En forenklet system for Evaluering Cell Mechanosensing og Durotaxis<em> In vitro</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
Sammensætningen og mekaniske egenskaber af den ekstracellulære matrix er meget varierende mellem vævstyper. Denne bindevæv stroma diversitet i høj grad konsekvenser celle adfærd til at regulere normale og patologiske processer, herunder celledeling, differentiering, vedhæftning signalering og retningsbestemt migration. I denne henseende er det medfødte evne af visse celletyper migrerer mod et stivere, eller mindre kompatibel matrix omtales som durotaxis substrat. Dette fænomen spiller en vigtig rolle under fosterudviklingen, sårheling og cancer cell invasion. Her beskriver vi en enkel assay at studere durotaxis in vitro ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) substrater. Fremstilling af den beskrevne durotaxis kamre skaber en stivhed grænseflade mellem relativt blødt PDMS gel og en stiv dækglas. I eksemplet forudsat, har vi brugt disse durotaxis kamre til at demonstrere en rolle for cdc42 / Rac1 GTPase aktiverende protei, cdGAP, i mechanosensing og durotaxis regulering i humane U2OS osteosarcomceller. Denne analyse er let tilpasses til andre celletyper og / eller knockdown af andre proteiner af interesse til at udforske deres respektive roller i mechanosignaling og durotaxis.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) består af en kompleks række af strukturelle og tværbindingsmidler proteiner, herunder kollagen, fibronectin og laminin. Selv om det vel er fastslået, at ECM indeholder vigtige strukturstøtte til cellulære væv, er der stigende tegn på, at cellerne reagerer aktivt til fysiske ændringer i deres ECM miljø til at regulere diverse cellulære processer, herunder celle overlevelse, differentiering og celle migration. For eksempel kan forskelle i stivhed ECM køre mesenkymale stamceller mod forskellige afstamninger, med bløde substrater (~ 1 kPa) fremme neurogene slægter mens stive (~ 25 kPa) substrater fremme osteogen differentiering 1. Ligeledes er en stigning i det stromale matrix stivhed vist sig at fremme mamma epitelcelle tumorigenese og invasion i det omgivende væv 2,3.
Et særligt interessant aspekt af denne mechanosignAling aktivitet medfører en proces kendt som durotaxis, hvor celler migrerer fortrinsvis mod en mere stiv substrat 4,5. Celler fornemmer konstant de fysiske egenskaber af deres ekstracellulære miljø gennem integrin receptor binding til ECM. Dette på sin side fremmer akkumulering af talrige strukturelle og signalproteiner til deres cytoplasmatiske domæner fremme dannelsen af klæbende strukturer kendt som fokale adhæsioner eller fokale kontakter 6,7. Da integriner har ingen iboende enzymatisk aktivitet, er signaler videreformidles fra ECM gennem disse accessoriske proteiner for at koordinere cellens reaktion på deres skiftende miljø 8. Derfor identifikation og karakterisering af de centrale proteiner involveret i reguleringen mechanosignaling og durotaxis er et vigtigt område for undersøgelse.
Forskellige modelsystemer er blevet udviklet til at studere durotaxis in vitro, men de fleste harudnyttede collagen-coatede polyacrylamid substrater 4. Fremstilling af polyacrylamid substrater, kan imidlertid være teknisk udfordrende og collagen anvendes i disse assays skal være kemisk tværbundet til substratet 9. Polydimethylsiloxan (PDMS) substrater har vist sig at udvise sammenlignelige mekaniske egenskaber til polyacrylamid substrater 10. Imidlertid er PDMS substrater fremstilles ved simpel blanding et forhold mellem basen til tværbinderen og disse substrater kan overtrækkes med ECM-proteiner uden behov for kemisk tværbinding, hvorved PDMS en lettere værktøj til at studere virkningerne af stivhed på celleopførsel. Heri beskriver vi, hvordan man forbereder en simpel durotaxis kammer, hvor en blød PDMS substrat er integreret med en stiv dækglas.
Analysen, som beskrevet nedenfor, giver en hurtig og enkel metode til at studere durotaxis. Til denne undersøgelse brugte vi humane U2OS osteosarcomceller kombineret med siRNA-medieretknockdown af cdGAP at undersøge den rolle, som denne fokal adhæsion protein i durotaxis 11. Vigtigere er det, kan denne protokol let tilpasses individuelle behov. Andre celletyper kan anvendes i stedet for de U2OS celler og helst protein kan blive skubbet ned eller overudtrykt at bestemme virkningerne på celleopførsel under durotaxis. Endvidere kan denne protokol tilpasses til at inkorporere fluorescens mærkede proteiner til at analysere deres dynamik og adfærd ved hjælp FRAP eller FRET tilgange.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri beskrives en enkel assay at studere durotaxis i migrerende celler. En stor styrke i denne analyse er den nemme forberede durotaxis kamre ved hjælp af PDMS. Stivheden af substraterne kan nemt manipuleres ved at ændre forholdet mellem PDMS baseopløsning til tværbinder for at tillade undersøgelse af forskellige stivheder i assayet. En potentiel begrænsning af systemet er imidlertid, at cellerne kun udsat for en enkelt ændring i substratet stivhed i modsætning til oplever stivhed gradient, der leveres af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af NIH R01 GM47607, CA163296 og NSF 1.334.493 til CET. Vi takker medlemmer af Turner laboratorium for kritisk læsning af manuskriptet. Alle er vist i denne rapport data blev gengivet med tilladelse fra Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
