Summary
El objetivo de este trabajo es describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Presentamos 3 protocolos para llevar a cabo simple y fiable instilaciones de pulmón, fijación, y mediciones de volumen pulmonar.
Abstract
La capacidad de infundir agentes vivos, células o productos químicos directamente en el pulmón sin herir o matar a los ratones es una herramienta importante en la investigación del cáncer de pulmón. Aunque hay un número de métodos que se han publicado que muestra cómo intubar ratones para las mediciones de función pulmonar, ninguno es sin problemas potenciales para la instilación traqueal rápida en grandes cohortes de ratones. En el presente trabajo, un método sencillo y rápido se describe que permite a un investigador para llevar a cabo tales instilaciones de una manera eficiente. El método no requiere de herramientas especiales o iluminación y se puede aprender con muy poco práctica. Se trata de anestesiar un ratón, haciendo una pequeña incisión en el cuello para visualizar la tráquea, y después la inserción de un catéter intravenoso directamente. La pequeña incisión se cierra rápidamente con adhesivo tisular, y los ratones se les permite recuperarse. Un estudiante calificado o técnico pueden hacer instilaciones a una tasa promedio de 2 min / ratón. Una vez tque esté establecido el cáncer, hay con frecuencia una necesidad de un análisis histológico cuantitativo de los pulmones. Tradicionalmente patólogos generalmente no se molestan en estandarizar la inflación pulmonar durante la fijación, y los análisis a menudo se basan en un sistema de puntuación que puede ser muy subjetiva. Si bien esto puede en algún momento ser lo suficientemente adecuada para las estimaciones brutas del tamaño de un tumor de pulmón, cualquier cuantificación estereológicos adecuada de la estructura de pulmón o células requiere un procedimiento de fijación reproducible y la medición del volumen pulmonar subsiguiente. Aquí se describen los procedimientos fiables simples, tanto para la fijación de los pulmones bajo presión y luego medir con precisión el volumen pulmonar fijo. El único requisito es una balanza de laboratorio que es precisa en un rango de 1 mg-300 g. Los procedimientos que aquí se presentan de este modo podrían mejorar en gran medida la capacidad de crear, tratar y analizar los cánceres de pulmón en ratones.
Introduction
Por una serie de razones, cáncer de pulmón no ha sido ampliamente estudiado en el ratón. Una razón para esto es que el acceso a los pulmones es muy difícil in vivo, y el análisis cuantitativo de los pulmones fijos no se hace comúnmente. Los métodos descritos en este documento están diseñadas para remediar esta situación. Los objetivos de este documento son para describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Aunque ninguno de estos enfoques son totalmente nuevo, que no se han presentado juntos como métodos independientes de la forma simplificada como se describe aquí.
Ha habido un número de manuscritos que han descrito métodos para la intubación del pulmón de ratón principalmente con el propósito de hacer la función pulmonar de repetición o lavado broncoalveolar en ratones individuales en estudios longitudinales. Dado que el papel original, ha habido varios otros papeles que han descrito diferentes enfoques para mouse intubación 1 -9. Si bien todos estos métodos se pueden utilizar con éxito, por lo general requieren un entrenamiento considerable y no son a menudo sin una tasa de fracaso no trivial. Además, con el fin de llevar a cabo mediciones de la función pulmonar, la cánula tiene que encajar herméticamente la tráquea lo suficiente para que no haya fugas de aire. Sin embargo, otro uso práctico para la intubación es para administrar agentes específicos (células de cáncer u otros insultos) o fármacos terapéuticos directamente al pulmón. Tal procedimiento no requiere una cánula de ajuste apretado ni ningún equipo sofisticado de la función pulmonar. La novela característica de este método se muestra aquí implica un procedimiento quirúrgico menor que permite que la intubación sin ninguna posibilidad de la cánula de entrar en el esófago. Este enfoque simple permite la intubación exitosa con relativamente poca formación o experiencia. Nada menos que 30 ratones / hr pueden ser tratados con este enfoque con una tasa de fracaso cercanos a cero.
Una vez tque los ratones están listos para ser sacrificados, los pulmones lesionados o cancerosas luego se puede quitar para histológico y análisis patológico. Sin embargo, con el fin de cuantificar correctamente las variables histológicas para la comparación con otros pulmones, es esencial para estandarizar los procedimientos de fijación y cuantificar adecuadamente el volumen pulmonar fijo 10. En este trabajo se describe en detalle los procedimientos simples que permiten a los procedimientos de fijación estandarizados, así como una manera de medir el volumen pulmonar fijo. El volumen es una métrica esencial en la cuantificación de la histología, ya que sin dicha determinación de volumen, sólo densidades relativas se pueden medir 10. Una vez que se conoce el volumen de pulmón, sin embargo, las mediciones absolutas de células y otras mediciones estructurales en el pulmón pueden ser cuantificados.
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Protocol
El siguiente protocolo describe un sistema que funciona bien en 20-35 g ratones. El método podría ser fácilmente adaptable a los ratones grandes o más pequeñas simplemente cambiando el tamaño del catéter. Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins.
1. La instilación de pulmón
- Seleccionar una de una pulgada de largo 20 g cánula intravenosa comercial a utilizar para la intubación.
- Modificar la punta del catéter de flexión manualmente para generar una ligera curvatura en la punta como se ilustra en la Figura 1.
- Anestesiar al ratón con una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg) inyectada IP, y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo. Aplicar la pomada veterinaria en los ojos inmediatamente después de la anestesia. Inmediatamente después de la anestesia se aplican pomada de veterinaria en los ojos y dan carprofeno (5-10 mg / kg SQ) para analgesia post quirúrgico y la instilación.
- Coloque el mouse supina sobre una plataforma inclinada. Como se muestra en la Figura 2, una gran aglutinante de oficina con lazos de sutura grabada el funciona perfectamente bien.
- Afeitarse la parte ventral del cuello y limpiar y desinfectar la zona del cuello con un 70% de alcohol. Con nuevos de látex y guantes sin pólvora, utilice instrumentos quirúrgicos desinfectados con un 70% de alcohol.
- Usando tijeras afiladas hacen una pequeña incisión quirúrgica en el cuello de aproximadamente 12 mm por debajo del incisivo inferior.
- Con unas pinzas tire suavemente de la piel en el cuello caudalmente hasta que la pared ventral de la tráquea puede ser visto.
- Retraer la lengua suavemente e inserte la cánula con la punta doblada inclinada hacia la superficie ventral del ratón. Al igual que en 1.4, tire suavemente sobre la piel en el cuello, e insertar la cánula en la tráquea.
NOTA: Con un poco de práctica, el catéter será visible en movimiento por la tráquea. Si se va en el esófago, entonces no habrá ninguna observación visual del movimiento del catéter. No hay incisionesse hacen en la tráquea. - Una vez que el catéter se ve en la tráquea en el cuello, lo adelantó unos 5 mm para ser fiable pasado las cuerdas vocales, pero todavía muy por encima de la carina.
- Prepárese para inculcar hasta 50 l de líquido mediante la inyección a través del catéter con una punta de pipeta de carga de gel. Coloque la punta en el conector luer, pero antes de inyectar mirada cuidadosamente para observar el movimiento del fluido en el sincrónica punta con la respiración del ratón. Entonces inyectar el instilado.
- Con una jeringa de 1 ml, inmediatamente hacer un relativamente rápida inflación de 0,6 ml de aire a los pulmones a través del catéter para ayudar a distribuir la profunda líquido en los pulmones. Retire la cánula.
- Retire la cánula.
- Use una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato para cerrar la pequeña herida quirúrgica según las instrucciones prospecto de Vetbond. Coloca los ratones en jaulas individuales y controlar visualmente hasta que se despiertan y comportarse normalmente sin ninguna indicación de discomfort.
2. Fijación de pulmón
NOTA: una vez que todos los procedimientos experimentales se realizaron en un ratón, los pulmones pueden ser preparado para el procesamiento histológico por fijación con formaldehído (o cualquier otro fijador se desea).
- Sacrificar el ratón con un procedimiento IACUC aceptable. Para el ratón representativo se muestra en el video, se utiliza dislocación cervical de un ratón anestesiado.
- Realice una traqueotomía (si no lo ha hecho) mediante la exposición quirúrgica de la parte ventral de la tráquea, lo que hace un pequeño corte, y la inserción de una punta de la aguja talón de 18 G en la tráquea, y atar con hilo.
- Abra cuidadosamente el tórax con una incisión en la línea media, cortar el diafragma, y quitar las paredes laterales de tórax para exponer los pulmones.
- Conectar el extremo luer de la aguja a un depósito en un soporte de anillo que contiene formaldehído. Vea la Figura 3.
- Establezca la superficie superior del formaldehído 25 cm por encima del nivel del mouse. Vea la Figura 3. A continuación asegúrese de que no hay aire en el tubo de fijación mediante la ejecución de fluido fuera el final de una llave de paso. Conectar el extremo luer de la cánula traqueal a la tubería de depósito. Abra la llave de paso para inflar los pulmones con el formaldehído. Deja los pulmones bajo presión durante al menos 20 min.
- Abra la llave de paso para inflar los pulmones con el formaldehído. Deja los pulmones bajo presión durante al menos 20 min.
- A continuación, atar la tráquea más allá del extremo de la aguja trozo. Puede ayudar a retroceder lentamente en la aguja para exponer más de la tráquea uncannulated. Cuando atada con seguridad, retire la llave de paso.
- Diseccionar cuidadosamente los pulmones.
- Coloca los pulmones en formaldehído durante la noche. Tiempos más largos están muy bien, y algunas manchas o procedimientos pueden especificar tiempos específicos. También cualquier otros fijadores líquidos, tales como z-fix se pueden utilizar para la instilación y la inmersión.
- Antes de su posterior procesamiento histológico, midael volumen pulmonar fija como se describe a continuación.
3. Medición del volumen pulmonar fijo
- Medir el volumen de pulmón utilizando el principio de Arquímedes, como se ilustra en la Figura 4. Retire el pulmón fija desde el formaldehído y diseccionar el corazón y cualquier otro tejido no pulmonar.
- Utilice un dispositivo de fabricación casera sencilla previamente construido soporte de alambre que se utiliza para mantener los pulmones completamente bajo el agua.
NOTA: Este dispositivo debe ser compatible con lo que el equilibrio se está utilizando. Un dispositivo típico se muestra en la Figura 5 está hecho de pipetas de plástico y fina (20 G) de alambre. Este sistema funciona bien con el saldo utilizado en el vídeo, pero podría ser fácilmente adaptado a la mayoría de balanzas de laboratorio. - Coloque un vaso con ≈200 ml de agua en el equilibrio y la tara con la jaula de soporte en su lugar en el agua. Ver Figura 6 Retire la jaula de metal.; colocar el pulmón en la superficie del agua y presione bajo el aguacon la jaula.
- Anotar el peso en la balanza. Este número refleja el volumen de agua desplazada y es así una medida directa del volumen pulmonar. Tenga cuidado para asegurarse de que el pulmón o de sutura o cualquier parte de la jaula de alambre no toque los lados o fondo del vaso.
- Para mayor precisión, repetir la medición. Retire el pulmón del agua y seca en un pañuelo de papel. Tarar el vaso con jaula en lugar de nuevo y repetir la medición del volumen pulmonar. Las dos mediciones de volumen deben entonces ser promediados.
NOTA: Si los pulmones se dejan en el formalina durante más de aproximadamente una semana, el aire en los pulmones se disolverá en el líquido. Cuando esto sucede, el pulmón se hundirá, por lo que ya no es necesario el uso de cualquier dispositivo como en la Figura 5 para mantener el pulmón sumergido. En tal caso, el volumen se puede medir por simplemente manteniendo el pulmón por uno de los hilos de sutura hasta que esté completamente sumergida como se ilustra en la Figura 4.
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Representative Results
El procedimiento se describe en el primer protocolo no por sí mismo conducir a ningún resultado generalizadas. Sólo se describe un medio muy fiable para inculcar sustancias directamente en la tráquea. La figura 7 muestra un ejemplo de un pulmón en el que se instiló azul de tripano con el método descrito aquí. Hay una amplia distribución del colorante, similar a lo que se ha visto con otros colorantes o trazadores dadas directamente en la tráquea o los ratones 11,12. También hemos utilizado este método para entregar ya sea bleomicina o elastasa en el pulmón, lo que resulta en la fibrosis generalizada o enfisema, respectivamente.
Los procedimientos descritos para la cuantificación de los cambios estructurales en los pulmones postmortem proporcionan datos sobre los volúmenes pulmonares fijos a una presión de 25 cm H 2 O. Tales mediciones de volumen son esenciales para convertir posteriores mediciones histológicas imparciales de densidades de células o tejidos en el número total de 10. Este documento solamente deescribas los medios para obtener un volumen pulmonar muy precisa. En nueve de 10-12 semanas de edad sana ratones Balb / c se midió una media (± SD) del volumen pulmonar fijo de 0,82 ± 0,09 ml con el volumen pulmón izquierdo siendo aproximadamente el 30% del total. En ratones Balb / c que figura 3 U de elastasa pancreática (con el método descrito en este documento) para generar el enfisema experimental, el volumen fijo de pulmón se incrementaron a 1,15 ± 0,13 ml, con la fracción restante pulmón izquierdo en el 30%.
Figura 1: catéter intravenoso con punta ligeramente curvada utilizado para la instilación.
Figura 2: inclinado carpeta de 3 anillos utilizados para apoyar los ratones para la intubación Esta carpeta creada para sostener 3 ratones..
Figura 3:. Formalina depósito lleno en el anillo de pie conectado al ratón, con la parte superior del líquido ajustado 25 cm por encima del ratón Esta fijación debe normalmente realizarse en una campana de humos.
Figura 4:. Principio de Arquímedes El peso del agua desplazada por un objeto sumergido es igual al volumen del objeto. Debido a que el pulmón normalmente retiene un poco de aire residual, se necesita un dispositivo como en la Figura 5 para mantener el pulmón totalmente sumergido.
Figura 5: Lab hizo de soporte para mantener los pulmones por completo bajo el agua de dispositivos.construido a partir de pipetas de plástico y alambre de metal.
Figura 6: Balanzas de laboratorio con el cubilete y el dispositivo de inmersión tarado listo para la medición del volumen pulmonar.
Figura 7: Ejemplo de un pulmón dado de azul de tripano a través del catéter intubación.
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Discussion
Los procedimientos descritos aquí tienen varias ventajas. En primer lugar el equipo requerido es sencillo y barato. En segundo lugar, la intubación puede hacerse rápidamente con pocos errores. En tercer lugar, la capacidad de fijar los pulmones a una presión constante, y luego medir el volumen pulmonar fijo permite la cuantificación adecuada de estructuras o células en el pulmón 10.
Una desventaja posible a la intubación es la cirugía menor. Esto puede limitar la capacidad de repetir el procedimiento si se requiere una instilación 2 nd. Sin embargo, con la cirugía cuidadosa y la aplicación del adhesivo que hemos sido capaces de hacerlo de forma rutinaria una segunda instilación una o dos semanas más tarde. Si se requieren instilaciones repetidas continuas o si se necesitan pruebas de función pulmonar repetidas, otro enfoque de la intubación puede ser más deseable 13,14.
Al hacer de la instilación, hay varias cuestiones prácticas que deben mencionarse. Es importante to sea lo más suave posible con el movimiento de la lengua en la apertura inicial de la boca. Si se utilizan fórceps, los consejos deben ser cubiertas con tubo de goma, ya que es fácil de herir a la lengua, y esto puede llevar a la muerte del ratón. Aunque los métodos aquí fueron diseñadas para la intubación de los ratones de más de 6 semanas, que fácilmente podrían adaptarse a los ratones más jóvenes.
Nuestro procedimiento de instilación fue diseñado inicialmente como una alternativa al método de la aspiración orofaríngea 11. Si bien este último método puede ser fácilmente aprendido, el volumen real entregado al pulmón sigue siendo incierto, ya que algunos de los instilado permanece en la faringe y es tragada. Con una instilación directa en la tráquea y la inflación pulmonar posterior como se demuestra aquí, el instilado está directamente entregado al pulmón. Vale la pena señalar que, aunque es posible utilizar intubación para entregar sustancias directamente a la tráquea 11,12, tales intubación puede damage la vía aérea superior o cuerdas vocales, y en general requiere un nivel mucho más alto de formación para garantizar la tasa de éxito del 100% que nuestro procedimiento permite.
El procedimiento de fijación se describe es similar a la que usan muchos investigadores. A menudo existe cierta variabilidad en la presión de inflado utilizado para el fijador, pero creemos que 25 cm H 2 O es un compromiso razonable que mantiene el pulmón completamente inflado y sin posibles daños causados por el exceso de la inflación. Cabe señalar, sin embargo, que si bien puede parecer que un pulmón inflado con fluido a 25 cm H 2 O debe estar en un volumen cercano a lo que la capacidad pulmonar total podría ser con la inflación de aire a 35 cm H 2 O, esto es lejos de la verdad. De hecho, el inflado con fijador generalmente resulta en un volumen al 70% de la capacidad pulmonar 15,16 aire. Y con el procesamiento posterior con inclusión en parafina, el volumen pulmonar efectiva se ve en las secciones histológicas es probable continuación ca residual funcionalpacidad (FRC). El fijador más común es la formalina o z-fix, pero para la tinción inmunológica, a menudo se requiere una mezcla de glutaraldehído. Los investigadores tendrán que elegir un fijador en función de lo que se necesita ser manchado, pero más discusión del fijador óptima está más allá del alcance de este documento métodos.
Con el fin de hacer un análisis cuantitativo adecuado de secciones histológicas que es esencial contar con una medición del volumen pulmonar 10. Aunque es posible conseguir el volumen pulmonar de la secuencia completa de secciones en serie (el método Cavalieri), en los pulmones del ratón es a menudo más simple para medir simplemente el volumen pulmonar fija como hemos descrito en este documento y video. El procedimiento se describe tarda sólo segundos para hacer y se debe hacer de forma rutinaria con todas las fijaciones de pulmón. Tenga en cuenta, sin embargo, que el volumen así medida no da cuenta de ninguna contracción con posterior procesamiento y la incrustación, y si esto es importante, el método de Cavalieri debeser usado. Una nota final con respecto a esta medida de volumen fijo es que la fracción del volumen pulmonar en el pulmón izquierdo en los pulmones fijos es significativamente menor que la que se ha medido in vivo. TC de los pulmones en vivo de dos cepas de ratones en la capacidad residual funcional mostró el pulmón izquierdo en alrededor de 40% del total de 17, mientras que por lo general sólo el 30% en las mediciones anteriores de pulmones fijos a 25 cm H 2 O . En la actualidad, no entendemos por qué esto debería ser tan diferentes, pero hay que tener en cuenta al analizar los cambios en los análisis histológico cuantitativo. Con respecto a los estudios de cáncer de pulmón, que tienen una medida de volumen pulmonar permite a un investigador para normalizar correctamente los datos en desnsities químicas específicas o la densidad de los diversos tipos de células a los números absolutos en todo el tumor o todo el pulmón.
En resumen, el procedimiento de intubación describir aquí es barato de fabricary fácil de usar, y debe permitir a la mayoría de los investigadores y técnicos de laboratorio para aprender rápidamente a inculcar éxito líquidos en los pulmones de ratones con relativamente poca experiencia. Además, el procedimiento de fijación y el volumen pulmonar de medición para el análisis histológico de los pulmones proporcionan un medio para el análisis repetible y cuantitativa adecuada de las células pulmonares y la estructura de pulmón.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Balance | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | Other balances can be used if they have a range of 1-300 g |
| 20 g Luer intravenous catheter | Insylte | Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva | |
| 500 ml laboratory bottle | Various | Several other possible vendors |
References
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab animal. 35, 39-42 (2006).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G.
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D.
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).
- Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives. Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).
- Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. In vivo measurement of lung volumes in mice. Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).
