Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

Summary

Das Ziel dieser Arbeit ist es, einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Wir stellen 3-Protokolle, um einfach und zuverlässig durchführen Lungen Instillationen, Fixierung, und Lungenvolumenmessungen.

Abstract

Die Möglichkeit, Live-Agenten, Zellen oder Chemikalien direkt in die Lunge zu vermitteln, ohne zu verletzen oder die Tötung der Mäuse ist ein wichtiges Werkzeug bei Lungenkrebs Forschung. Zwar gibt es eine Reihe von Methoden, die veröffentlicht wurden, die zeigen, wie Mäusen Lungenfunktionsmessungen zu intubieren, gibt keine ohne potentielle Probleme für den schnellen Instillation großen Kohorten von Mäusen. In der vorliegenden Arbeit wird eine einfache und schnelle Methode beschrieben, die ein Ermittler ermöglicht die Durchführung einer solchen Instillationen in einer effizienten Weise. Das Verfahren erfordert keine besonderen Werkzeuge oder Beleuchtung erforderlich und kann mit sehr wenig Praxis erlernt werden. Es geht um Anästhesie eine Maus, einen kleinen Schnitt in den Hals, um die Luftröhre sichtbar zu machen, und dann direkt Einfügen einer intravenösen Katheter. Der kleine Einschnitt rasch mit Gewebekleber verschlossen und die Mäuse werden sich erholen gelassen. Ein erfahrener Student oder Techniker kann Instillationen mit einer durchschnittlichen Rate von 2 min / Maus zu tun. Sobald ter Krebs festgestellt, gibt es oft eine Notwendigkeit für quantitative histologische Analyse der Lungen. Pathologen traditionell in der Regel nicht die Mühe, Lunge Inflation während der Fixierung zu standardisieren und Analysen sind oft auf einem Punktesystem, das sehr subjektiv sein kann, basiert. Während dies einmal für grobe Schätzung der Größe eines Lungentumors ausreichend ausreichend sein, jedes richtige stereo Quantifizierung von Lungenstruktur oder Zellen erfordert eine reproduzierbare Fixierung und der nachfolgenden Lungenvolumenmessung. Hier beschreiben wir einfache zuverlässige Verfahren sowohl für die Festsetzung der Lunge unter Druck und dann die genaue Messung der Festlungenvolumen. Die einzige Voraussetzung ist eine Laborwaage, die genau über einen Bereich von 1 mg-300 g ist. Die hier so vorgestellt Verfahren könnten die Fähigkeit, in den Mäusen zu erstellen, zu behandeln und zu analysieren Lungenkrebs deutlich verbessern.

Introduction

Für eine Reihe von Gründen, Lungenkrebs, nicht sehr stark bei der Maus untersucht. Ein Grund dafür ist, dass der Zugang zu der Lunge in vivo ist sehr schwierig, und die quantitative Analyse von festen Lungen ist nicht allgemein üblich ist. Die in diesem Dokument beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um hier Abhilfe zu schaffen. Die Ziele hier sind einfache Methoden, die sich stark in den Aufbau und die Analyse von Mauslungen mit Lungenkrebs oder anderen Pathologien helfen werden zu beschreiben. Während keiner dieser Ansätze völlig neu sind, haben sie nicht gemeinsam als eigenständiges Verfahren in der vereinfachten Weise, wie hier beschrieben dargestellt worden.

Es wurden eine Reihe von Handschriften, die Verfahren zur Intubation der Mauslunge in erster Linie für den Zweck dieser Wiederholungslungenfunktion oder bronchoalveoläre Lavage in einzelnen Mäusen in Langzeitstudien beschrieben wurden. Seit diesem ursprünglichen Papier, gab es mehrere andere Papiere, die verschiedenen Ansätze zur mous beschrieben haben,e Intubation ^{1 -9.} Während alle diese Verfahren erfolgreich verwendet werden können, erfordern sie in der Regel erhebliche Ausbildung und sind oft nicht ohne eine nichttriviale Ausfallrate. Darüber hinaus, um die Durchführung Lungenfunktionsmessungen, muss die Kanüle in die Luftröhre fest genug passen, so dass es keine Luftleckage. Allerdings ist eine weitere praktische Verwendung zur Intubation gegenüber spezifischen Agenzien (Krebszellen oder andere Beleidigungen) oder therapeutische Wirkstoffe direkt in die Lunge zu liefern. Ein solches Verfahren erfordert keine eng anliegende Kanüle noch eine anspruchsvolle Lungenfunktionsgeräten. Das neuartige Merkmal dieser hier gezeigten Verfahren eine kleinere chirurgische Prozedur, die die Intubation ermöglicht, ohne die Möglichkeit der Kanüle in die Speiseröhre. Dieser einfache Ansatz ermöglicht erfolgreiche Intubation mit relativ wenig Ausbildung oder Erfahrung. Nicht weniger als 30 Mäusen / h können mit diesem Ansatz mit einer Ausfallrate gegen Null behandelt werden.

Sobald ter Mäuse sind bereit, geopfert werden, die verletzt oder Krebs Lunge kann dann zur histologischen und pathologischen Analyse entfernt werden. Um alle histologischen Variablen richtig zu quantifizieren für den Vergleich mit anderen Lunge, ist es jedoch wichtig, die Fixierung Verfahren zu standardisieren und ordnungsgemäß zu quantifizieren, die feste Lungenvolumen ^10. Dieses Papier beschreibt im Detail die einfachen Verfahren, standardisierte Befestigungsverfahren sowie eine Möglichkeit, die Festlungenvolumen zu messen, zu ermöglichen. Das Volumen ist ein wesentlicher Metrik bei der Quantifizierung der Histologie, da ohne eine solche Volumenbestimmung kann nur relative Dichten gemessen werden ^10. Sobald das Lungenvolumen ist jedoch bekannt, absolute Messungen von Zellen und anderen strukturellen Messungen in der Lunge kann dann quantifiziert werden.

Protocol

Das folgende Protokoll beschreibt ein System, das gut funktioniert in 20-35 g Mäusen. Das Verfahren könnte problemlos an größeren oder kleineren Mäusen, indem einfach die Kathetergröße. Alle Tier Protokolle wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Lung Instillation

1. Wählen Kommerzielle Ein-Zoll-langen 20 g intravenöse Kanüle für die Intubation zu verwenden.
2. Ändern die Katheterspitze manuell gebogen wird, um eine leichte Krümmung in der Spitze zu erzeugen, wie in 1 dargestellt.
3. Betäuben die Maus mit einem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (15 mg / kg) ip injiziert, und bestätigen Anästhesie durch das Fehlen von Rückbewegung. Bewerben Veterinär Salbe auf die Augen unmittelbar nach der Narkose. Unmittelbar nach der Narkose gelten veterinär Salbe auf die Augen und geben Carprofen (5-10 mg / kg SQ) zur postoperativen Analgesie und Instillation.
4. Legen Sie die mouse in Rückenlage auf einer geneigten Plattform. Wie in 2 gezeigt, ein großes Büro Binder mit Nahtschlaufen mit Klebeband am funktioniert sehr gut.
5. Rasieren Sie die ventralen Teil des Halses und reinigen und desinfizieren die Hals-Bereich mit 70% Alkohol. Mit neuen Latex- und puderfreie Handschuhe, verwenden chirurgische Instrumente mit 70% Alkohol desinfiziert.
6. Mit Hilfe einer scharfen Schere einen kleinen chirurgischen Schnitt in den Hals ca. 12 mm unterhalb der unteren Schneidezähne.
7. Mit einer Pinzette vorsichtig die Haut im Nacken kaudal, bis die ventrale Wand der Luftröhre zu sehen.
8. Vorsichtig einfahren Zunge und legen Sie die Kanüle mit der gebogene Spitze in Richtung der ventralen Oberfläche der Maus geneigt. Wie in 1.4, ziehen Sie vorsichtig auf die Haut im Nacken, und legen Sie die Kanüle in die Luftröhre.
   HINWEIS: Mit ein wenig Übung, der Katheter wird sichtbar nach unten bewegen die Luftröhre. Wenn sie in die Speiseröhre geht, dann wird es keine visuelle Beobachtung der Bewegung des Katheters zu sein. Keine Schnittewerden in die Trachea vorgenommen.
9. Sobald der Katheter in der Luftröhre im Hals gesehen brachte er etwa 5 mm bis zuverlässig übergeben die Stimmbänder, aber immer noch deutlich über der Carina.
10. Bereiten Sie vermitteln bis zu 50 & mgr; l der Flüssigkeit durch die Injektion durch den Katheter mit einem Gel Ladepipettenspitze. Setzen Sie die Spitze in der Luer-Anschluss, aber vor der Injektion genau hinschauen, um die Bewegung der Flüssigkeit in der Spitze synchron mit der Maus die Atmung beobachten. Dann spritzen den instillate.
11. Mit einer 1-ml-Spritze, sofort zu tun ein relativ schnelles Aufblasen von 0,6 ml Luft in die Lungen durch den Katheter zu verteilen die Flüssigkeit tief in der Lunge. Entfernen Sie die Kanüle.
12. Entfernen Sie die Kanüle.
13. Verwenden Sie eine kleine Menge von Cyanacrylat-Klebstoff, um die kleine Operationswunde nach Packungsbeilage Anleitung zum Vetbond schließen. Zeigen Mäuse in Einzelkäfigen und optisch zu überwachen, bis sie aufwachen und normal zu verhalten ohne Angabe von discomfort.

2. Lung Fixation

HINWEIS: Wenn alle experimentellen Verfahren werden in einer Maus durchgeführt, können die Lungen zur histologischen Verarbeitung durch Fixierung mit Formaldehyd (oder einem beliebigen anderen Fixiermittel) vorbereitet werden.

1. Opfern Sie die Maus mit einem IACUC akzeptablen Verfahren. Für die Vertreter der Maus im Video gezeigt wird Genickbruch eines betäubten Maus.
2. Führen Sie eine Tracheotomie (falls noch nicht geschehen) durch chirurgisches Freilegen der Bauchseite der Luftröhre, indem Sie einen kleinen Schnitt und Einfügen einer 18 G-Stub Nadelspitze in die Luftröhre, und band ihn mit Gewinde.
3. Öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb mit einem Mittellinienschnitt, schneiden Sie das Zwerchfell, und entfernen Sie die seitlichen Brustwand, um die Lungen aus.
4. Verbinden Sie den Luer-Ende der Nadel in ein Reservoir an einem Ringständer Formaldehyd enthält. Siehe Abbildung 3.
5. Stellen Sie die Oberseite des Formaldehyds 25 cm über dem Niveau des mouse. Siehe Abbildung 3. Als nächstes stellen Sie sicher, dass sich keine Luft in der Fixierschlauch indem Flüssigkeit aus dem Ende einer Sperrhahn. Verbinden den Luer Ende der Luftröhrenkanüle zum Reservoirschlauch. Öffnen Sie den Wasserhahn, um die Lungen mit dem Formaldehyd aufzublasen. Lassen Sie die Lunge unter Druck für mindestens 20 min.
6. Öffnen Sie den Wasserhahn, um die Lungen mit dem Formaldehyd aufzublasen. Lassen Sie die Lunge unter Druck für mindestens 20 min.
7. Als nächstes binden Sie die Luftröhre über das Ende der Stichleitung Nadel. Es kann helfen, langsam zurück auf die Nadel ziehen, um mehr von der uncannulated Luftröhre freizulegen. Wenn fest zusammengezogen, entfernen Sie den Wasserhahn.
8. Sorgfältig sezieren die Lunge.
9. Zeigen die Lunge in Formaldehyd über Nacht. Längere Zeiten sind in Ordnung, und einige Flecken oder Verfahren können bestimmte Zeiten festlegen. Auch andere Flüssigkeiten Fixiermittel wie z-fix kann für die Instillation und Eintauchen verwendet werden.
10. Bevor weitere histologische Verarbeitung, zu messendie feste Lungenvolumen als nächstes beschrieben.

