظهرت عليها باستخدام إبرة 21 G. السماح للPDMS لنشر لمدة 30 دقيقة في البئر.
  6. يغلي 12 ملم الزجاج # 1 coverslips في الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر مرتين وتخزين لل coverslips في الماء المقطر.
  7. مكان واحد، ساترة المجففة في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة عن طريق لمس بلطف جانب واحد من ساترة في حل PDMS ثم إسقاط ساترة على PDMS. كما يستقر ساترة، وسوف تبدأ PDMS للانقضاض على حواف ساترة، ولكن لن تغطي بالكامل. وهذا يولد التفاعل بين PDMS والزجاج بعد المعالجة (انظر الشكل 1A، B).
  8. احتضان لوحة عند 70 درجة مئوية في الفرن لمدة 16 ساعة لعلاج (تصلب) وPDMS. وضع بلاته في غطاء خلية ثقافة والأشعة فوق البنفسجية تعقيم لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: فمن الأفضل أن تجعل من لوحات داخل بضعة أيام من الاستخدام. ومع ذلك، قد تكون ملفوفة لوحات في Parafilm دون أي العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع من دون أي انخفاض ملحوظ في الجودة.

2. خلية التصفيحات

ملاحظة: إذا كان دراسة تأثير بوساطة سيرنا ضربة قاضية، نفذ ضربة قاضية باستخدام إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول الأمثل لنوع من الخلايا في الاختيار.

  1. معطف كل durotaxis الغرفة مع 1 مل من 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك، فبرونيكتين يمكن تطبيقها اليوم قبل التحليل التي يحتضنها PDMS مع 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية. تأكد من المغمورة كامل السطح في فبرونيكتين في حل PBS.
  2. تحضير للحرارة التشويه والتحريف 1٪ BSA. تزن 0.5 غرام BSA وحله في 50 مل من برنامج تلفزيوني.فلتر تعقيم الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون والحرارة على 80 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
    ملاحظة: يعد هذا الحل اليوم قبل الخلية الطلاء وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. نضح حل فبرونيكتين ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من التشويه والتحريف الحرارة BSA في برنامج تلفزيوني على كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
  4. ويعرض للتريبسين عدد الخلايا في الاختيار بينما الدوائر durotaxis يتم حظر مع الحرارة التشويه والتحريف BSA.
  5. لوحة 1 × 10 5 الخلايا في حجم 2 مل في كل بئر من غرفة durotaxis، وذلك باستخدام وسائل الإعلام المطلوبة لنوع خلية معينة في الاختيار. السماح للخلايا الالتزام وتنتشر على الركيزة لمدة 4 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    تتم المحافظة على الخلايا U2OS بشكل روتيني في DMEM مع 10٪ FBS، على أن تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 10 وحدة دولية / مل البنسلين، 10 ميكروغرام / مل الستربتومايسين: ملاحظة.
    ملاحظة: عدد الخلايا المستخدمة في هذا المثال هو الأمثل لخلايا U2OS. قد تكون هناك حاجة الأمثل لأنواع الخلايا الأخرى. هذه الكثافة يعطي الخلايا مساحة كافية للهجرة دون تفاعلات كبيرة مع الخلايا الأخرى.

التصوير 3. تعيش خلية

  1. أداء تصوير الخلايا الحية على مجهر مقلوب، وذلك باستخدام النقيض من المرحلة مع الهدف 10X. ينبغي تركيب المجهر مع، غرفة ترطيب البيئة المغلقة، والسماح السيطرة على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ خلال التصوير على المدى الطويل.
  2. بعد انتشار الخلايا لمدة ما يقرب من 3.5 ساعة، تجميع لوحة في غرفة المجهر. السماح للعينة (ق) للتوازن في الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. إعداد الآلية، متعددة نقطة الزائر على المجهر إن وجدت. التركيز على واجهة بين 90: 1 PDMS وساترة الزجاج واختيار نقاط لصورة في كل مكان واجهة بمتوسط ​​40 نقطة في durotaxis الغرفة. صورة الخلايا كل 10 دقيقة لمدة تصل إلى 16 ساعة.
    ملاحظة: إعادةسوف جيون من الفائدة تظهر كما سطرين، مع الخط الخارجي المقابل لحافة ساترة والخط الداخلي المقابلة إلى واجهة الفعلية بين PDMS وساترة. انظر الشكل 1B.

تحليل 4. البيانات

  1. توليد جدول بيانات كما في الجدول 1.
  2. عد عدد من الأحداث المعبر من PDMS على سطح الزجاج، والعكس بالعكس من كل فيلم ولدت. تسجيل عدد من الأحداث معبر في العمود المناسب في جداول اكسل.
    ملاحظة: يتم تعريف الحدث المعبر باعتباره نواة الخلية تمر عبر الحدود بين PDMS والزجاج في أي من الاتجاهين.
  3. لتحديد المعابر متعددة، حساب عدد المرات الخلية عبرت الواجهة. يجب تسجيل هذا الرقم في العمود التفوق الموافق الركيزة التي كانت تقع الخلية في نهاية الفيلم. تكرار التحليل لكل خلية التي تعبر واجهة في تيانه الفيلم. استبعاد الخلايا التي تهاجر من مجال الرؤية أثناء التصوير.
    ملاحظة: من المهم أيضا للتحقق، من قبل خلية العد في بداية التجربة، أن الخلايا قادرة على الالتزام بالتساوي على PDMS المغلفة فبرونيكتين والواجهات الزجاجية ساترة.
  4. حساب النسبة المئوية للخلايا التي هاجرت من PDMS على سطح الزجاج (أي خضع durotaxis). إضافة عدد من عبور الأحداث من الصعب على لينة وأحداث معبر المتعددة التي انتهت يوم بجد والقسمة على العدد الإجمالي للأحداث المعبر.
  5. حساب النسبة المئوية للمعابر متعددة بقسمة عدد من المعابر متعددة من قبل عدد من المعابر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد التخطيطي للغرفة durotaxis في الشكل 1A. لينة PDMS الركيزة: ينتشر (90 خليط 1 من قاعدة PDMS إلى crosslinker الحلول) في صحن 6 جيدا ويوضع ساترة الزجاج على رأس PDMS، الذي ثم يغطي جزئيا السطح العلوي للساترة، وبالتالي خلق واجهة بين اثنين من ركائز الامتثال مختلفة. صلابة من PDMS الركيزة الناعمة ~ 1 كيلو باسكال، وهو مشابه إلى الامتثال نموذجية من أنسجة المخ، في حين أن صلابة من الزجاج حوالي 1-2 جيغا 1. ويظهر صورة النقيض من المرحلة واجهة بين PDMS والزجاج من السهام البيضاء في الشكل 1B. العلامات النجمية تدل على خليتين تحكم رني المهاجرة نحو الركيزة أصعب. حافة خشنة والتي يمكن مشاهدتها (السهم الأسود) يتوافق مع حافة ساترة.

لتحديد البيانات، يجب أن تتولد جدول بيانات Microsoft Excel كما في الجدول 1 </ قوي>. ينبغي أن يحسب عدد الأحداث المعبر ونظمت في العمود المقابل. بعض الأفلام المتولدة لا يمكن استخدامها لتقدير. فيلم قد يكون تم حذفها من تقدير ما إذا كان هناك فقاعة في PDMS الذي يتداخل مع تقدم الخلايا أو إذا كانت معبأة في خلايا كثيفة جدا، مما أدى إلى اصطدام التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير الاتجاهية الخلية. وينبغي أيضا أن تراقب الانقسام الخلوي، وهذا يمكن أن تؤثر أيضا بشكل علني حركة الخلية.

عادة، سوف أنواع الخلايا الأكثر تمسكا تهاجر نحو تفضيلي ركيزة أشد 2،4،12. لنبدأ في فهم الآلية الجزيئية التي الخلايا تستجيب للمنبهات الميكانيكية في بيئتهم، ويمكن طرقت بروتينات معينة أسفل باستخدام سيرنا. في مثالنا، حوالي 70٪ من الخلايا المعالجة سيرنا السيطرة أظهرت durotaxis 2A الشكل. في تناقض صارخ، عندما كان يطرق cdGAP أسفل باستخدام رني، كانت الخلايا لا تفضيلعلى ما إذا كانت هاجر على الركيزة الشكل أو القوة الناعمة 2A. وعلاوة على ذلك، عبرت خلايا ضربة قاضية cdGAP الحدود عدة مرات، في حين تحكم سيرنا الخلايا المعالجة عموما عبروا فقط الحدود مرة واحدة، الشكل 2B. المسارات التمثيلية للخلايا سيرنا السيطرة تبين أن الخلايا تهاجر عادة عبر الحدود مرة واحدة وبشكل تفضيلي بقي على السطح أكثر جمودا بالمقارنة مع خلايا cdGAP سيرنا المعاملة التي لم تثبت أفضلية لأي صلابة وعبرت الحدود عدة مرات الشكل 2C.

الشكل 1
ينتشر الشكل 1. تخطيطي للغرفة Durotaxis اقامة. (A) لينة PDMS في كل بئر من صحن 6 جيدا ويوضع ساترة الزجاج على رأس PDMS. سوف PDMS يتعدى على جانبي الجزء العلوي من ساترة، فرنكاخام أنه يصلب، لتشكيل حلقة وصل بين ركائز اثنين. يتم تحديد Durotaxis بتسجيله يكون الاتجاه من الخلايا عبور اجهة PDMS / الزجاج. (B) المرحلة التمثيلية النقيض من الصورة تظهر واجهة بين PDMS لينة وصلبة الركيزة الزجاج. تظهر العلامات النجمية مراقبة المعالجة رني خلايا U2OS تمر durotaxis. والسهام البيضاء للدلالة على واجهة بين PDMS والزجاج ساترة والسهم يشير إلى حافة ساترة الزجاج تحت PDMS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1. تخطيطي من مايكروسوفت إكسل اقامة. يتم وضع أعمدة لتشمل عددا الفيلم، سيرنا المستخدمة، عدد الخلايا التي هاجرت من PDMS الناعمةلجامدة الركيزة الزجاج أو العكس بالعكس، وكذلك العدد الكلي للخلايا تحليلها. يتم تعيين الأعمدة أيضا للخلايا التي تعبر واجهة عدة مرات ووضع حد سواء على PDMS لينة أو الركيزة الزجاج. إذا يهاجر خلية عبر الحدود عدة مرات، يتم تسجيل عدد من الأحداث معبر متعددة من هذه الخلايا في العمود الركيزة التي تقوم عليها كانت تقع الخلية في نهاية الفيلم.

الرقم 2
الشكل 2. ضربة قاضية من cdGAP في خلايا U2OS يؤدي إلى فقدان durotaxis. (A) خلايا تحكم سيرنا تعامل تهاجر بشكل تفضيلي على الركيزة الزجاج جامدة، في حين cdGAP سيرنا الخلايا المعالجة لم تظهر أي تفضيل. (B) تحكم سيرنا الخلايا المعالجة عبرت الحدود بين PDMS والزجاج مرة واحدة. ومع ذلك، هاجرت خلايا cdGAP رني المعاملة ذهابا وإيابا عبر بoundary عدة مرات. (C) مسارات الخلايا تمثيلية تعامل مع أي رقابة، أو تم إنشاؤها cdGAP سيرنا باستخدام دليل تتبع المساعد في يماغيج. تم تحديد القيم ف باستخدام اختبار (ت) طالب والأخطاء القضبان تمثل فاصل الثقة 95٪. مستنسخة بإذن من رمر وآخرون. 2014 11. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis في الخلايا المهاجرة. A القوة الرئيسية من هذا الاختبار هو سهولة إعداد غرف durotaxis باستخدام PDMS. صلابة من ركائز يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير نسبة PDMS حل قاعدة لcrosslinker للسماح للدراسة الجمود المختلفة في الفحص. ومع ذلك، واحدة الحد المحتمل من هذا النظام هو أن الخلايا تتعرض فقط لتغيير واحد في صلابة الركيزة بدلا من تعاني من الانحدار الصلابة التي يتم توفيرها من قبل أنظمة أكثر تطورا 4. الأهم من ذلك، على عكس ركائز بولي أكريلاميد، مكونات ECM لا يجب أن يكون كيميائيا عبر ربطها PDMS. في الواقع، وطلاء فبرونيكتين ما يعادل تقريبا على كل من PDMS والواجهات الزجاجية، على النحو الذي يحدده تلطيخ مع الأجسام المضادة المحددة لفبرونيكتين 11. منذ وقد أظهرت دراسات سابقة أن الخلايا تتصرف نفسه على أي PDMS أو ركائز بولي أكريلاميد، واستخدام سو PDMS ركائز تقدم نموذجا أسهل كثيرا لدراسة mechanotransduction في الخلايا 10،12.

أهم خطوة في إعداد ركائز PDMS هو التأكد من أن القاعدة والحلول crosslinker خلطا جيدا. إذا لم تكن مختلطة جيدا بما فيه الكفاية، ثم سوف ركائز لا يشفي تماما على المعالجة الحرارية. وهذا يؤدي إلى ساترة غرق بعيدا جدا في PDMS أو ساترة الانجراف في PDMS أثناء التصوير. إذا كانت القوة الطرد المركزي عالية جدا، قد قاعدة وcrosslinker حلول فصل في أنبوب. هذه يمكن معالجتها عن طريق الحد من سرعة الطرد المركزي أو التفريغ الخليط لمدة 30 دقيقة باستخدام فراغ الغرفة. وأخيرا، كثافة الخلية أمر بالغ الأهمية، كما العديد من الخلايا سوف تؤثر قدرتها على الانتقال بشكل كامل ودون عوائق durotax عن طريق الاتصال مع الخلايا المجاورة. تم تحسين كثافة ذكرت هنا للخلايا U2OS. ومع ذلك، إذا تم استخدام أنواع الخلايا الأخرى، سل الأمثلوالأرقام ل يجب أن تحدد تجريبيا.

لقد استخدمت مؤخرا هذا الاختبار لدراسة كيفية التصاق التنسيق يشير البروتين cdGAP ينظم mechanosensing وdurotaxis 11. ومن الواضح أن هناك العديد من المكونات الخلوية بالإضافة إلى الالتصاقات البؤرية، مثل عناصر هيكل الخلية، مكونات الاتجار البروتين والقنوات الأيونية التي تشارك في الإشارات الميكانيكية، وبالتالي يمكن أن تسهم أيضا في تنظيم durotaxis 13-15. كل من هذه المكونات يمكن تقييمها بسهولة في نظامنا باستخدام نهج رني مماثلة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار هو قابل للغاية لإدخال مجموعة مختلفة من المنشطات الدوائية أو مثبطات. ويمكن أيضا فحص تكييفها للسماح أشكال أكثر تطورا من تحليل مثل إدراج البروتينات fluorescently الموسومة، بالاشتراك مع الحنق أو FRAP النهج، لدراسة ديناميات البروتين وتفعيل المكانية والزمانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 GM47607، CA163296 وNSF 1334493 لCET. نشكر أعضاء المختبر تيرنر لقراءة نقدية للمخطوطة. استنسخت كل البيانات الواردة في هذا التقرير بإذن من رمر وآخرون. 2014 11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 3097358-1004 Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm Fisher Scientific 12-545-82
6-well plate Celltreat 229106
DMEM Cellgro 15-017-CM
L-Glutamine Cellgro 25-005-CI
Sodium Pyruvate Fisher Scientific BP356-100
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
Fibronectin BD Biosciences 610077
PBS Invitrogen 21600-044
Falcon tubes Celltreat 229456
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Bovine Serum Albumin Sigma A7906
U2OS cells ATCC HTB-96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  3. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, (5), 891-906 (2009).
  4. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, (1), 144-152 (2000).
  5. Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25, (5), 619-626 (2013).
  6. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88, (1), 39-48 (1997).
  7. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3, (5), 466-472 (2001).
  8. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124, (8), 1195-1205 (2011).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  10. Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13, (12), 1457-1465 (2011).
  11. Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9, (3), e91815 (2014).
  12. Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (18), 6933-6938 (2012).
  13. Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21, (1), 35-47 (2011).
  14. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117, (12), 2449-2460 (2004).
  15. Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9, (3), 351-363 (2005).
نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. J. Vis. Exp. (102), e52949, doi:10.3791/52949 (2015).More

Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. J. Vis. Exp. (102), e52949, doi:10.3791/52949 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter