Inddrypning og fikseringsmetoder Nyttige i muselunge Cancer Research

Summary

Målet med dette papir er at beskrive enkle metoder, der i høj grad vil hjælpe i setup og analyse af muselunger med lungekræft eller andre patologier. Vi præsenterer 3 protokoller enkelt og pålideligt at udføre lunge instillationer, fiksering og lunge volumen målinger.

Abstract

Evnen til at indpode levende midler, celler eller kemikalier direkte i lungerne uden at beskadige eller dræbe musene er et vigtigt redskab i lungekræft forskning. Selv om der er en række metoder, der er blevet offentliggjort viser, hvordan intubationstid mus for lungefunktionen målinger, ingen er uden potentielle problemer for hurtig tracheal instillation i store kohorter af mus. I nærværende papir, er en enkel og hurtig metode beskrevet som muliggør en investigator at udføre sådanne instillationer på en effektiv måde. Metoden kræver ingen specielle værktøjer eller belysning og kan læres med meget lidt praksis. Det indebærer at bedøve en mus, hvilket gør et lille snit i nakken for at visualisere luftrøret, og derefter indsætte en intravenøs kateter direkte. Den lille snit er lukkede hurtigt med vævet klæbemiddel og musene fik lov til at komme sig. En dygtig studerende eller tekniker kan gøre instillationer til en gennemsnitlig hastighed på 2 min / mus. Når tHan cancer er etableret, er der ofte behov for en kvalitativ analyse af histologiske lungerne. Traditionelt patologer normalt ikke gider at standardisere lunge inflation under fiksering og analyser er ofte baseret på et pointsystem, der kan være ganske subjektivt. Mens dette engang kan være tilstrækkeligt tilstrækkelige til grove skøn over størrelsen af ​​en lunge tumor, enhver ordentlig stereologiske kvantificering af lungestrukturen eller celler kræver en reproducerbar fikseringsproceduren og efterfølgende måling lungevolumen. Her beskriver vi enkle pålidelige procedurer for både fastsættelse lungerne under tryk og derefter nøjagtig måling lunge volumen fast. Det eneste krav er et laboratorium balance, er nøjagtig over et område på 1 mg-300 g. Procedurerne præsenteres her kunne derfor i høj grad forbedre evnen til at skabe, behandle og analysere lungekræft i mus.

Introduction

For en række årsager, lungekræft ikke har været meget undersøgt i mus. En af grundene til dette er, at er meget vanskelig adgang til lungerne in vivo og kvantitativ analyse af faste lunger er ikke almindeligt gjort. Beskrevet i dette papir metoder er designet til at afhjælpe denne situation. Målene heri er at beskrive simple metoder, der i høj grad vil hjælpe til opsætning og analyse af muselunger med lungecancer eller andre patologier. Mens ingen af ​​disse metoder er helt ny, er de ikke blevet præsenteret sammen som enkeltstående metoder i den forenklede måde som beskrevet her.

Der har været en række af manuskripter, der har beskrevet fremgangsmåder til intubation af muselunge primært med det formål at gøre gentagen lungefunktion eller bronchoalveolær udskylning i individuelle mus i langsgående undersøgelser. Siden den oprindelige papir, har der været flere andre papirer, der har beskrevet forskellige tilgange til musene intubation ^{1 -9.} Mens alle disse metoder kan anvendes med succes, de normalt kræver betydelig træning, og er ofte ikke uden en nontrivial fejlrate. Desuden, med henblik på at udføre målinger af lungefunktionen, kanylen skal passe luftrøret tæt nok til, at der ikke er nogen utætheder. , En anden praktisk anvendelse til intubation er imidlertid at levere specifikke midler (cancerceller eller andre fornærmelser) eller terapeutiske lægemidler direkte til lungerne. En sådan procedure kræver ikke en tætsluttende kanyle eller nogen sofistikeret lungefunktion udstyr. Det hidtil ukendte træk ved denne fremgangsmåde er vist her involverer et mindre kirurgisk procedure, der gør det muligt for intubation uden mulighed for kanylen ind i spiserøret. Denne enkle tilgang gør det muligt vellykket intubation med relativt lidt uddannelse eller erfaring. Så mange som 30 mus / h kan behandles ved hjælp af denne metode med en fejlrate nærmer sig nul.

Når than mus er klar til at blive aflivet, tilskadekomne eller kræft lunger kan derefter fjernes til histologisk og patologisk analyse. , Med henblik på korrekt kvantificere eventuelle histologiske variabler til sammenligning med andre lunger, er det vigtigt at standardisere de fikseringen og ordentligt kvantificere lungevolumen ¹⁰ fast. Dette papir beskriver detaljeret de enkle procedurer, som giver standardiserede fikseringen samt en måde at måle lungevolumen fast. Lydstyrken er en væsentlig parameter i kvantificeringen af histologi, da, kan måles ¹⁰ uden en sådan volumen bestemmelse kun relative tætheder. Når lungevolumen er imidlertid kendt, kan derefter kvantificeres absolutte målinger af celler og andre strukturelle målinger i lungen.

Protocol

Følgende protokol beskriver et system, der fungerer godt i 20-35 g mus. Fremgangsmåden kunne nemt kunne tilpasses til større eller mindre mus ved blot at ændre kateteret størrelse. Alle dyr protokoller blev godkendt af Johns Hopkins University Animal Care og brug Udvalg.

1. Lung Instillation

1. Vælg en kommerciel én-tommer lange 20 g intravenøs kanyle bruge til intubation.
2. Ændre kateterspidsen manuelt at bøje det til at generere en let krumning ved spidsen, som illustreret i figur 1.
3. Bedøver musen med en blanding af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (15 mg / kg) injiceret IP, og bekræft anæstesi ved fraværet af refleks bevægelse. Påfør veterinær salve på øjnene umiddelbart efter anæstesi. Umiddelbart efter anæstesi anvende veterinær salve på øjnene og give carprofen (5-10 mg / kg SQ) for post kirurgisk og instillation analgesi.
4. Placer mouSE liggende på en skrå platform. Som vist i figur 2, et stort kontor bindemiddel med sutur sløjfer tapede på fungerer udmærket.
5. Barbere den ventrale del af halsen og rengøre og desinficere nakken med 70% alkohol. Med nye Latex- og pulverlakerede gratis handsker, brug kirurgiske instrumenter desinficeret med 70% alkohol.
6. Ved hjælp af en skarp saks lave et lille kirurgisk snit i nakken ca. 12 mm under den nedre fortand.
7. Med en pincet forsigtigt trække huden i nakken kaudalt indtil den ventrale væg af luftrøret kan ses.
8. Forsigtigt trække tungen og indsætte kanylen med bøjet spids vippet mod den ventrale overflade af musen. Som i 1.4, træk forsigtigt på huden i nakken, og sæt kanylen i luftrøret.
   BEMÆRK: Med lidt øvelse, vil kateteret være synlig bevæger sig ned i luftrøret. Hvis det går i spiserøret, så vil der være nogen visuel observation af kateterets bevægelse. Ingen indsniter lavet i luftrøret.
9. Når kateteret ses i luftrøret i halsen, avancerede det omkring 5 mm til at være pålideligt bestået stemmebånd, men stadig et godt stykke over carina.
10. Forbered at bibringe op til 50 pi væske ved injektion gennem kateteret med en gel loading pipettespids. Placer spidsen i luer hub, men før injektion se omhyggeligt at observere bevægelse af væske i spidsen synkront med musens vejrtrækning. Så injicere inddrypningspræparat.
11. Med en 1 ml sprøjte, straks gøre en relativt hurtig inflation på 0,6 ml luft ned i lungerne gennem kateteret for at hjælpe fordele væsken dybt i lungerne. Fjern kanylen.
12. Fjern kanylen.
13. Brug en lille mængde af cyanoacrylat lim til at lukke den lille operationssåret som pr indlægssedlen instruktioner til VetBond. Placer mus i individuelle bure og visuelt overvåge dem, indtil de vågner op og opfører sig normalt uden angivelse af discomfort.

2. Lung Fiksering

BEMÆRK: Når alle eksperimentelle procedurer er udført i en mus, kan lungerne klargøres til histologisk behandling af fiksering med formaldehyd (eller et andet ønsket fiksativ).

1. Sacrifice musen med en IACUC acceptabel procedure. For det repræsentative mus vist i videoen, er cervikal dislokation af en bedøvet mus anvendes.
2. Udfør en trakeostomi (hvis det ikke allerede er gjort) ved kirurgisk at udsætte den ventrale side af luftrøret, hvilket gør et lille snit, og indsættelse af en 18 G stub nålespidsen i luftrøret, og binde det med tråd.
3. Åbn forsigtigt brystkassen med en midtlinjeincision, skåret væk mellemgulvet, og fjern de laterale bryst vægge til at eksponere lungerne.
4. Tilslut luer ende af nålen til et reservoir på en ring stativ indeholder formaldehyd. Se figur 3.
5. Indstil oversiden af ​​formaldehyd 25 cm over niveauet af mouSE. Se Figur 3. Næste sørge for der er ingen luft i fiksering slangen ved at køre væske ud i slutningen af en stophane. Tilslut luer ende af trachealkanylen til reservoiret slangen. Åbn stophanen at puste lungerne med formaldehyd. Lad lungerne under tryk i mindst 20 minutter.
6. Åbn stophanen at puste lungerne med formaldehyd. Lad lungerne under tryk i mindst 20 minutter.
7. Dernæst hæfte luftrøret ud over enden af ​​nålen stub. Det kan hjælpe til at trække sig tilbage langsomt på nålen for at blotlægge flere af uncannulated luftrøret. Når bundet forsvarligt, fjerne stophane.
8. Dissekere forsigtigt lungerne.
9. Placer lungerne i formaldehyd natten over. Længere tider er fint, og nogle pletter eller procedurer kan specificere bestemte tidspunkter. Også andre flydende fikseringsmidler, såsom z-fix kan anvendes til instillation og nedsænkning.
10. Før yderligere histologiske behandling, måleden faste lungevolumen som beskrevet i det følgende.

3. Måling af den faste Lunge Volume

1. Mål lungevolumenet hjælp Archimedes princip som illustreret i figur 4. Fjern det faste lunge fra formaldehyd og dissekere hjerte og en hvilken som helst anden ikke-lungevæv.
2. Bruge et tidligere konstrueret simpel hjemmelavet wire støtteindretning som anvendes til at holde lungerne helt under vand.
   BEMÆRK: Denne enhed skal gøres kompatibel med uanset hvilken balance bliver brugt. En typisk indretning er vist i figur 5 er fremstillet af plast pipetter og tynd (20 G) ledning. Dette system fungerer godt med den balance, der anvendes i video, men kunne let tilpasses til de fleste laboratorievægte.
3. Placer et bæger med ≈200 ml vand på balance og tara med understøttende buret på plads i vandet. Se figur 6 Fjern metal bur.; placere lungen på vandoverfladen og tryk under vandmed buret.
4. Noterer vægten på balance. Dette nummer afspejler mængden vand, der fortrænges, og er således et direkte mål for lungevolumen. Vær omhyggelig med at sørge for, lungerne eller sutur eller en del af wiren buret ikke rører siderne eller bunden af ​​bægeret.
5. For nøjagtighed, gentage denne måling. Fjern lungen fra vandet, og tør på en væv. Tarere bæger med buret på plads igen, og gentag målingen lunge volumen. De to volumenmålinger bør derefter gennemsnit.
   BEMÆRK: Hvis lungerne er tilbage i formalin i mere end en uge, vil luften i lungerne opløses i væsken. Når dette sker, vil lungerne vask, så det er ikke længere nødvendigt at anvende enhver indretning som i figur 5 for at holde lungerne neddykket. I så fald kan måles mængden ved blot ved at holde lungerne af en af suturen strenge indtil den er helt neddykket som illustreret i figur 4.

Representative Results

Proceduren beskriver i den første protokol ikke i sig selv føre til nogen generelle resultater. Det beskriver kun en meget pålidelig middel til at bibringe stoffer direkte ind i luftrøret. Figur 7 viser et eksempel på en lunge, hvor trypanblåt blev indpodet med den her beskrevne fremgangsmåde. Der er udbredt fordeling af farvestoffet, svarende til hvad der er blevet observeret med andre farvestoffer eller sporstoffer gives direkte ind i trachea eller mus ^11,12. Vi har også anvendt denne metode til at levere enten bleomycin eller elastase til lungen, hvilket resulterer i udbredt fibrose eller emphysem, henholdsvis.

De beskrevne til at kvantificere de strukturelle ændringer i postmortem lunger procedurer giver oplysninger om de faste ved et tryk på 25 cm H ₂ O. lungevolumener Sådanne volumenmålinger er afgørende for at konvertere efterfølgende uvildige histologiske målinger af celle- eller væv densiteter i det samlede antal ^10. Dette papir kun deskriftkloge midler til at få en meget nøjagtig lungevolumen. I ni 10-12 uger gamle sunde Balb / c-mus målte vi en gennemsnitlig (± SD) fast lunge volumen på 0,82 ± 0,09 ml med lungevolumen venstre er ca. 30% af det samlede beløb. I Balb / c-mus gives 3 U pankreaselastase (der er beskrevet i dette dokument metode) til at generere eksperimentelle emfysem, lunge fast volumen øges til 1,15 ± 0,13 ml, med venstre lunge resterende fraktion på 30%.

Figur 1: Intravenøs kateter med krum spids let anvendes til instillation.

Figur 2: Skrå 3-ringbind bruges til at understøtte mus for intubation Dette bindemiddel sat op til at holde 3 mus..

Figur 3:. Formalin fyldte reservoir på ringen står forbundet til mus, med toppen af fluid sæt 25 cm over musen Denne fiksering bør normalt ske i et stinkskab.

Figur 4:. Archimedes Princip vægt vand, der fortrænges af en neddykket genstand lig volumenet af genstanden. Fordi lungerne normalt bevarer nogle resterende luft, er en anordning som i figur 5 nødvendig for at holde lungerne fuldt neddykket.

Figur 5: Lab gjort støtte til at holde lungerne helt under vandet enhed.konstrueret ud fra plastpipetter og metaltråd.

Figur 6: Laboratorium balance med bæger og tareret nedsænkning enhed klar til måling lunge volumen.

Figur 7: Eksempel på en lunge givet trypanblåt gennem intubation kateter.

Discussion

De her beskrevne procedurer har flere fordele. Først det nødvendige udstyr er enkel og billig. For det andet kan intubation hurtigt gøres med få fejl. For det tredje, evnen til at løse lungerne ved et konstant tryk, og derefter måle lungevolumen fast tillader korrekt kvantificering af strukturer eller celler i lungen ^10.

En mulig nedadrettede til intubation er den mindre operation. Dette kan begrænse muligheden for at gentage proceduren, hvis en ^2. instillation er påkrævet. Men med omhyggelig kirurgi og anvendelse af klæbemidlet, vi har været i stand til rutinemæssigt at gøre en anden instillation en uge eller to senere. Hvis vedvarende gentagne instillationer er påkrævet, eller hvis gentagne test af lungefunktionen er nødvendige, kan en anden intubation tilgang være mere ønskeligt ^13,14.

Ved at gøre det instillation, er der flere praktiske spørgsmål, der bør nævnes. Det er vigtigt to være så skånsom som muligt med bevægelse af tungen i den indledende åbning af munden. Hvis der anvendes pincet, bør spidserne dækkes med gummislanger, da det er let at skade tungen, og dette kan føre til døden af ​​musen. Selv om de metoder her var designet til intubation af mus ældre end 6 uger, kunne de let tilpasses til yngre mus.

Vores instillation procedure blev oprindeligt designet som et alternativ til metoden for oropharyngeal aspiration ^11. Selv om denne sidstnævnte fremgangsmåde kan let læres, det faktiske volumen leveres til lungen er fortsat usikker, da nogle af inddrypningspræparat forbliver i svælget og bliver slugt. Med en direkte instillation i luftrøret og efterfølgende lunge inflation som vi demonstrerer her, er inddrypningspræparat direkte leveret til lungerne. Det er værd at bemærke, at selv om det er muligt at anvende intubation at levere stoffer direkte til luftrøret ^11,12, kan sådan intubation datroldmand de øvre luftveje eller stemmebånd, og generelt kræver et langt højere niveau af uddannelse for at sikre 100% succesrate, at vores procedure tillader.

Fikseringen procedure, vi beskriver svarer til, hvad mange forskere bruger. Der er ofte en vis variation i dæktryk bruges til fiksativ, men vi føler, at 25 cm H ₂ O er et rimeligt kompromis, der holder lungerne fuldt oppustede uden mulige skader fra over-inflation. Det skal dog bemærkes, at selv om det kan synes, at en lunge oppustet med fluid til 25 cm _H2O bør være ved et volumen tæt på, hvad den samlede lungekapacitet kan være med luft inflation på 35 cm _H2O, er dette langt fra sandheden. Faktisk indblæsning med fiksativ resulterer generelt i et volumen på 70% af luften lungekapacitet ^15,16. Og med efterfølgende behandling med paraffin indlejring, det effektive lunge volumen set i histologiske snit er sandsynligt under funktionel residual capacitet (FRC). Den mest almindelige fixativ formalin eller z-fix, men til immunologisk farvning, er ofte behov for en glutaraldehye blanding. Efterforskere bliver nødt til at vælge en fiksativ afhængigt af hvad der behøver at blive plettet, men yderligere diskussion af den optimale fiksativ ligger uden for rammerne af denne metoder papir.

For at gøre ordentlig kvantitativ analyse af histologiske snit er det vigtigt at have en måling af lungevolumen ^10. Selv om det er muligt at få lungevolumen fra den komplette sekvens af serielle sektioner (Cavalieri metode) i muselunger er det ofte lettere blot at måle lungevolumen fastsættes som vi har beskrevet i dette dokument og video. Den procedure beskriver vi tager kun få sekunder at gøre, og bør rutinemæssigt gøres med alle lunge optagelser. Husk dog, at mængden således målt ikke højde for eventuelle svind med efterfølgende behandling og forankring, og hvis dette er vigtigt, bør Cavalieri metodenanvendes. En sidste bemærkning vedrørende denne måling fast volumen er, at den del af lungen i den venstre lunge i de faste lungerne er betydeligt mindre end det, der er blevet målt in vivo. CT billeddannelse af lungerne in vivo af to stammer af mus på funktionelle restkapacitet viste venstre lunge til at være omkring 40% af den samlede ^17, mens det er generelt kun 30% i de ovenfor nævnte målinger fra lungerne fastsat til 25 cm _H2O . På nuværende tidspunkt har vi ikke forstå, hvorfor det skulle være så forskellige, men det bør holdes for øje, når man analyserer ændringerne i kvantitativ histologiske analyser. Med hensyn til undersøgelser af lungekræft, der har en måling af lunge volumen muliggør en efterforsker til korrekt normalisere data om specifikke kemiske desnsities eller tætheden af ​​forskellige celletyper til absolutte tal i hele tumor eller hele lungen.

Sammenfattende intubation procedure beskriver her er billig at fremstilleog enkelt at bruge, og det bør give de fleste efterforskere og laboranter til hurtigt at lære at kunne pryde væsker i muselunger med relativt lidt erfaring. Hertil kommer, at fikseringen og lungevolumen måling til histologisk analyse af lunger tilvejebringer et middel til korrekt gentagelig og kvantitativ analyse af lungeceller og lungestrukturen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors