Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi doi: 10.3791/52949 Published: August 27, 2015

Abstract

Ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mekanik özellikleri, doku tipleri arasında oldukça değişkendir. Bu bağ dokusu stroma ölçüde çeşitlilik etkileri, hücre davranış hücre çoğalması, farklılaşması, yapışma sinyalizasyon ve yön göç de dahil olmak üzere, normal ve patolojik süreçleri düzenler. Bu bağlamda, bazı hücre tiplerinin doğal yeteneğini durotaxis olarak ifade edilir, bir katı ya da daha az uyumlu bir matriks substrat tabakasına doğru göç. Bu olgu, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi ve kanser hücresi yayılımını tamamen sırasında önemli bir rol oynar. Burada, polidimetilsiloksan (PDMS) alt tabakalar kullanarak, in vitro olarak durotaxis çalışma için basit bir deney tarif eder. Odaları durotaxis tarif hazırlanması nispeten yumuşak PDMS jel ve katı bir cam lamel arasında bir sertlik arabirimi oluşturur. Verilen örnekte, cdc42 bir rol göstermek için bu durotaxis odaları kullandık / Rac1 GTPaz aktive protecdGAP bölgesi, mechanosensing ve insan U2OS osteosarkoma hücrelerinde durotaxis düzenlenmesinde. Bu deney, mechanosignaling ve durotaxis bunların rollerini araştırmak için başka hücre tipleri ve / veya önemli diğer proteinlerin demonte kolaylıkla uyarlanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hücre dışı matris (ECM), kolajen, fibronektin ve laminin gibi yapısal ve çapraz bağlama proteinlerinin karmaşık bir dizi oluşur. De ECM hücre dokular için önemli bir yapısal destek sağlar tespit edilmesine rağmen, hücreler aktif olarak, hücre hayatta kalması, farklılaşma ve hücre göçü de dahil olmak üzere çok çeşitli hücresel işlemleri düzenleyen kendi ECM ortamında fiziksel değişikliklere yanıt olduğunu belirtmek için artan kanıtlar vardır. Sert (~ 25 kPa) yüzeyler osteojenik farklılaşma 1 teşvik Örneğin, ECM sertlik farklılıklar yumuşak yüzeylerde (~ 1 kPa) nörojenik soy teşvik ile, farklı soy karşı mezenkimal kök hücrelerin sürebilirim. Benzer şekilde, stromal matrisi katılıkta bir artış çevre doku 2,3 halinde meme epitelyal hücre tümörogenez ve işgali teşvik ettiği gösterilmiştir.

Bu mechanosign için özellikle ilginç bir yönüHücreler daha sert bir alt-tabaka 4,5 doğru tercihli olarak göç ettiği durotaxis olarak bilinen bir işlemde aling etki gösterir. Hücreler sürekli ECM bağlanarak integrin reseptörü yoluyla hücre dışı ortamın fiziksel özelliklerini hissederler. Bu da, fokal yapışmalarda ve fokal temas 6,7 olarak bilinen yapıştırma yapıların oluşumunu sürücü sitoplazmik alanlarında çok sayıda yapısal ve sinyal proteinlerinin birikimi teşvik eder. Integrinlerinin hiçbir doğasında enzimatik aktiviteye sahip olduğundan, sinyaller değişen çevre 8 hücrenin yanıtı koordine etmek, bu aksesuar proteinleri aracılığıyla ECM'den aktarılmaktadır. Buna göre, mechanosignaling ve durotaxis düzenleyen kilit rol oynayan proteinlerin belirlenmesi ve karakterizasyonu araştırılması gereken önemli bir alandır.

Çeşitli model sistemler durotaxis in vitro incelemek için geliştirilmiştir, ancak çoğu varkullanılan kollajen kaplı poliakrilamid yüzeyler 4. Bununla birlikte, poliakrilamid substratlar hazırlanması teknik olarak zor olabilir ve bu deneylerde kullanılan kollajen alt-tabaka 9 kimyasal olarak çapraz bağlanmış olması gerekir. Polidimetilsiloksan (PDMS) alt-tabakalar poliakrilamid alt tabakalar 10 için karşılaştırılabilir mekanik özellikler göstermektedir gösterilmiştir. Bununla birlikte, alt-tabakalar, sadece çapraz bağlayıcı madde PDMS bazın bir karıştırma oranı ile hazırlanabilir ve bu alt-tabakalar bu şekilde PDMS hücre davranışı üzerindeki sertlik etkilerini incelemek için daha kolay bir araç yapan kimyasal çapraz bağlama için gerek kalmadan ECM proteinleri ile kaplanabilir. Bu yazıda, yumuşak bir PDMS substrat sert cam lamel ile entegre edildiği bir basit durotaxis odasını nasıl hazırlanacağını açıklar.

Deney aşağıda açıklandığı gibi, durotaxis incelemek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir. Bu çalışma için siRNA aracılı ile birlikte, insan osteosarkoma hücreleri kullanılır U2OScdGAP demonte durotaxis 11 bu fokal yapışma proteininin rolünü araştırmak için. Önemli olarak, bu protokol, kolaylıkla kişisel gereksinimlere uyarlanabilir. Diğer hücre tipleri U2OS hücreleri için ikame edilebilir ve herhangi bir protein düşürülmüş olup durotaxis sırasında hücre davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek için aşırı ifade edilebilir. Ayrıca, bu protokol dinamiklerini ve davranışları kullanılarak sıkı bağlamak ya da yaklaşımlar FRET analizi, floresan etiketli proteinler dahil adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Durotaxis Chambers hazırlanması 1.

  1. Bir 6-yuvalı doku kültürü plakası hazırlanması için, 50 ml konik tüp ile denge dara. 50-ml tüp PDMS baz çözeltisi yaklaşık 10 gr tartılır (çözüm oldukça viskoz).
  2. 90: 1 substrat (~ 1 kPa Uyum), gerekli çapraz bağlayıcı çözeltisinin doğru miktarını belirlemek için 90 ile tüp içinde PDMS baz çözeltisi ölçülen kilo bölün. Aynı tüp PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi hesaplanan miktar ekleyin.
    Örnek: 10 g / 90 = 0.11 g. PDMS baz çözeltisine PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi 0.11 g ekleyin.
    NOT: Baz ve çapraz bağlayıcı çözümleri hem PDMS kit sağlanmaktadır.
  3. Şiddetle küçük bir spatula kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PDMS baz / çapraz bağlayıcı karışımı karıştırın. Bu aşamada kanşım hava kabarcıkları çok sayıda içerir.
  4. Bub çıkarmak için oda sıcaklığında 50 x g'de 5 dakika boyunca, bir tezgah üstü santrifüj içinde PDMS substratı santrifüjbles. Varsa hala tekrar 5 dakika, santrifüj sonra kabarcıklar.
  5. 90 pipetle 1 ml: Doku kültürü her oyuğuna 1 PDMS alt-tabaka 6 oyuklu plaka işlemden geçirildi. PDMS mevcut olan herhangi bir geri kalan hava kabarcıkları, bir 21 G iğnesi kullanılarak bunları haşhaş bu aşamada elimine edilebilir. PDMS oyuk 30 dakika boyunca yaymak için izin verir.
  6. Kaynama 12 mm cam # 5 dakika için damıtılmış su içinde 1 lamelleri. Iki kez tekrarlanır ve damıtılmış su içinde lamelleri saklayın.
  7. Yavaşça PDMS üzerine lamel damla PDMS çözeltisi içine lamel bir tarafını dokunarak doku kültür plakasının her bir oyuğuna, bir kurutulmuş, lamel yerleştirin. Lamel yerleşir gibi, PDMS lamel kenarları boyunca tecâvüz başlayacak, ama tamamen kapsayacak olmaz. Bu (B Şekil 1A bakınız) sertleştikten sonra PDMS ve cam arasında bir arayüz oluşturur.
  8. PDMS tedavi (sertleşmesine) 16 saat için bir fırın içinde 70 ° C 'de plaka inkübe edin. Plat yerleştirinBir hücre kültürü kaputu ve UV e 10 dakika süreyle sterilize edin.
    NOT: Bu kullanım bir kaç gün içinde plakaları yapmak en iyisidir. Bununla birlikte, levha Herhangi bir tampon maddesi olmadan Parafilm ile sarılmış ve kalitede herhangi bir fark azalma olmadan, 2 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.

2. Hücre Ekimi

NOT: siRNA aracılı demonte etkisini inceleyerek varsa, üreticinin talimatlarına veya seçim hücre tipi için optimize edilmiş protokolü kullanılarak demonte gerçekleştirin.

  1. Kaplama, her 37 ° C 'de 1 saat süre ile, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın / ml fibronektin PBS içinde 10 ug 1 ml bölmeyi durotaxis. Seçenek olarak ise, fibronektin, 4 ° C'de 16 saat boyunca / ml fibronektin PBS içinde 10 ug PDMS inkübe ile analizden önce gün tatbik edilebilir. Tüm yüzey PBS çözüm fibronektin batmış olduğundan emin olun.
  2. Isı ile denatüre edilmiş,% 1 BSA hazırlayın. 0,5 g BSA tartılır ve 50 ml PBS içinde çözülür.Filtre 12 dakika boyunca 80 ° C 'de, 0.22 um'lik bir filtreden ve ısı yoluyla çözüm sterilize edin.
    Not: Bu çözüme 4 ° C'de kaplama ve mağaza hücre öncesinde güne hazırlayın.
  3. Fibronektin solüsyonu aspire edildi ve PBS ile 3 kez yıkayın. Her bir oyuğa, PBS içinde ısı ile denatüre BSA 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
  4. Durotaxis odaları ısı denatüre BSA ile bloke ederken Trypsinize ve seçim hücreleri saymak.
  5. Levha seçim, belirli bir hücre tipi için gerekli ortam kullanılarak durotaxis bölmesinin her bir kuyunun içine 2 ml lik bir hacim içinde, 1 x 10 5 hücre. Hücreler uygun ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 4 saat süre ile alt-tabaka üzerinde yayılmasına izin verir.
    Not: U2OS hücreleri rutin 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 10 lU / ml penisilin, 10 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş,% 10 FBS bulunan DMEM içerisinde muhafaza edilir.
    NOT: Bu örnekte kullanılan hücre sayısı için optimize edilmiştirU2OS hücreleri. Diğer hücre türleri için optimizasyon gerekebilir. Bu yoğunluk hücreleri, diğer hücrelerle önemli etkileşimler olmadan geçirmek için yeterli oda verir.

3. Canlı hücre Görüntüleme

  1. 10X amacı ile faz kontrast kullanarak, ters bir mikroskop canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Mikroskop, uzun vadeli görüntüleme sırasında 37 ° C sıcaklığın kontrol edilmesi ve% 5 CO2 sağlayan kapalı bir çevre, nemli bir bölmede ile donatılmış olmalıdır.
  2. Hücreler yaklaşık 3.5 saat boyunca yayıldı sonra, mikroskop odasında plaka monte edin. Örnek (ler) 30 dakika boyunca oda içinde dengelenmeye bırakın.
  3. Varsa mikroskop ziyaret otomatik, çok noktalı ayarlayın. 90 arasındaki arayüze odaklanın: 1 PDMS ve cam lamel ve tüm durotaxis odasına başına 40 sayılık bir ortalama ile arayüzü etrafında görüntü noktaları seçin. Resim hücreleri kadar 16 saat boyunca her 10 dakikada bir.
    NOT: Yenidenilgi gion lamel kenarı ve PDMS ve kapak arasında fiili bir arayüz karşılık gelen iç hat karşılık gelen dış hat ile, iki çizgi olarak görünür. Şekil 1B bakınız.

4. Veri Analizi

  1. Tablo 1 deki gibi bir elektronik tablo oluşturur.
  2. Üretilen her film cam yüzey ve tersi PDMS gelen geçiş olaylarının sayısını. Excel uygun sütununda geçiş olaylarının numarasını kaydedin.
    NOT: Bir geçiş olayı her iki yönde PDMS ile cam arasındaki sınır üzerinden geçen hücre çekirdeğinde olarak tanımlanır.
  3. Birden geçişleri ölçmek için, hücre arayüzü geçti sayısını saymak. Bu sayı, hücre filmin sonunda yer edildiği yüzeye karşılık gelen excel sütunda kayıt altına alınmalıdır. T arayüzü haçlar her hücre için analiz tekrarlayınO film. Görüntüleme sırasında görüş alanının dışına göç hücreleri hariç.
    NOT: Bu hücrelerin fibronektin kaplı PDMS ve cam lamel yüzeylerine eşit olarak yapışır mümkün olduğunu, denemenin başında sayma hücre tarafından, doğrulamak için de önemlidir.
  4. Cam yüzey (yani, durotaxis yapıldı) için PDMS göç hücrelerinin yüzdesini hesaplayın. Yumuşak sert ve geçiş olaylarının toplam sayısına göre sert ve bölmek tarihinde sona eren birden geçiş olaylara olayları kapısı sayısını ekleyin.
  5. Geçitlerin toplam sayısına göre birden geçişleri sayısına bölünmesiyle birden geçişleri yüzdesini hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Durotaxis bölmesinin şematik Şekil 1A 'de gösterilmiştir. Yumuşak PDMS alt-tabaka (90: çözüm çapraz bağlayıcı PDMS baz 1 karışımı) 6 iyi bir çanak içinde yayılır ve bir cam lamel böylece bir ara yüzey oluşturarak, daha sonra kısmen lamel üst yüzeyini kaplayan PDMS, üst üste yerleştirilir Farklı uyum iki alt tabaka arasında yer almaktadır. Yumuşak PDMS alt-tabakanın sertliği cam sertliği yaklaşık GPa'dır 01-02 Ocak iken, beyin dokusu tipik bir uyum ile karşılaştırılabilir ~ 1 kPa vardır. PDMS ve cam arasındaki ara bir faz kontrast görüntüsü Şekil 1B beyaz ok başları ile gösterilmiştir. Yıldız sert alt tabaka doğru göç iki kontrol RNAi hücrelerini ifade etmektedir. Görülebileceği düzensiz kenar (siyah ok) lamel kenarına gelir.

Veri ölçmek için, bir Microsoft Excel elektronik tablo, Tablo 1'deki gibi oluşturulmalıdır </ strong>. Geçiş olaylarının sayısı sayılır ve ilgili sütuna organize edilmelidir. Oluşturulan filmler bazı ölçümü için kullanılamaz. Bir hücreler ilerleme müdahale veya PDMS bir kabarcık varsa bir film miktarının ihmal edilebilir hücreleri çok yoğun dolu ise, büyük ölçüde hücre yönlülük etkileyebilecek çarpışmalarda ortaya çıkan. Bu, aynı zamanda açık bir şekilde, hücre hareketini etkileyen gibi hücre bölünmesi, aynı zamanda, takip edilmelidir.

Tipik olarak, en yapışık hücre tipleri tercihen bir sert yüzeye 2,4,12 doğru göç edecek. Hücreler kendi ortamında mekanik ipuçlarına cevap hangi moleküler mekanizmayı anlamaya başlamak için, spesifik proteinlerin siRNA kullanılarak yere serdi edilebilir. Örneğimizde, kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelerin yaklaşık% 70 durotaxis Şekil 2A sergiledi. CdGAP RNAi kullanarak yere serdi zaman, kontrast çarpıcı hücreler hiçbir tercih vardıolmadığı konusunda sert veya yumuşak tabaka Şekil 2A üzerine göç. Kontrol siRNA'nın tedavi hücreler genellikle sadece bir kez sınır, Şekil 2B geçti oysa Dahası, cdGAP demonte hücreleri, sınır birden çok kez geçti. Kontrol siRNA hücrelerin temsili parça hücreleri genellikle, ya sertlik için tercih arzeder ve sınır birden çok kez Şekil 2C çapraz değil cdGAP siRNA ile muamele edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında bir kez ve tercihen daha bükülmez bir yüzeye kaldı sınır boyunca göç ettiğini göstermektedir.

Figür 1
Ayarlamak Durotaxis odasının Şekil 1 şematik (A). Yumuşak PDMS 6 oyuklu çanak her çukuruna yayılır ve bir cam lamel PDMS üstüne yerleştirilir. PDMS bef, lamel üst kenarlarında üzerinde tecavüz edecekBu, sertleşen iki alt tabaka arasında bir ara yüzey oluşturmak için maden cevheri. Durotaxis PDMS / cam arayüzü geçen hücrelerin yönünü puanlama ile tespit edilir. (B) yumuşak PDMS ve sert cam alt tabaka arasındaki arayüzü gösteren Temsili faz kontrastlı görüntü. Yıldız durotaxis geçiren kontrol RNAi ile muamele U2OS hücreleri göstermektedir. Beyaz ok uçları PDMS ve cam lamel ve ok arasındaki arayüz PDMS altında cam lamel kenarına gösterir göstermek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1
Tablo 1. Microsoft Excel elektronik şematik kurdu. Sütunlar film sayısı içerecek şekilde kurulan, siRNA, kullanılan yumuşak PDMS göç hücrelerin sayısıkatı cam alt-tabaka ya da tam tersi, hem de analiz hücrelerin toplam sayısı. Sütunlar da arayüzü birden çok kez çapraz ve yumuşak PDMS veya cam alt tabaka ya sona hücreleri için ayarlanır. Hücre sınır birden çok kez boyunca göç ederse, bu hücrelerin birden çok geçiş olaylarının sayısı, hücre filmin sonunda bulunan, bunun üzerine alt-tabaka sütununda kaydedilmiştir.

Şekil 2,
U2OS hücrelerinde cdGAP Şekil 2. demonte durotaxis bir kaybına yol açar. CdGAP siRNA ile muamele görmüş hücreler herhangi bir tercih arzetmemiştir ise (A) Kontrol siRNA ile muamele görmüş hücreler, sert cam alt tabaka üzerine tercihli olarak yer değiştirmektedir. (B) Kontrol siRNA'nın tedavi hücreler bir kez PDMS ve cam arasındaki sınırı geçti. Bununla birlikte, cdGAP RNAi ile muamele edilmiş hücreler, ileri ve geri b boyunca göçoundary birden çok kez. Temsili hücreler (C) parçalar, ya kontrol ile muamele edilmiş ya da cdGAP siRNA ImageJ El izleme eklentisi kullanarak üretilmiştir. P-değerleri, bir öğrenci t-testi kullanılarak tespit edilmiştir ve hatalar çubukları,% 95'lik güven aralığını temsil eder. Wormer ve ark., 2014 11 izni ile çoğaltılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yazıda hücrelerin taşınmasıyla durotaxis incelemek için basit bir tahlil açıklar. Bu deneyde önemli bir gücü PDMS kullanarak durotaxis odaları hazırlamak kolaylığıdır. Alt-tabakaların sertliği, kolayca deneyinde, çeşitli katılıklarının bir çalışma sağlamak için bir çapraz bağlayıcı PDMS baz çözeltisi oranı değiştirilerek kontrol edilebilir. Ancak, sistemin bir potansiyel sınırlama daha sofistike sistemlerin 4 tarafından sağlanan bir sertlik degrade yaşandığı karşıt olarak hücreler sadece alt tabaka sertlik tek bir değişime maruz olmasıdır. Önemli olarak, poliakrilamid alt tabakalar farklı olarak, ECM bileşenleri kimyasal olarak çapraz-bağlanmış PDMS olmak zorunda değildir. Fibronektin 11 özel bir antikor ile lekelenmesi ile saptandığı haliyle Gerçekten de, fibronektin kaplama PDMS ve cam yüzeylerde hem eşdeğerdir. Önceki çalışmalar hücreler ya PDMS veya poliakrilamid yüzeylerde, kullanım o aynı davrandığını göstermiştir beriyüzeyler f PDMS hücrelerinde 10,12 yılında mekanotransdüksiyonu incelemek için ile çok daha kolay bir model sunmaktadır.

PDMS substratların hazırlanmasında en önemli adımı taban ve çapraz bağlayıcı solüsyonlar iyice karıştırılır sağlamaktır. Onlar yeterince karışık değilse, o zaman yüzeyler tamamen ısıl işlemden sonra tedavi olmaz. Bu lamel PDMS içine çok batıyor veya lamel görüntüleme sırasında PDMS sürüklenen neden olacaktır. Santrifüj kuvveti çok yüksek ise, taban ve çapraz bağlayıcı solüsyonlar tüp içinde ayrılabilir. Bu santrifüjleme hızı azaltarak veya bir vakum odacığı kullanılarak 30 dakika boyunca karışımın gazının giderilmesi çözülebilir. Son olarak, hücre yoğunluğu çok fazla hücre yeteneğini tamamen yaymak için ve komşu hücrelerle temas yoluyla engelsiz durotax için etkileyecektir gibi kritik öneme sahiptir. Burada rapor yoğunluğu U2OS hücreleri için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, diğer hücre tipleri kullanıldığında, uygun cell numaraları ampirik olarak tespit edilmesi gerekecektir.

Biz son zamanlarda protein cdGAP sinyalizasyon fokal adezyon mechanosensing düzenler ve 11 durotaxis nasıl incelemek için bu testte kullandık. 15 - Açıkça, bu tür, aynı zamanda durotaxis 13 düzenlenmesine katkıda bulunabilir ve böylece, mekanik sinyal dahil olur ve hücre iskeletinin protein ticareti bileşenleri ve iyon kanalları gibi fokal yapışmalarda, ek olarak, çok sayıda hücre bileşenleri bulunmaktadır. Bu bileşenlerin her biri kolaylıkla içindeki RNAi yaklaşımları kullanarak sistemde değerlendirilebilir. Ek olarak, bu deney, çeşitli farmakolojik aktivatör ya da inhibitör tanıtılması çok müsait. Deney, aynı zamanda, protein dinamikleri ve uzay-zaman aktivasyonu çalışma, FRET veya sıkı bağlamak yaklaşımlar ile kombinasyon halinde bu gibi floresan etiketli proteinler dahil edilmesi gibi analiz daha karmaşık formlar, izin vermek için adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH R01 GM47607, CA163296 ve CET NSF 1334493 tarafından desteklenmektedir. Biz yazının eleştirel okuma Turner laboratuar üyelerine teşekkür ediyorum. Bu raporda gösterilen tüm veriler Wormer ve ark., 2014 11 izni ile yeniden üretildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 3097358-1004 Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm Fisher Scientific 12-545-82
6-well plate Celltreat 229106
DMEM Cellgro 15-017-CM
L-Glutamine Cellgro 25-005-CI
Sodium Pyruvate Fisher Scientific BP356-100
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
Fibronectin BD Biosciences 610077
PBS Invitrogen 21600-044
Falcon tubes Celltreat 229456
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Bovine Serum Albumin Sigma A7906
U2OS cells ATCC HTB-96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  3. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, (5), 891-906 (2009).
  4. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, (1), 144-152 (2000).
  5. Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25, (5), 619-626 (2013).
  6. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88, (1), 39-48 (1997).
  7. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3, (5), 466-472 (2001).
  8. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124, (8), 1195-1205 (2011).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  10. Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13, (12), 1457-1465 (2011).
  11. Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9, (3), e91815 (2014).
  12. Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (18), 6933-6938 (2012).
  13. Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21, (1), 35-47 (2011).
  14. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117, (12), 2449-2460 (2004).
  15. Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9, (3), 351-363 (2005).
Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi<em&gt; İn Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. J. Vis. Exp. (102), e52949, doi:10.3791/52949 (2015).More

Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. J. Vis. Exp. (102), e52949, doi:10.3791/52949 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter