Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
For sammensetning og mekaniske egenskaper av den ekstracellulære matriks er svært variabel mellom vevstyper. Dette bindevev stroma mangfold sterkt påvirker celle atferd å regulere normale og patologiske prosesser, inkludert celledeling, differensiering, vedheft signalering og retnings migrasjon. I denne forbindelse, for å medfødt evnen av visse celletyper migrerer mot et stivere eller mindre kompatibel matrise substrat er referert til som durotaxis. Dette fenomenet spiller en viktig rolle under embryoutvikling, sårheling og kreftcelle invasjon. Her beskriver vi en enkel analyse for å studere durotaxis, in vitro, ved hjelp av polydimetyl-siloksan (PDMS) substrater. Fremstilling av den beskrevne durotaxis kamrene skaper en stivhet grensesnitt mellom det relativt myke PDMS gel og en stiv glass dekkglass. I eksempelet gitt, har vi brukt disse durotaxis kamre å demonstrere en rolle for cdc42 / Rac1 GTPase aktivere beskytti, cdGAP, i mechanosensing og durotaxis regulering i menneske U2OS osteosarkomceller celler. Denne analysen lett kan tilpasses til andre celletyper og / eller knockdown for andre proteiner av interesse å utforske sine respektive roller i mechanosignaling og durotaxis.
Den ekstracellulære matriks (ECM) består av en kompleks rekke av strukturelle og kryssbindende proteiner inkludert kollagen, fibronektin og laminin. Selv om det er godt etablert at ECM gir viktig strukturell støtte for mobilnettet vev, er det økende bevis som tyder på at cellene aktivt svare på fysiske endringer i deres ECM miljø for å regulere ulike cellulære prosesser, inkludert celle overlevelse, differensiering og cellemigrasjon. For eksempel kan forskjeller i stivhet av ECM kjøre mesenchymale stamceller mot forskjellige linjene, med myke underlag (~ 1 kPa) fremme nevrogene linjer mens stive (~ 25 kPa) underlag fremme osteogent differensiering en. På samme måte har en økning av stromal matriks stivhet blitt vist å fremme mammary epitelcelle tumorigenesis og invasjon i det omkringliggende vev 2,3.
Et spesielt interessant aspekt ved denne mechanosignaling aktivitet resulterer i en prosess som kalles durotaxis, der cellene migrerer fortrinnsvis mot et mer rigid substrat 4,5. Celler kontinuerlig avføle de fysiske egenskapene til deres ekstracellulære miljø gjennom integrin-reseptor-binding til ECM. Dette i sin tur fremmer akkumulering av flere strukturelle og signaleringsproteiner til deres cytoplasmatiske domener til å drive dannelsen av klebende strukturer kjent som knutepunkter adhesjon eller fokale kontakter 6,7. Siden inte har ingen iboende enzymatisk aktivitet, blir signalene videresendt fra ECM gjennom disse tilbehørs proteiner for å koordinere cellens respons på deres skiftende miljø 8. Følgelig er identifiseringen og karakteriseringen av de sentrale proteiner involvert i regulering mechanosignaling og durotaxis et viktig område for undersøkelse.
Forskjellige modellsystemer har blitt utviklet for å studere durotaxis in vitro, men de fleste harbenyttes kollagen-belagt polyakrylamidprodukter substrater 4. Imidlertid kan fremstillingen av polyakrylamid substratene være teknisk utfordrende og kollagen som brukes i disse assays, må være kjemisk tverrbundet til underlaget 9. Polydimetylsiloksan (PDMS) substrater har vist seg å oppvise tilsvarende mekaniske egenskaper til de polyakrylamid-substrater 10. Imidlertid er PDMS substrater fremstilles ved ganske enkelt å blande et forhold av base til tverrbindingsmidlet, og disse substrater kan belegges med ECM-proteiner uten behov for kjemisk tverrbinding, og dermed gjøre PDMS en enklere verktøy for å studere effektene av stivhet på celleadferd. Heri beskrives hvordan man skal fremstille en enkel durotaxis kammer hvor en myk PDMS substrat er integrert med en stiv dekkglass.
Analysen, som beskrevet nedenfor, gir en rask og enkel metode for å studere durotaxis. For denne studien brukte vi menneske U2OS osteosarkomceller celler kombinert med siRNA-mediertknockdown av cdGAP for å studere rollen til denne fokal adhesjon proteinet i durotaxis 11. Viktigere, kan denne protokollen lett tilpasses individuelle krav. Andre celletyper kan erstatte U2OS cellene, og en hvilken som helst protein kan bli slått ned eller overuttrykt for å bestemme effektene på celle oppførsel under durotaxis. Videre kan denne protokollen tilpasses for å innlemme fluorescently tagget proteiner for å analysere sine dynamikk og atferd med FRAP eller FRET tilnærminger.
Heri beskriver vi en enkel analyse for å studere durotaxis i migrere celler. En stor styrke av denne analysen er den enkle forberede durotaxis kamre ved hjelp PDMS. Stivheten av substratene kan lett manipuleres ved å endre forholdet av PDMS baseløsning til tverrbindingsmiddel for å tillate undersøkelse av forskjellige stivheter i analysen. Imidlertid er en potensiell begrensning av systemet som cellene blir kun utsatt for en enkelt endring i substratet stivhet i motsetning til opplever en stivhet gradient som er gi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av NIH R01 GM47607, CA163296 og NSF 1.334.493 til CET. Vi takker medlemmene av Turner lab for kritisk lesing av manuskriptet. Alle data som er vist i denne rapporten ble gjengitt med tillatelse fra Wormer et al. 2 014 11.
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
#1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
6-well plate | Celltreat | 229106 | |
DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
U2OS cells | ATCC | HTB-96 |