3. Messung der Fest Lung Volume

1. Messen Sie das Lungenvolumen mit Archimedes Prinzip wie in 4 dargestellt ist. Entfernen Sie den Fest Lunge aus dem Formaldehyd und sezieren das Herz und andere nicht-Lungengewebe.
2. Verwenden Sie einen zuvor konstruierten einfache hausgemachte Drahtstützeinrichtung, die verwendet wird, um die Lungen vollständig unter Wasser zu halten.
   HINWEIS: Dieses Gerät muss mit je nachdem, was Balance verwendet wird in Einklang gebracht werden. Eine in 5 gezeigte typische Vorrichtung ist aus Plastikpipetten und dünn (20 G) Draht. Dieses System funktioniert gut, wobei der Rest in dem Video verwendet, könnte aber leicht an die meisten Laborwaagen angepaßt werden.
3. Stellen Sie ein Becherglas mit ≈200 ml Wasser auf die Waage und tarieren mit dem Tragkäfig anstelle im Wasser. Siehe Abbildung 6 Entfernen Sie den Metallkäfig. legen Sie die Lunge auf der Wasseroberfläche und drücken Sie unter Wassermit dem Käfig.
4. Das Gewicht auf die Waage. Diese Zahl entspricht dem Volumen Wasser versetzt und ist somit ein direktes Maß für die Lungenvolumen. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Lunge oder Nahtmaterial oder einen Teil der Drahtkäfig nicht die Seiten oder Boden des Bechers berühren zu machen.
5. Für Richtigkeit, wiederholen Sie diese Messung. Entfernen Sie die Lunge aus dem Wasser, und trocknen auf einem Gewebe. Tarieren das Becherglas mit Käfig in Position und wiederholen Sie den Lungenvolumenmessung. Die beiden Volumenmessungen sollte dann gemittelt werden.
   HINWEIS: Wenn die Lungen im Formalin für mehr als eine Woche bleibt, wird die Luft in der Lunge in der Flüssigkeit gelöst werden. Wenn dies geschieht, wird der Lungen sinken, so ist es nicht mehr notwendig, irgendeine Vorrichtung wie in Figur 5 zu verwenden, um die Lunge eingetaucht zu lassen. In einem solchen Fall kann die Lautstärke einfach durch Halten der Lunge von einer der Naht Strings, bis es vollständig eingetaucht ist, wie in Figur 4 dargestellt, gemessen werden.

Representative Results

Das Verfahren beschreibt in dem ersten Protokoll nicht von selbst zu irgendeinem generali Ergebnissen führen. Es beschreibt nur ein sehr zuverlässiges Mittel zur Substanzen direkt in die Luftröhre zu vermitteln. Figur 7 zeigt ein Beispiel einer Lunge, in dem Trypanblau wurde mit dem hier beschriebenen Verfahren eingeimpft. Gibt es weit verbreitete Verteilung des Farbstoffs, ähnlich wie es mit anderen Farbstoffen oder Tracer direkt in die Trachea oder Mäusen ^11,12 gegeben gesehen. Wir haben auch diese Methode, um entweder Bleomycin oder Elastase in der Lunge, die in weit verbreiteten Fibrose oder Emphysem, bzw. Ergebnisse zu liefern.

Die zum Quantifizieren der strukturellen Veränderungen in postmortem Lungen beschriebenen Verfahren liefern Daten über die bei einem Druck von 25 cm _H 2 O. festen Lungenvolumina Solche Volumenmessungen sind unerlässlich, um nachfolgende unvoreingenommene histologischen Messungen der Zell- oder Gewebedichten in Gesamtzahlen ¹⁰ umzuwandeln. Dieses Papier nur deritzt die Mittel, um eine sehr genaue Lungenvolumen zu erhalten. In neun 10-12 Wochen alte gesunde Balb / c-Mäusen messen wir eine mittlere (± SD) befestigt Lungenvolumen von 0,82 ± 0,09 ml mit der linken Lungenvolumen bei etwa 30% der Gesamtkosten. In Balb / c-Mäusen, denen 3 U von Pankreas-Elastase (mit der in diesem Dokument beschriebenen Methode) bis experimentellen Emphysem erzeugen, erhöht die Lunge festgelegtes Volumen auf 1,15 ± 0,13 ml, mit der bei 30% verbleibenden linken Lunge Fraktion.

Abbildung 1: Die intravenöse Katheter mit leicht gebogene Spitze zur Instillation verwendet.

Abbildung 2: Geneigte 3-Ring-Binder verwendet, um Mäuse für die Intubation Unterstützung Dieses Bindemittel eingerichtet, 3 Mäuse zu halten..

Abb. 3: Formalin gefüllten Reservoir am Ring-Maus angeschlossen zu stehen, mit Spitze von Fluid festgelegt 25 cm über der Maus Diese Fixierung sollte in der Regel in einem Abzug durchgeführt werden.

Abb. 4: Archimedes Prinzip Das Gewicht des Wassers durch ein unter Wasser liegendes Objekt verschoben gleich dem Volumen des Objekts. Weil die Lunge normalerweise behält etwas Restluft, wird eine Vorrichtung wie in Figur 5 erforderlich, um die Lunge vollständig untergetaucht zu halten.

Abbildung 5: Lab Support für die Aufbewahrung Lungen komplett unter Wasser Gerät.von Plastikpipetten und Metalldraht aufgebaut.

Abbildung 6: Laborwaagen mit Becher und tarierte Tauchgerät bereit für Lungenvolumenmessung.

Abbildung 7: Beispiel einer Lunge gegeben Trypanblau durch die Intubation Katheter.

Discussion

Die hier beschriebenen Verfahren haben mehrere Vorteile. Zuerst die erforderliche Ausrüstung ist einfach und kostengünstig. Zweitens kann die Intubation schnell mit wenigen Fehlern durchgeführt werden. Drittens erlaubt die Fähigkeit, in die Lunge bei einem konstanten Druck zu fixieren, und dann den Festlungenvolumen korrekte Quantifizierung von Strukturen oder Zellen in der Lunge ^10.

Ein möglicher Nachteil der Intubation ist die kleine Chirurgie. Dies kann die Möglichkeit, das Verfahren zu wiederholen, wenn ein ^2. Instillation erforderlich einzuschränken. Doch bei sorgfältiger Chirurgie und Aufbringen des Klebstoffs ist es uns gelungen, eine oder zwei Wochen später routinemäßig einen zweiten Instillation. Wenn kontinuierliche wiederholt Instillationen sind erforderlich, oder wenn wiederholte Lungenfunktionstests benötigt werden, kann eine andere Intubation Ansatz wünschenswert ^13,14 sein.

Für die Ausführung der Instillation, gibt es mehrere praktische Probleme, die erwähnt werden sollten. Es ist wichtig, to werden so schonend wie möglich mit der Bewegung der Zunge in der ersten Öffnung des Mundes. Wenn Zange verwendet werden, sollten die Spitzen mit Gummischlauch überzogen werden, da es leicht ist, um die Zunge zu verletzen, und dies kann zum Tod der Maus führt. Obwohl die Verfahren hier wurden zur Intubation von Mäusen älter als 6 Wochen ausgelegt, da sie leicht zu jüngeren Mäusen angepasst werden.

Unsere Instillation Verfahren wurde ursprünglich als eine Alternative zu dem Verfahren von oropharyngealen Streben ¹¹ ausgebildet. Während diese letztere Methode kann leicht erlernt werden, bleibt die tatsächliche der Lunge zugeVolumen unsicher, da ein Teil des instillate bleibt im Rachen und wird verschluckt. Mit einem direkten Instillation in die Luftröhre und die anschließende Lungeninflation als wir hier zeigen, wird das Instillat direkt an die Lunge abgegeben. Es ist erwähnenswert, dass, obwohl es da möglich ist, Intubation, um die Luftröhre ^11,12 direkt verwenden, um Stoffe zu liefern, kann eine solche Intubationmage die oberen Atemwege oder Stimmbänder, und im allgemeinen erfordert ein viel höheres Maß an Ausbildung, um die Erfolgsquote von 100%, die unsere Verfahren ermöglicht zu gewährleisten.

Die Fixierungsverfahren wir beschreiben, ist ähnlich dem, was viele Forscher verwenden. Oft gibt es eine gewisse Variabilität in der Luftdruck für das Fixiermittel verwendet, aber wir glauben, dass 25 cm _H 2 O ist ein vernünftiger Kompromiss, der die Lunge vollständig aufgeblasen, ohne mögliche Schäden durch Über Inflation hält. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass, obwohl es scheint, dass eine Lunge mit Flüssigkeit bis zu 25 cm H aufgeblasen _{2 O} sollte bei einem Volumen nahe, was die totale Lungenkapazität kann mit Luft Aufblasen bei 35 cm H _{2 O} zu sein, ist dies weit von der Wahrheit. In der Tat, die Inflation mit Fixiermittel führt im allgemeinen in einem Volumen von 70% des Luftlungenkapazität ^15,16. Und mit der nachfolgenden Verarbeitung mit Paraffineinbettung, dürfte unter funktionalen Rest ca die effektive Lungenvolumen in histologischen Schnitten betrachtetzität (FRC). Die häufigste Fixierungsmittel ist Formalin oder z-fix, sondern auch für immunologische Färbung wird ein Glutaraldehyd Mischung oft erforderlich. Die Ermittler müssen ein Fixiermittel je nachdem, was zu müssen gefärbt werden wählen, aber die weitere Diskussion des optimalen Fixierungs würde den Rahmen dieser Verfahren Papier.

Um die ordnungsgemäße quantitative Analyse von histologischen Schnitten tun, ist es wichtig, eine Messung der ^{Lungenvolumen} 10 zu haben. Obwohl es möglich ist, das Lungenvolumen aus der vollständigen Sequenz der Serienschnitte (die Cavalieri Methode) erhalten, in der Mäuselunge ist es oft einfacher, einfach zu messen, die feste Lungenvolumens, wie wir in diesem Dokument beschriebenen und Video. Das Verfahren beschreiben wir in nur wenigen Sekunden zu tun und sollte routinemäßig bei allen Lungen Fixierungen erfolgen. Denken Sie daran, Sie jedoch, dass die auf diese Weise gemessene Volumen sieht keine Schrumpfung mit anschließender Verarbeitung und Einbettung zu berücksichtigen, und wenn dies ist wichtig, die Cavalieri Methode sollteeingesetzt werden. Eine letzte Anmerkung bezüglich dieser festen Volumen Messung ist, dass der Anteil des Lungenvolumens in der linken Lunge in den festen Lungen ist deutlich kleiner als die, die in vivo gemessen wurde. CT-Bildgebung der Lungen in vivo von zwei Stämmen von Mäusen in der funktionalen Restkapazität zeigte die linke Lunge bis etwa 40% der gesamten ¹⁷ sein, während es im allgemeinen nur zu 30% in der obigen Messungen aus den Lungen auf 25 cm H ₂ befestigt O . In der heutigen Zeit, die wir nicht verstehen, warum dies so unterschiedlich sein, aber es sollte bei der Analyse von Veränderungen in quantitative histologische Analysen aufbewahrt werden. In Bezug auf Studien von Lungenkrebs, eine Messung des Lungenvolumens ermöglicht einen Prüfer, um Daten über spezifische chemische desnsities oder der Dichte verschiedener Zelltypen, um die absoluten Zahlen in der gesamten Tumor oder ganze Lunge richtig zu normalisieren.

Zusammenfassend ist die Intubation Verfahren beschreiben hier kostengünstig herzustellenund einfach zu bedienen, und es sollte die meisten Forscher und Labortechniker zu ermöglichen, schnell zu lernen, um Flüssigkeiten erfolgreich vermitteln in Mauslungen mit relativ wenig Erfahrung. Darüber hinaus ist die bei der Fixierung und Lungenvolumenmessung für die histologische Analyse der Lungen liefern ein Mittel für die richtige wiederholbare und quantitative Analyse von Lungenzellen und Lungenstruktur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors