Summary
Het doel van dit artikel is om eenvoudige methoden die sterk zal helpen bij de opzet en analyse van de muis longen met longkanker of andere aandoeningen te beschrijven. We presenteren 3 protocollen eenvoudig en betrouwbaar uit te voeren long instillaties, fixatie, en longvolume metingen.
Abstract
De mogelijkheid om live agenten, cellen, of chemicaliën inboezemen direct in de longen zonder verwonden of doden van de muizen is een belangrijk instrument bij longkanker onderzoek. Hoewel er een aantal methoden die zijn gepubliceerd toont hoe muizen intuberen voor longfunctie metingen geen daarvan zonder problemen waarvan de snelle tracheale instillatie in grote cohorten muizen. In dit document, wordt een eenvoudige en snelle methode beschreven dat een onderzoeker in staat stelt dergelijke instillations voeren op een efficiënte wijze. De methode heeft geen speciaal gereedschap of verlichting nodig en kan worden geleerd met zeer weinig praktijk. Het gaat verlamming een muis, een kleine incisie in de nek van de trachea te visualiseren, en vervolgens direct inbrengen van een intraveneuze catheter. De kleine incisie wordt snel afgesloten met weefsel lijm, en de muizen zijn toegestaan om te herstellen. Een ervaren student of technicus kan instillaties doen tegen een gemiddelde koers van 2 min / muis. Eenmaal thij kanker wordt vastgesteld, is er vaak behoefte aan kwantitatieve histologische analyse van de longen. Traditioneel pathologen meestal niet de moeite om de longen inflatie standaardiseren tijdens fixatie en analyses zijn vaak gebaseerd op een scoresysteem dat nogal subjectief kunnen zijn. Hoewel dit soms voldoende toereikend grove schatting van de grootte van een longtumor, een fatsoenlijk stereologische kwantificeren longstructuur of cellen vereist een reproduceerbare fixatie procedure gevolgd longvolume gemeten. Hier beschrijven we eenvoudige betrouwbare procedures voor zowel de vaststelling van de longen onder druk en vervolgens nauwkeurig de vaste longvolume te meten. Het enige vereiste is een laboratoriumbalans die nauwkeurig over een bereik van 1 mg 300 g. De hier gepresenteerde dus procedures kan sterk verbeteren van de mogelijkheid om longkanker te creëren, te behandelen en te analyseren bij muizen.
Introduction
Om een aantal redenen, longkanker is niet uitgebreid bestudeerd bij muizen. Een reden hiervoor is dat de toegang tot de long zeer moeilijk in vivo en kwantitatieve analyse van vaste longen niet algemeen gedaan. De in dit artikel beschreven methoden ontwikkeld om deze situatie te verhelpen. De doelen hierin zijn eenvoudige methoden die sterk zal helpen bij de opzet en analyse van de muis longen met longkanker of andere aandoeningen te beschrijven. Hoewel geen van deze benaderingen is volledig nieuw, zij niet samen voorgesteld als stand-alone werkwijzen die op vereenvoudigde wijze beschreven.
Er zijn een aantal handschriften die werkwijzen beschreven voor intubatie van de muizenlong hoofdzakelijk om hem te doen repeat longfunctie of bronchoalveolaire lavage individuele muizen in longitudinale studies. Sinds die originele papieren, zijn er verschillende andere kranten die verschillende benaderingen beschreven mous geweeste intubatie 1 -9. Hoewel al deze werkwijzen kunnen succesvol worden gebruikt, zij vereisen gewoonlijk aanzienlijke training en vaak niet zonder triviale uitvalpercentage. Bovendien, teneinde longfunctie metingen uitvoeren, de canule moet de trachea voldoende compact te passen, zodat er geen luchtlekkage. Echter, een praktisch gebruik intubatie voor bepaalde agentia (kankercellen of andere beledigingen) of therapeutische middelen rechtstreeks aan de longen. Een dergelijke procedure niet een strakke montage canule noch geavanceerde longfunctie apparatuur. De nieuw kenmerk van deze werkwijze hier gaat om een kleine chirurgische procedure die de intubatie mogelijk maakt zonder mogelijkheid van de canule die in de slokdarm. Deze eenvoudige benadering maakt succesvolle intubatie met relatief weinig opleiding of ervaring. Maar liefst 30 muizen / uur kan worden behandeld met behulp van deze aanpak met een failure rate nadert nul.
Eenmaal thij muizen zijn klaar om te worden geofferd, de gewonde of kanker longen kan dan worden verwijderd voor histologische en pathologische analyse. Echter, om goed gekwantificeerd histologische variabelen voor vergelijking met andere longen, is het essentieel om de fixatie te standaardiseren en de vaste longvolume 10 goed te kwantificeren. Dit document beschrijft in detail de eenvoudige procedures die gestandaardiseerde fixatie alsmede een manier om de vaste longvolume te meten toelaten. Het volume is een essentieel gegeven in de kwantificering van de histologie, omdat zonder zo'n volumebepaling, alleen relatieve dichtheden worden gemeten 10. Zodra het longvolume is echter bekend absolute metingen van cellen en andere structurele metingen in de longen kan dan worden gekwantificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol beschrijft een systeem dat goed werkt in 20-35 g muizen. De werkwijze kan gemakkelijk aan groter of kleiner muizen door eenvoudig de katheter grootte. Alle dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite.
1. Lung Blaasinstillatie
- Selecteer een commerciële inch lange 20 g intraveneuze canule gebruiken voor de intubatie.
- Wijzig de kathetertip handmatig te buigen tot een lichte kromming aan het uiteinde te genereren zoals geïllustreerd in figuur 1.
- Verdoven de muis met een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (15 mg / kg) geïnjecteerd IP en bevestig verdoofd door de afwezigheid van reflex beweging. Solliciteer veterinaire zalf op de ogen onmiddellijk na de anesthesie. Onmiddellijk na verdoving toe te passen veterinaire zalf op de ogen en geef carprofen (5-10 mg / kg SQ) voor post chirurgische en instillatie analgesie.
- Plaats de mouse rugligging op een hellend platform. Zoals getoond in figuur 2, een grote bureaubindmiddel met hechtdraad lussen vastgebonden op werkt perfect.
- Scheren het ventrale deel van de nek en het reinigen en ontsmetten van de nek met 70% alcohol. Met de nieuwe latex- en poedervrije handschoenen, gebruik chirurgische instrumenten gedesinfecteerd met 70% alcohol.
- Met behulp van een scherpe schaar maken een kleine incisie in de hals ongeveer 12 mm onder de onderste snijtand.
- Met een pincet trek de huid in de hals caudaal tot de ventrale wand van de luchtpijp kan zien.
- Zachtjes trekken de tong en steek de canule met de gebogen tip gekanteld in de richting van het ventrale oppervlak van de muis. Zoals in 1.4, trekt u voorzichtig op de huid in de nek, en steek de canule in de luchtpijp.
OPMERKING: Met een beetje oefening, de catheter zichtbaar naar beneden de luchtpijp. Als het gaat in de slokdarm, dan zal er geen visuele waarneming van de beweging van de katheter zijn. Geen insnijdingenworden in de trachea. - Zodra de katheter wordt gezien in de luchtpijp in de hals, geavanceerd het ongeveer 5 mm betrouwbaar zijn voorbij de stembanden, maar nog steeds ruim boven de carina.
- Bereid je voor om inboezemen tot 50 ul van vloeistof door het injecteren door de katheter met een gel laden pipet tip. Plaats de tip in de luer naaf, maar alvorens te injecteren kijk nauwkeurig de beweging van het fluïdum in de acht tip synchroon met de muis ademhaling. Injecteer dan de instillate.
- Met een injectiespuit 1 ml onmiddellijk doe een relatief snelle inflatie van 0,6 ml lucht in de longen door de katheter om de vloeistof te verdelen diep in de longen. Verwijder de canule.
- Verwijder de canule.
- Gebruik een kleine hoeveelheid cyanoacrylaat lijm op de kleine chirurgische wond sluiten volgens bijsluiter instructies Vetbond. Plaats muizen in individuele kooien en ze visueel te volgen totdat ze wakker en gedragen zich normaal gesproken zonder enige indicatie van discomfort.
2. Lung Fixatie
Opmerking: Wanneer alle experimentele procedures worden uitgevoerd in een muis, kan de longen worden klaargemaakt voor histologische verwerking door fixatie met formaldehyde (of elk ander gewenst fixatief).
- Offeren de muis met een IACUC aanvaardbare procedure. Voor representatieve muis in beeld wordt cervicale dislocatie van een verdoofde muis gebruikt.
- Voer een tracheotomie (indien nog niet gedaan) door chirurgisch het blootstellen van de ventrale zijde van de luchtpijp, het maken van een klein sneetje, en het invoegen van een 18 G stomp naald in de luchtpijp en binden met draad.
- Open voorzichtig de thorax met een middellijn incisie, weggesneden het middenrif, en verwijder de laterale borst muren om de longen bloot te leggen.
- Sluit de luer uiteinde van de naald een reservoir op een ring stand met formaldehyde. Zie figuur 3.
- Stel het bovenoppervlak van het formaldehyde 25 cm boven het niveau van de mouse. Zie figuur 3. Vervolgens zorg ervoor dat er geen lucht in de fixatie slang door het uitvoeren van vloeistof uit het einde van een kraan. Sluit de luer uiteinde van de tracheacanule het reservoir slang. Open de kraan naar de longen opgeblazen met formaldehyde. Laat de longen onder druk gedurende tenminste 20 minuten.
- Open de kraan naar de longen opgeblazen met formaldehyde. Laat de longen onder druk gedurende tenminste 20 minuten.
- Vervolgens afhechten de luchtpijp na het einde van de stomp naald. Het kan helpen om langzaam terug te trekken op de naald om meer van de uncannulated luchtpijp bloot. Wanneer stevig vastgebonden, verwijder de kraan.
- Ontleden voorzichtig uit de longen.
- Plaats de longen in formaldehyde 's nachts. Langere tijden zijn prima, en sommige vlekken of procedures kunnen specifieke tijden te geven. Ook andere vloeistoffen fixatieven, zoals Z-fix worden gebruikt voor de instillatie en onderdompeling.
- Voordat verdere histologische verwerking, metenvaste longvolume zoals hieronder beschreven.
3. Meting van de vaste longvolume
- Meet het longvolume behulp Archimedes principe zoals weergegeven in figuur 4. Verwijder de vaste longen van formaldehyde en ontleden het hart en andere niet-longweefsel.
- Gebruik een eerder geconstrueerd eenvoudige zelfgemaakte draadondersteuning apparaat dat wordt gebruikt om de longen volledig onder water houden.
OPMERKING: Dit apparaat moet compatibel zijn met welke balans wordt gebruikt gemaakt worden. Een typisch volgens figuur 5 is gemaakt van kunststof pipetten en dunne (20 G) draad. Dit systeem werkt goed met de rest die in de video, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan de meeste laboratoriumweegschalen. - Plaats een beker met ≈200 ml water op de balans en tarra met de ondersteunende kooi op zijn plaats in het water. Zie figuur 6 Verwijder de metalen kooi.; Plaats de longen op het wateroppervlak en druk onder waterde kooi.
- Noteer het gewicht op de weegschaal. Dit getal geeft het volume verplaatst water en is derhalve een directe maat van het longvolume. Zorg ervoor te zorgen dat de long of hechting of een deel van de draad kooi niet de zijkanten of onderkant van de beker te raken te maken.
- Voor de juistheid, herhaalt deze meting. Verwijder de longen uit het water en drogen op een tissue. Tarra de beker met de kooi in de plaats opnieuw en herhaal de longvolume meting. De twee volume metingen moeten vervolgens worden gemiddeld.
Opmerking: Als de longen worden gelaten in de formaline langer dan ongeveer een week, zal de lucht in de longen worden opgelost in de vloeistof. Wanneer dit gebeurt, zal de long zinken, zodat het niet meer nodig om een apparaat zoals in figuur 5 aan de long ondergedompeld houden. In dat geval kan het volume worden gemeten door eenvoudig door het vasthouden van de long door een van de hechtdraad snaren tot deze volledig is ondergedompeld zie figuur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De procedure beschreven in het eerste protocol niet vanzelf leiden tot een veralgemeende resultaten. Het beschrijft slechts een zeer betrouwbare manier te druppelen stoffen direct in de trachea. Figuur 7 toont een voorbeeld van een long die trypan blue werd ingeprent met de hier beschreven methode. Er is brede verspreiding van de kleurstof, vergelijkbaar met wat wordt gezien met andere kleurstoffen of tracers rechtstreeks toegediend in de trachea of muizen 11,12. We hebben ook deze methode ofwel bleomycine of elastase leveren aan de longen, waardoor wijdverbreide fibrose of emfyseem respectievelijk.
De beschreven voor het kwantificeren van structurele veranderingen in postmortem longen procedures verschaffen gegevens over de bij een druk van 25 cm H2O vaste longvolumes Dergelijke volumemetingen zijn essentieel voor latere onpartijdige histologische metingen van cellen of weefsel dichtheden zetten in totale aantallen 10. Deze paper alleen deschrijvers des middelen om een zeer nauwkeurige longvolume te verkrijgen. In negen 10-12 weken oude gezonde Balb / c muizen gemeten we een gemiddelde (± SD) vast longvolume van 0,82 ± 0,09 ml van de linker long volume dat ongeveer 30% van het totaal. In Balb / c muizen die 3 U pancreas elastase (bij de in dit document beschreven methode) experimentele emfyseem genereren, de long vast volume verhoogd tot 1,15 ± 0,13 ml, met de linker long resterende fractie van 30%.
Figuur 1: Intraveneuze catheter met licht gebogen tip gebruikt voor instillatie.
Figuur 2: Schuine 3-ringband gebruikt om muizen te ondersteunen voor de intubatie Dit bindmiddel opgezet om 3 muizen te houden..
Figuur 3:. Formaline gevulde reservoir op ring staan aangesloten muis, met boven vloeistof set 25 cm boven de muis Deze fixatie wordt normaliter uitgevoerd in een zuurkast.
Figuur 4:. Archimedes principe Het gewicht van het water verplaatst door een voorwerp onder water gelijk aan het volume van het object. Omdat de long behoudt gewoonlijk een aantal resterende lucht, is een inrichting zoals in figuur 5 nodig longen geheel onder water blijven.
Figuur 5: Lab gesneden steun voor het houden van de longen volledig onder water Device.vervaardigd uit kunststof pipetten en metaaldraad.
Figuur 6: Laboratorium weegschalen met beker en getarreerde onderdompeling apparaat klaar voor longvolume meting.
Figuur 7: Voorbeeld van een long bepaalde trypan blauw via intubatie katheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven procedures hebben een aantal voordelen. Eerst de benodigde apparatuur is eenvoudig en goedkoop. Ten tweede kan de intubatie snel worden uitgevoerd met weinig fouten. Ten derde, het vermogen naar de longen vaste longvolume vast op een constante druk, en meet maakt kwantificering van structuren of cellen in de long 10.
Een mogelijk nadeel van de intubatie is de kleine chirurgie. Dit kan de mogelijkheid om de procedure te herhalen als een 2de instillatie vereist beperken. Echter, met zorgvuldige chirurgie en aanbrengen van de kleefstof we kunnen routinematig of twee later doe een tweede instillatie een week. Als continue herhaalde toediening is vereist of herhaalde pulmonaire functietests nodig, kan een andere benadering intubatie wenselijker 13,14 zijn.
Daarbij instillatie, zijn er verschillende praktische problemen die worden vermeld. Het is belangrijk to zo zacht als mogelijk met de beweging van de tong in de eerste opening van de mond. Als forceps worden gebruikt, moeten de uiteinden bedekt met rubber slangen, omdat het gemakkelijk aan de tong verwonden, en dit kan leiden tot de dood van de muis. Hoewel hier de werkwijzen zijn ontworpen voor intubatie muizen ouder dan 6 weken, kunnen zij gemakkelijk worden aangepast aan jongere muizen.
Onze instillatie procedure werd oorspronkelijk ontwikkeld als een alternatief voor de werkwijze van orofaryngeale aspiratie 11. Hoewel deze laatste werkwijze gemakkelijk kan worden geleerd, de werkelijke volume afgegeven aan de longen blijft onzeker, omdat sommige instillate blijft in de keelholte en wordt doorgeslikt. Met een directe instillatie in de trachea en de daaropvolgende longinflatie zoals wij hier demonstreren, wordt de instillate direct afgegeven aan de longen. Er zij op gewezen dat, hoewel het mogelijk is om intubatie direct te gebruiken stoffen leveren aan de trachea 11,12, zoals intubatie kan damage van de bovenste luchtwegen of de stembanden, en in het algemeen vereist een veel hoger niveau van de opleiding van de 100% slagingspercentage dat onze procedure kunnen waarborgen.
De fixatieprocedure beschrijven we is vergelijkbaar met wat veel onderzoekers gebruiken. Er is vaak enige variabiliteit in de bandenspanning voor de fixeer, maar we voelen dat 25 cm H 2 O is een redelijk compromis dat de longen volledig opgeblazen zonder mogelijke schade weerhoudt over-inflatie. Er zij opgemerkt dat, hoewel het lijkt dat de longen opgeblazen met fluïdum 25 cm H moet 2 O worden op een volume dicht dan de totale longcapaciteit mocht bij luchtinflatie 35 cm H2O, dit ver van de waarheid. In feite is het opblazen met een fixatief algemeen in een volume van 70% van de lucht longcapaciteit 15,16. Met verdere verwerking paraffine inbedding, de effectieve longvolume gezien in histologische secties waarschijnlijk onder functionele residuale capaciteit (FRC). De meest voorkomende fixatief is formaline of z-fix, maar voor immunologische kleuring wordt een glutaraldehye mengsel vaak nodig. De onderzoekers moeten een fixeermiddel afhankelijk van wat hoeven te worden gemerkt kiezen, maar verdere bespreking van de optimale fixatief valt buiten het bestek van deze methoden paper.
Om een goede kwantitatieve analyse van histologische secties doen is het essentieel om een meting van het longvolume 10 hebben. Hoewel het mogelijk is longvolume te krijgen van de volledige sequentie van seriële secties (de Cavalieri methode), in muizenlongen is het vaak eenvoudiger om de vaste longvolume eenvoudig meten we in dit document en video beschreven. De procedure beschrijven we duurt slechts enkele seconden om te doen en moet regelmatig worden gedaan met alle long fixaties. Houd er echter rekening mee, dat de aldus gemeten volume houdt geen rekening met eventuele krimp met de verdere verwerking en inbedding, en als dit van belang is, moet de Cavalieri methodeworden gebruikt. Een laatste opmerking over deze vast volumemeting dat de fractie van het longvolume op de linker long in het vaste longen significant kleiner dan die welke is gemeten in vivo. CT beeldvorming van de longen in vivo twee muizenstammen bij functionele restcapaciteit toonde de linker long ongeveer 40% van de totale 17 zijn, terwijl het in het algemeen slechts 30% van de afmetingen van longen bij 25 cm H vaste 2 o . Op dit moment hebben we niet begrijpen waarom dit zo anders zou moeten zijn, maar het moet in gedachten worden gehouden bij het analyseren van veranderingen in de kwantitatieve histologische analyses. Met betrekking tot studies van longkanker heeft meting van longvolume maakt een onderzoeker gegevens over specifieke chemische desnsities of de dichtheid van verschillende celtypen absolute getallen in de gehele tumor of hele long goed normaliseren.
Samengevat, de intubatie moet verlopen hier is goedkoop te fabricerenen eenvoudig te gebruiken, en het moet de meeste onderzoekers en laboranten in staat om snel te leren om met succes vloeistoffen druppelen in muizenlongen met relatief weinig ervaring. Bovendien zijn de procedures fixatie en longvolume maat voor histologische analyse van de longen een middel voor een goede reproduceerbare en kwantitatieve analyse van longcellen en longstructuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Balance | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | Other balances can be used if they have a range of 1-300 g |
| 20 g Luer intravenous catheter | Insylte | Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva | |
| 500 ml laboratory bottle | Various | Several other possible vendors |
References
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab animal. 35, 39-42 (2006).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).
- Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives. Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).
- Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. In vivo measurement of lung volumes in mice. Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).
