Summary
本稿の目的は、大幅に肺癌または他の病状とのセットアップとマウスの肺の分析を支援する単純な方法を記述することです。我々は、簡単かつ確実に肺の点滴注入、固定、および肺容量の測定を行うために3プロトコルを提示します。
Abstract
負傷またはマウスを殺すことなく、直接肺に生き薬、細胞、または化学物質を植え付けるする能力は、肺癌研究における重要なツールです。肺機能の測定のためにマウスを挿管する方法を示す公開されている多数の方法がありますが、どれもマウスの大規模コホートにおける急速な気管点滴注入のための潜在的な問題もなくはありません。本研究では、簡単かつ迅速な方法は、効率的な方法でそのような点滴注入を実施する研究者を可能にすることが記載されています。この方法は、特殊な工具や照明を必要とせず、非常に少し練習して学ぶことができます。これは、マウスを麻酔気管を可視化するために、首に小さな切開し、その後、直接静脈カテーテルを挿入することを含みます。小さな切開を迅速に組織接着剤で閉じ、マウスを回復させます。熟練した学生や技術者が2分/マウスの平均速度で点滴を行うことができます。 Tたら癌が確立されている彼、肺の定量的な組織学的分析の必要性がしばしばあります。伝統的に病理学者は、通常、固定時に肺膨張を標準化するために気にしない、との分析は、多くの場合、非常に主観的スコアリングシステムに基づいています。これはいつか肺腫瘍の大きさの粗推定値のために十分に適切であり得るが、肺の構造または細胞の任意の適切な立体定量化は、再現固定手順とそれに続く肺容量の測定を必要とします。ここでは、両方が圧力下で肺を固定して、正確に固定された肺容量を測定するための簡単な信頼性のある手順について説明します。唯一の要件は、1 MG-300グラムの範囲に亘って正確である実験室のバランスです。ので、ここで提示された手順が大幅にマウスで肺癌を作成、治療、および分析する能力を向上させることができます。
Introduction
多くの理由により、肺癌は、マウスにおいて広く研究されていません。その理由の一つは、肺へのアクセスは、インビボで非常に困難であり、固定肺の定量分析は、一般的に行われないということです。このホワイトペーパーで説明する方法は、この状況を改善するように設計されています。目標は、本明細書に大きく肺癌または他の病理との設定、マウスの肺の分析を補助する単純な方法を記載することです。これらのアプローチのいずれも、全く新しいませんが、彼らはここで説明するように簡略化して、スタンドアロンの方法として一緒に提示されていません。
主に縦方向の研究における個々のマウスで繰り返し肺機能や気管支肺胞洗浄を行うことを目的に、マウスの肺の挿管のための方法を記載している原稿の数がありました。そのオリジナルの論文以来、覚書に異なるアプローチが記載されている他のいくつかの論文がありましたE挿管1 -9。これらの方法の全てが正常に使用することができるが、それらは通常、かなりの訓練を必要とし、重要な故障率なしに、多くの場合ではありません。加えて、肺機能測定を行うために、カニューレには、空気漏れがないようにしっかりと十分な気管にフィットする必要があります。しかし、挿管のための別の実用化は、肺に直接特定の薬剤（癌細胞または他の傷害）、または治療薬を送達することです。このような手順は、タイトなフィッティングカニューレも任意の洗練された肺機能の機器を必要としません。ここに示されているこの方法の新規な特徴は、食道に入るカニューレのいずれかの可能性なしに挿管を可能にする簡単な外科的処置を必要とします。この単純なアプローチは比較的少ないトレーニングや経験を持つ成功した挿管を可能にします。以下のような多くの30匹のマウス/時間がゼロに近づく故障率と、この方法を用いて治療することができます。
Tたら彼のマウスは、負傷または癌性肺が、その後組織学的および病理学的分析のために取り外すことができ、犠牲にする準備ができています。しかし、適切に他の肺との比較のために任意の組織学的変数を定量化するためには、固定手順を標準化し、適切に固定された肺容積10を定量化することが不可欠です。本稿では詳細に標準化された固定手順と同様に固定肺容量を測定する方法を可能にする簡単な手順について説明します。そのようなボリューム決意することなく、唯一の相対密度が10を測定することができるので、体積は、組織学の定量化に不可欠な測定基準です。肺気量がわかれば、しかしながら、肺の細胞、および他の構造の測定値の絶対的な測定値は、その後、定量することができます。
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Protocol
以下のプロトコルは、20〜35グラムのマウスではうまく機能システムが記載されています。この方法は、容易に、単に、カテーテルのサイズを変更することによって、より大きな又はより小さなマウスに適応することができました。全ての動物プロトコルは、ジョンズホプキンス大学動物実験委員会によって承認されました。
1.肺点滴注入
- 挿管に使用する商業1インチ長い20グラム静脈カニューレを選択します。
- 手動で、図1に示すように、それは先端のわずかな曲率を生成するために、曲げカテーテル先端を変更します。
- ケタミンの混合物（100mg / kg）およびキシラジン（15 mgの/ kg）でマウスを麻酔IPを注入し、反射運動の欠如によって麻酔を確認します。すぐに麻酔した後、目に獣医軟膏を適用します。麻酔が目に獣医軟膏を適用し、手術後や点滴鎮痛のためにカルプロフェン（5-10ミリグラム/キログラムSQ）を得た直後。
- 畝を配置傾斜プラットフォーム上でSE仰向け。 図2に示すように 、縫合糸ループを有する大規模オフィスバインダーは完璧に作品をテープで固定しました。
- 首とクリーンの腹の部分を剃るし、70％アルコールで首エリアを消毒。新しいlatex-とpowder-無料の手袋を使用すると、70％アルコールで消毒手術器具を使用しています。
- 鋭いハサミを使用すると、約12ミリメートル下顎切歯の下に首に小さな外科的切開を行います。
- 気管の腹側の壁を見ることができるまで、ピンセットで軽く首尾側で皮膚を引っ張ります。
- そっと舌を撤回し、マウスの腹面に向かって傾斜して曲がった先端でカニューレを挿入します。 1.4のように、首の皮膚を軽く引いて、気管にカニューレを挿入します。
注：少し練習すると、カテーテルが気管を下に移動する表示されます。それが食道に入る場合には、カテーテルの動きの視覚的な目撃情報はありません。いいえ切開ん気管内に作られています。 - カテーテルを首の気管に見られると、約5mm、確実に声帯を通過したが、まだ十分に気管分岐部の上にすることを進みました。
- ゲルローディングピペットチップでカテーテルを介して注入することにより、液体の50μlにまで浸透させるための準備。ルアーハブでチップを置きますが、マウスの呼吸で先端同期内の流体の動きを観察するために慎重に見て注入する前に。その後、点滴を注入。
- 1mlシリンジを使用すると、すぐに肺の中の液体の深いを分散を助けるためにカテーテルを介して肺に空気の0.6ミリリットルの比較的急速なインフレを行います。カニューレを削除します。
- カニューレを削除します。
- VetBondための添付文書の指示通りに小さな手術創を閉鎖するためにシアノアクリレート接着剤の少量を使用してください。個々のケージにマウスを置き、彼らが目を覚ますまで、視覚的に監視し、discomfの兆候なしで正常に動作ORT。
2.肺固定
注：すべての実験手順は、マウスで行われると、肺がホルムアルデヒド（または任意の他の所望の固定剤）で固定することにより組織学的処理のために準備することができます。
- IACUC許容可能な手順でマウスを生け贄に捧げます。ビデオに示されている代表的なマウスの場合、麻酔したマウスの頚椎脱臼が使用されます。
- 外科、気管の腹側を露出させ、小さなカットを作る、と気管に18 Gスタブ針の先端を挿入し、スレッドとそれを結びつけることによって（まだ行っていない場合）気管切開を行います。
- 慎重に、正中切開で胸郭を開き、ダイヤフラムを切り取って、肺を露出するために胸部側面の壁を取り除きます。
- ホルムアルデヒドを含むリングスタンド上の容器に針のルアー端を接続します。 図3を参照してください 。
- 25センチメートルMOUのレベルを超えてホルムアルデヒドの上面を設定SE。 図3を参照してください 。次は、コックの終わりから流体を実行して、固定チューブ内に空気が存在しないことを確認してください。貯留管に気管カニューレのルアー端を接続します。ホルムアルデヒドで肺を膨らませるコックを開きます。少なくとも20分間、圧力下肺を残します。
- ホルムアルデヒドで肺を膨らませるコックを開きます。少なくとも20分間、圧力下肺を残します。
- 次に、スタブ針の端部を越えて気管を縛ります。それはuncannulated気管の多くを露出するために、針の上にゆっくりと引き戻すのに役立つことがあります。安全に接続すると、ストップコックを削除します。
- 慎重に肺を解剖します。
- 一晩ホルムアルデヒドで肺を置きます。長い時間が微細であり、シミや手順が特定の時間を指定することができます。また、z軸を修正などの他の液体の固定剤は、点滴注入、浸漬のために使用することができます。
- さらに組織学的処理の前に、測定次に説明するように固定された肺容量。
固定肺容量の3測定
- 図4に示すように、アルキメデスの原理を用いて、肺容量を測定します。ホルムアルデヒドから固定肺を外し、心臓や他の非肺組織を分析。
- 完全に水の下で肺を維持するために使用される以前に構築シンプルな自家製のワイヤ支持デバイスを使用してください。
注：このデバイスが使用されている方のバランスと両立させることが必要です。 図5に示される典型的な装置は、プラスチックピペットと薄い（20 G）のワイヤから形成されています。このシステムは、ビデオで使用さバランスでうまく動作しますが、簡単にほとんどの研究室残高に適合させることができます。 - 水の代わりに、サポートするケージとのバランスと風袋の水の≈200mlのビーカーを置きます。 図6を参照してください金属ケージを取り外します。水面に肺を置き、下に押して、水ケージと。
- バランスの重量を記録します。この数は、置換された水の量を反映しているため、肺容量の直接の尺度です。肺または縫合糸またはワイヤケージのいずれかの部分が側面やビーカーの底に接触しないことを確認してくださいするように注意してください。
- 精度については、この測定を繰り返します。水から肺を取り出し、組織の乾燥。再び所定の位置にケージを入れたビーカーを風袋引きし、肺容量測定を繰り返します。 2つのボリュームの測定値は、その後、平均化されるべきです。
注：肺がより約一週間のためにホルマリン中に残っている場合は、肺の中の空気が液体に溶解されます。この場合、肺は沈むので、水没肺を維持するために、図5のような任意のデバイスを使用する必要がなくなります。このような場合、ボリュームが、図4に示されるように、それが完全に浸漬されるまで、縫合糸のいずれかの文字列によって肺を保持することによって簡単にすることによって測定することができます。
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Representative Results
手順は、それ自体で任意の一般的な結果にはならない最初のプロトコルで説明します。それが唯一の直接気管内に物質を植え付けるために非常に信頼性の高い手段が記載されている。 図7は、トリパンブルーは、ここで説明する方法で点眼した肺の一例を示しています。気管またはマウス11,12に直接与えられた他の染料またはトレーサーで見てきたものに類似した色素の広範な分布は、あります。また、それぞれ広範な線維症または肺気腫、その結果、肺にブレオマイシンまたはエラスターゼのいずれかを提供するために、このメソッドを使用しています。
死後肺の構造変化を定量化するために記載された手順を25センチH 2 Oの圧力で固定肺ボリューム上のデータを提供このような体積測定は、総数10内に細胞又は組織密度のその後の公正な組織学的測定値を変換するために必須です。この論文のみデ非常に正確な肺容量を得るための手段をスクライブ。 9 10〜12週齢の健康のBalb / cマウスでは、左肺容量が全体の約30％であると0.82±0.09ミリリットルの平均（±SD）は、固定肺容量を測定しました。実験肺気腫を生成するために、（この論文に記載の方法に）膵臓エラスターゼの3 Uを与えたBalb / cマウスでは、肺の固定量は30％で、残りの左肺分画と、1.15±0.13ミリリットルに増加しました。
図1：点滴に使用わずかに湾曲先端と静脈カテーテル。
図2：挿管のためのマウスをサポートするために使用される傾斜3リングバインダー 、このバインダーは、3匹のマウスを保持するように設定。
図3：流体のトップ25 CMマウス以上に設定してホルマリンをマウスに接続リングスタンドに貯水池を埋め、この固定は通常、ドラフト内で行う必要があります。
図4：アルキメデスの原理水没オブジェクトによって置換された水の重量は物体の体積に等しいです。肺は通常いくつかの残留空気が保持されるため、 図5のように、デバイスが完全に水没し、肺を維持するために必要とされています。
図5：ラボは、完全に水中肺を維持するためのサポートをしたデバイス。プラスチックピペットと金属ワイヤから構築。
図6：ビーカーや肺容量測定のための準備ができて風袋を量っ水没デバイスと研究所のバランス。
図7：挿管カテーテルを通してトリパンブルーを与えられた肺の例。
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Discussion
ここで説明する手順は、いくつかの利点を有します。まず必要な機器は、簡単で安価です。第二に、挿管はすぐにいくつかのエラーで行うことができます。第三に、固定された肺容量を一定の圧力で肺を固定した後、測定する能力は、肺10内の構造や細胞の適切な定量化を可能にします。
挿管に対する1つの可能な欠点は、簡単な手術です。これは、2 番目の点滴が必要な場合は、手順を繰り返す能力を制限することができます。しかし、私たちが日常的に一週間か二週間後に第二の点滴を行うことができた接着剤の慎重な手術や用途に。連続繰り返し点眼が必要な場合または反復肺機能検査が必要な場合、別の挿管アプローチがより望ましい13,14かもしれません。
点滴をしているでは、言及されるべきであるいくつかの実用上の問題があります。それは重要なtとしますO口の初期開口部に舌の動きにできるだけ優しくします。鉗子を使用する場合、それは舌を傷つけることは容易であるので、ヒントは、ゴム管で覆われるべきであり、これはマウスの死につながる可能性があります。ここでの方法は、6週間以上経過したマウスの挿管のために設計されたが、彼らは簡単に若いマウスに適合させることができます。
私たちの点滴注入の手順は、最初に口腔咽頭吸引11の方法に代わるものとして設計されました。この後者の方法を簡単に学習することができますが点滴の一部が咽頭に残り、飲み込まれますので、肺に供給される実際の量は、不確実なまま。我々がここで実証として気管に直接点滴注入とその後の肺膨張では、点滴は直接肺に送達されます。それを、それが気管11,12に直接物質を送達するための挿管を使用することが可能であるが、ということは注目に値するような挿管ができダ上気道または声帯をMAGE、一般的に私たちの手順を可能にする、100％の成功率を確保するために、訓練の非常に高いレベルが必要です。
我々は説明固定手順は、多くの研究者が使用するものと似ています。そこにいくつかの変動は固定剤に使用される膨張圧力であることが多いが、私たちを25センチのH 2 Oが過剰インフレから可能な損傷を与えることなく、完全に膨張肺を保持し、合理的な妥協点であることを感じています。それはそれはさ25cm Hに流体で膨張肺を2 Oは総肺容量35センチのH 2 Oで空気のインフレになるかもしれないものに近い音量であるべきであるように思えるかもしれないがこと、しかし、注意すべきである、これは遠く真実から。実際には、固定剤とのインフレ率は、一般的に空気の肺の容量15,16の70％の音量になります。そして、パラフィン包埋とその後の処理で、組織切片に見て効果的な肺容量は、機能的な残留CA以下の可能性がありますpacity（FRC）。最も一般的な固定液は、ホルマリンまたはz-修正ですが、免疫学的染色のために、glutaraldehye混合物は、多くの場合、必要とされます。調べでは、染色される必要がされているものに応じて固定液を選択する必要がありますが、最適な固定液のさらなる議論は、この方法で紙の範囲を超えています。
組織切片の適切な定量分析を行うためには、肺容量10の測定が不可欠です。それは連続切片（カバリエリ法）の完全な配列から肺容量を取得することは可能ですが、マウスの肺にそれは我々がこのドキュメントやビデオで説明したように、単純に固定肺容量を測定するために、多くの場合簡単です。私たちが説明した手順を実行するだけ秒かかり、日常すべての肺凝視して行われるべきです。このようにして測定ボリュームは、その後の処理および埋め込みを持つ任意の収縮を考慮していないこと、しかし、覚えておいて、これは重要である場合、カバリエリの方法はすべき使用することができます。この一定量の測定に関する最後の注意点は、固定された肺の中の左肺 の肺容量の一部は、生体内で測定されたものよりも有意に小さいことです。それを25センチのH 2 Oに固定された肺から上記の測定では、一般的に30％のみであるのに対し、機能的残気量で2系統のマウスの生体内での肺のCT撮影は、合計17の約40％に左肺を示しました。これがそう異なっている必要があり、なぜ現時点では、我々は理解していないが、定量的な組織学的分析の変化を分析する場合には注意が必要です。肺がんの研究に関しては、肺容量の測定を持つことは適切全腫瘍または肺全体に絶対数に特定の化学desnsitiesまたは種々の細胞型の密度のデータを正規化するために研究者を可能にします。
要約すると、挿管手順は、ここで説明する製造が安価ですそして、使用が簡単で、それはすぐに成功し、比較的経験の少ないマウスの肺に液体を浸透させることを学ぶために最も研究者や検査技師を有効にする必要があります。加えて、肺の組織学的分析のために固定手順および肺容量の測定は、肺細胞および肺構造の適切な再現性および定量分析のための手段を提供します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Balance | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | Other balances can be used if they have a range of 1-300 g |
| 20 g Luer intravenous catheter | Insylte | Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva | |
| 500 ml laboratory bottle | Various | Several other possible vendors |
References
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