Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En forenklet system for evaluering Cell Mechanosensing og Durotaxis doi: 10.3791/52949 Published: August 27, 2015

Abstract

For sammensetning og mekaniske egenskaper av den ekstracellulære matriks er svært variabel mellom vevstyper. Dette bindevev stroma mangfold sterkt påvirker celle atferd å regulere normale og patologiske prosesser, inkludert celledeling, differensiering, vedheft signalering og retnings migrasjon. I denne forbindelse, for å medfødt evnen av visse celletyper migrerer mot et stivere eller mindre kompatibel matrise substrat er referert til som durotaxis. Dette fenomenet spiller en viktig rolle under embryoutvikling, sårheling og kreftcelle invasjon. Her beskriver vi en enkel analyse for å studere durotaxis, in vitro, ved hjelp av polydimetyl-siloksan (PDMS) substrater. Fremstilling av den beskrevne durotaxis kamrene skaper en stivhet grensesnitt mellom det relativt myke PDMS gel og en stiv glass dekkglass. I eksempelet gitt, har vi brukt disse durotaxis kamre å demonstrere en rolle for cdc42 / Rac1 GTPase aktivere beskytti, cdGAP, i mechanosensing og durotaxis regulering i menneske U2OS osteosarkomceller celler. Denne analysen lett kan tilpasses til andre celletyper og / eller knockdown for andre proteiner av interesse å utforske sine respektive roller i mechanosignaling og durotaxis.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den ekstracellulære matriks (ECM) består av en kompleks rekke av strukturelle og kryssbindende proteiner inkludert kollagen, fibronektin og laminin. Selv om det er godt etablert at ECM gir viktig strukturell støtte for mobilnettet vev, er det økende bevis som tyder på at cellene aktivt svare på fysiske endringer i deres ECM miljø for å regulere ulike cellulære prosesser, inkludert celle overlevelse, differensiering og cellemigrasjon. For eksempel kan forskjeller i stivhet av ECM kjøre mesenchymale stamceller mot forskjellige linjene, med myke underlag (~ 1 kPa) fremme nevrogene linjer mens stive (~ 25 kPa) underlag fremme osteogent differensiering en. På samme måte har en økning av stromal matriks stivhet blitt vist å fremme mammary epitelcelle tumorigenesis og invasjon i det omkringliggende vev 2,3.

Et spesielt interessant aspekt ved denne mechanosignaling aktivitet resulterer i en prosess som kalles durotaxis, der cellene migrerer fortrinnsvis mot et mer rigid substrat 4,5. Celler kontinuerlig avføle de fysiske egenskapene til deres ekstracellulære miljø gjennom integrin-reseptor-binding til ECM. Dette i sin tur fremmer akkumulering av flere strukturelle og signaleringsproteiner til deres cytoplasmatiske domener til å drive dannelsen av klebende strukturer kjent som knutepunkter adhesjon eller fokale kontakter 6,7. Siden inte har ingen iboende enzymatisk aktivitet, blir signalene videresendt fra ECM gjennom disse tilbehørs proteiner for å koordinere cellens respons på deres skiftende miljø 8. Følgelig er identifiseringen og karakteriseringen av de sentrale proteiner involvert i regulering mechanosignaling og durotaxis et viktig område for undersøkelse.

Forskjellige modellsystemer har blitt utviklet for å studere durotaxis in vitro, men de fleste harbenyttes kollagen-belagt polyakrylamidprodukter substrater 4. Imidlertid kan fremstillingen av polyakrylamid substratene være teknisk utfordrende og kollagen som brukes i disse assays, må være kjemisk tverrbundet til underlaget 9. Polydimetylsiloksan (PDMS) substrater har vist seg å oppvise tilsvarende mekaniske egenskaper til de polyakrylamid-substrater 10. Imidlertid er PDMS substrater fremstilles ved ganske enkelt å blande et forhold av base til tverrbindingsmidlet, og disse substrater kan belegges med ECM-proteiner uten behov for kjemisk tverrbinding, og dermed gjøre PDMS en enklere verktøy for å studere effektene av stivhet på celleadferd. Heri beskrives hvordan man skal fremstille en enkel durotaxis kammer hvor en myk PDMS substrat er integrert med en stiv dekkglass.

Analysen, som beskrevet nedenfor, gir en rask og enkel metode for å studere durotaxis. For denne studien brukte vi menneske U2OS osteosarkomceller celler kombinert med siRNA-mediertknockdown av cdGAP for å studere rollen til denne fokal adhesjon proteinet i durotaxis 11. Viktigere, kan denne protokollen lett tilpasses individuelle krav. Andre celletyper kan erstatte U2OS cellene, og en hvilken som helst protein kan bli slått ned eller overuttrykt for å bestemme effektene på celle oppførsel under durotaxis. Videre kan denne protokollen tilpasses for å innlemme fluorescently tagget proteiner for å analysere sine dynamikk og atferd med FRAP eller FRET tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av Durotaxis Chambers

  1. For å fremstille en 6-brønners vevkulturplate, kalibrer vekten med en 50 ml konisk rør. Veie ut ca. 10 g av PDMS basis løsningen i 50 ml rør (løsningen er ganske viskøs).
  2. For en 90: 1 substrat (Overholdelse av ~ 1 kPa), dele den målte vekt av PDMS baseoppløsning i røret ved 90 for å bestemme den riktige mengden av tverrbindingsmiddel-løsning er nødvendig. Legge til den beregnede mengde av tverrbindingsmiddel PDMS løsning på det samme rør.
    Eksempel: 10 g / 90 = 0,11 g. Legg 0,11 g av PDMS tverrbindingsløsningen til PDMS baseløsning.
    Merk: Base og tverrbindingsløsninger er begge gitt i PDMS kit.
  3. Kraftig blanding PDMS base / tverrbinder blandingen i 5 minutter ved romtemperatur ved bruk av en liten spatel. På dette stadiet ble blandingen vil inneholde et stort antall luftbobler.
  4. Sentrifuger PDMS substratet i en benketopp-sentrifuge i 5 minutter ved 50 x g ved romtemperatur for å fjerne Bubbles. Hvis det fremdeles bobler etter 5 min, sentrifuger på nytt.
  5. Pipetter 1 ml av 90: 1 PDMS substrat til hver brønn av vevskultur behandlede 6-brønns plate. Eventuelle gjenværende luftbobler stede i PDMS kan elimineres på dette stadiet ved spratt dem ved hjelp av en 21 G nål. La PDMS til å spre seg i 30 minutter i brønnen.
  6. Koke 12 mm glass # 1 dekk i destillert vann i 5 min. Gjenta to ganger, og lagrer glassene i destillert vann.
  7. Plasser en, tørket dekkglass i hver brønn av vevskulturplaten ved forsiktig å trykke på en side av dekk inn i PDMS oppløsningen deretter slippe dekkglass på de PDMS. Som dekk legger seg, vil PDMS begynne å trenge inn over kantene på dekkglass, men det vil ikke helt dekker den. Dette vil generere et grensesnitt mellom PDMS og glass etter herding (se figur 1A, B).
  8. Inkuber platen ved 70 ° C i en ovn i 16 timer for å herde (herde) av PDMS. Plasser plate i en cellekultur hette og UV sterilisere i 10 minutter.
    MERK: Det er best å gjøre platene innen et par dagers bruk. Imidlertid kan platene være innpakket i Parafilm uten buffer og lagret ved 4 ° C i opptil to uker uten noen merkbar reduksjon i kvalitet.

2. Celleutplating

MERK: Hvis å studere effekten av siRNA-mediert knockdown, utføre knockdown med produsentens instruksjoner eller optimalisert protokoll for celletype av valget.

  1. Coat hver durotaxis kammer med 1 ml 10 pg / ml fibronectin i PBS uten kalsium og magnesium i 1 time ved 37 ° C. Alternativt kan fibronektin påføres dagen før analysen ved inkubering av PDMS med 10 pg / ml fibronektin i PBS i 16 timer ved 4 ° C. Sørg for at hele overflaten er nedsenket i fibronektinet i PBS løsning.
  2. Forbered varme denaturert 1% BSA. Vei opp 0,5 g BSA og oppløse den i 50 ml PBS.Filter sterilisere løsningen gjennom et 0,22 um filter og varme ved 80 ° C i 12 min.
    Merk: Forbered denne løsningen dagen før celle plating og oppbevares ved 4 ° C.
  3. Aspirer fibronektin løsningen og vask 3 ganger med PBS. Tilsett 1 ml varme-denaturert BSA i PBS til hver brønn og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur.
  4. Trypsineres og telle celler av valg mens durotaxis kamre blokkerer med varmen denaturert BSA.
  5. Plate 1 x 10 5 celler i et volum på 2 ml i hver brønn av den durotaxis kammeret, ved hjelp av mediet som kreves for den spesielle celletype av valget. La cellene få feste seg og spredt på underlaget i 4 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
    MERK: U2OS Cellene blir rutinemessig opprettholdt i DMEM med 10% FBS, supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 10 IU / ml penicillin, 10 ug / ml streptomycin.
    MERK: celleantall anvendt i dette eksempel er optimalisert forU2OS celler. Optimalisering for andre celletyper kan være nødvendig. Denne tetthet gir cellene nok plass til å migrere uten signifikante interaksjoner med andre celler.

3. Levende celler Imaging

  1. Opptre live celle bildebehandling på en invertert mikroskop, ved hjelp av fasekontrast med en 10X objektiv. Mikroskopet skal være utstyrt med et lukket miljø, fuktet kammer, slik at kontroll av temperatur på 37 ° C og 5% CO 2 under langsiktig bildebehandling.
  2. Etter at cellene har spredt seg i omtrent 3,5 timer, montere platen i mikroskopet kammeret. Tillat prøven (e) til likevekt i kammeret i 30 minutter.
  3. Sett opp automatisk, multi-punkt på besøk på mikroskopet hvis tilgjengelig. Fokus på grensesnittet mellom 90: 1 PDMS og glass dekkglass og velge peker på bildet over hele grensesnitt med et gjennomsnitt på 40 poeng per durotaxis kammeret. Bilde cellene hver 10 min for opp til 16 timer.
    MERK: region av interesse vil vises som to linjer, med den ytre linjen svarende til kanten av dekkglasset og den indre linje som tilsvarer den faktiske kontaktflaten mellom PDMS og dekkglass. Se figur 1B.

4. Data Analysis

  1. Generere et regneark som i tabell 1.
  2. Telle antall krysnings hendelser fra PDMS til glassflaten og vice versa fra hver film generert. Registrere antall kryssende hendelser i riktig kolonne i excel regneark.
    MERK: En krysset hendelse er definert som cellekjernen passerer over grensen mellom de PDMS og glass i begge retninger.
  3. For å kvantifisere flere kryssinger, telle antall ganger cellen krysset grensesnittet. At antallet bør registreres i excel kolonne tilsvarende underlaget som cellen ble plassert på slutten av filmen. Gjenta analysen for hver celle som krysser grensesnittet i than filmen. Utelukke celler som vandrer ut av synsfeltet under bildebehandling.
    Merk: Det er også viktig å verifisere, ved celle å telle ved begynnelsen av eksperimentet, at cellene er i stand til å overholde likt med fibronektin-belagte PDMS og glass dekkflater.
  4. Beregne hvor stor andel av cellene som migrerte fra PDMS til glassoverflaten (dvs. gikk durotaxis). Legg antall krysset hendelser fra mykt til hardt og de mange kryssende hendelsene som endte på hardt og dividere med totalt antall kryssende arrangementer.
  5. Beregn prosentandelen av flere kryssinger ved å dividere antall av flere kryssinger med det totale antallet av kryssinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En skjematisk av durotaxis kammeret er vist i Figur 1A. Myk PDMS substrat (en 90: 1 blanding av PDMS basis til tverrbindingsmiddel-løsninger) er spredt i en 6 brønners skål og et glass dekkglass er plassert på toppen av PDMS, som deretter delvis dekker den øvre overflate av dekkglass, og dermed skape et grensesnitt mellom de to substrater av forskjellig samsvar. Stivheten til den myke PDMS substratet er ~ 1 kPa, noe som kan sammenlignes med den typiske overholdelse av hjernevev, mens stivheten av glasset er omkring 1-2 GPa 1. En fasekontrastbilde av grenseflaten mellom de PDMS og glasset er vist med de hvite pilene figur 1B. Stjernene betegne to kontroll RNAi celler migrerer mot hardere underlag. Den fillete kant som kan bli sett (svart pil) tilsvarer kanten av dekkglass.

Å kvantifisere data, bør et Microsoft Excel-regneark genereres som i tabell 1 </ strong>. Antall kryssings hendelser skal telles og organisert i den tilsvarende kolonnen. Noen av de filmene som genereres kan ikke brukes for kvantifisering. En film kan utelates fra kvantifisering hvis det er en boble i PDMS som griper inn i et celler pågår eller hvis cellene er for tett pakket, noe som resulterer i kollisjoner som drastisk kan påvirke cellen retningen. Celledeling bør også overvåkes, da dette kan også åpenlyst påvirke celle bevegelse.

Vanligvis vil de fleste heftcelletyper fortrinnsvis vandre mot en stivere substrat 2,4,12. For å begynne å forstå den molekylære mekanismen som cellene reagerer på mekaniske signaler i sitt miljø, kan spesifikke proteiner bli slått ned ved hjelp av siRNA. I vårt eksempel, rundt 70% av kontroll siRNA-behandlede celler utstilt durotaxis figur 2A. I slående kontrast, når cdGAP ble slått ned ved hjelp av RNAi, cellene hadde ingen preferansemed hensyn til om de migrerte mot hardt eller mykt underlag figur 2A. Videre cdGAP knockdown celler krysset grensen flere ganger, mens kontroll siRNA behandlede celler vanligvis bare krysset grensen en gang, figur 2B. Representative spor av kontroll siRNA celler viser at cellene vanligvis vandrer over grensen en gang, og fortrinnsvis bodde på mer rigid overflate i forhold til cdGAP siRNA-behandlede celler som ikke viser en preferanse for enten stivhet og krysset grensen flere ganger Figur 2C.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av Durotaxis kammeret definert. (A) Myk PDMS er fordelt i hver brønn av en 6-brønners skål og et glass dekkglass er plassert på toppen av PDMS. De PDMS vil foregripe over sidene av toppen av dekkglass, BEFore det stivner, for å danne en grenseflate mellom de to substratene. Durotaxis bestemmes ved å utføre retningen av cellene som krysser PDMS / glass-grensesnitt. (B) Representant fase kontrast bilde som viser grensesnittet mellom de myke PDMS og stive glass underlaget. Stjernene viser kontroll RNAi behandlet U2OS celler gjennomgår durotaxis. De hvite pilspisser betegne grensesnittet mellom PDMS og glass dekkglass og pilen indikerer kanten av dekkglass under PDMS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1
Tabell 1. Skjematisk av Microsoft Excel-regneark satt opp. Kolonner er etablert for å inkludere filmen nummer, siRNA brukt, antall celler som migrerte fra de myke PDMStil stivt glass-substrat, eller vice versa, så vel som det totale antall celler som ble analysert. Kolonner er også satt opp for cellene som krysser grensesnittet flere ganger, og ender på enten de myke PDMS eller glasset underlaget. Hvis en celle vandrer på tvers av grense flere ganger, er antallet av flere kryssende arrangementer av disse cellene tatt opp i søylen av substratet hvorpå cellen ble plassert i enden av filmen.

Figur 2
Figur 2. knockdown av cdGAP i U2OS celler fører til tap av durotaxis. (A) Kontroll siRNA behandlede celler migrerer fortrinnsvis på stive glass underlaget, mens cdGAP siRNA behandlede celler ikke viser noen preferanse. (B) Kontroll siRNA behandlede celler krysset grensen mellom PDMS og glass gang. Men migrert cdGAP RNAi-behandlede celler frem og tilbake over den boundary flere ganger. (C) Spor av representative celler behandlet med enten kontroll, eller cdGAP siRNA ble generert ved hjelp av manuell tracking plugin i ImageJ. P-verdiene ble bestemt ved hjelp av en t-test og feil barer representerer 95% konfidensintervall. Gjengitt med tillatelse fra Wormer et al. 2014 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heri beskriver vi en enkel analyse for å studere durotaxis i migrere celler. En stor styrke av denne analysen er den enkle forberede durotaxis kamre ved hjelp PDMS. Stivheten av substratene kan lett manipuleres ved å endre forholdet av PDMS baseløsning til tverrbindingsmiddel for å tillate undersøkelse av forskjellige stivheter i analysen. Imidlertid er en potensiell begrensning av systemet som cellene blir kun utsatt for en enkelt endring i substratet stivhet i motsetning til opplever en stivhet gradient som er gitt av mer avanserte systemer 4. Viktigere, i motsetning til polyakrylamid-substrater, ECM-komponenter behøver ikke å være kjemisk tverrbundet til PDMS. Faktisk, er fibronektin belegget tilnærmet lik på begge PDMS og glassflatene, som bestemt ved farging med et antistoff spesifikt til fibronektin 11. Siden tidligere studier har vist at cellene oppfører seg likt på enten PDMS eller polyakrylamid underlag, bruk of PDMS substrater gir en mye enklere modell som brukes til å studere mechanotransduction i celler 10,12.

De viktigste trinn i fremstillingen av PDMS substrater er å sikre at basen og tverrbindings Løsningene ble grundig blandet. Hvis de ikke er blandet godt nok, så underlagene vil ikke helt kurere ved varmebehandling. Dette vil resultere i dekk synker for langt inn i PDMS eller dekk drivende i PDMS under avbildning. Dersom sentrifugering kraften er for høy, kan basen og tverrbindingsløsninger atskilt i røret. Dette kan avhjelpes ved å redusere hastigheten sentrifugering eller ved avgassing av blandingen i 30 min ved anvendelse av et vakuumkammer. Til slutt, er celletettheten kritisk, som for mange celler vil påvirke deres evne til å spre seg fullt ut og til å durotax uhindret ved kontakt med naboceller. Tettheten rapportert her var optimalisert for U2OS celler. Imidlertid, hvis andre celletyper benyttes, optimal cell tallene vil måtte bestemmes empirisk.

Vi har nylig brukt denne analysen for å studere hvordan fokus vedheft signaliserer protein cdGAP regulerer mechanosensing og durotaxis 11. Klart, det er mange cellulære komponenter i tillegg til fokale sammenvoksninger, for eksempel cytoskeletal elementer, protein trafficking komponenter og ionekanaler som er involvert i mekanisk signale og dermed kan også bidra til regulering av durotaxis 13-15. Hver av disse komponentene kan lett evalueres i vårt system under anvendelse av lignende RNAi tilnærminger. I tillegg er denne analysen meget mottagelig for innføring av ulike farmakologiske aktivatorer eller inhibitorer. Analysen kan også tilpasses for å tillate mer avanserte former for analyse slik som inkorporering av fluorescently-merkede proteiner, i kombinasjon med FRET eller FRAP nærmer seg, for å studere protein dynamikk og rom-tid-aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av NIH R01 GM47607, CA163296 og NSF 1.334.493 til CET. Vi takker medlemmene av Turner lab for kritisk lesing av manuskriptet. Alle data som er vist i denne rapporten ble gjengitt med tillatelse fra Wormer et al. 2 014 11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 3097358-1004 Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm Fisher Scientific 12-545-82
6-well plate Celltreat 229106
DMEM Cellgro 15-017-CM
L-Glutamine Cellgro 25-005-CI
Sodium Pyruvate Fisher Scientific BP356-100
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
Fibronectin BD Biosciences 610077
PBS Invitrogen 21600-044
Falcon tubes Celltreat 229456
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Bovine Serum Albumin Sigma A7906
U2OS cells ATCC HTB-96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  3. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, (5), 891-906 (2009).
  4. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, (1), 144-152 (2000).
  5. Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25, (5), 619-626 (2013).
  6. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88, (1), 39-48 (1997).
  7. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3, (5), 466-472 (2001).
  8. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124, (8), 1195-1205 (2011).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  10. Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13, (12), 1457-1465 (2011).
  11. Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9, (3), e91815 (2014).
  12. Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (18), 6933-6938 (2012).
  13. Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21, (1), 35-47 (2011).
  14. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117, (12), 2449-2460 (2004).
  15. Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9, (3), 351-363 (2005).
En forenklet system for evaluering Cell Mechanosensing og Durotaxis<em&gt; In Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. J. Vis. Exp. (102), e52949, doi:10.3791/52949 (2015).More

Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. J. Vis. Exp. (102), e52949, doi:10.3791/52949 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter