Drypping og fiksering Nyttig i Mouse Lung Cancer Research

Summary

Målet med denne artikkelen er å beskrive enkle metoder som vil i stor grad hjelpe til oppsett og analyse av muse lungene med lungekreft eller annen patologi. Vi presenterer 3 protokoller for å enkelt og pålitelig utføre lunge instillations, fiksering, og lungevolummålinger.

Abstract

Evnen til å innpode levende agenter, celler eller kjemikalier direkte inn i lungene uten å skade eller drepe mus er et viktig verktøy i lungekreft forskning. Selv om det er en rekke metoder som har blitt publisert som viser hvordan du intubere mus for lungemålinger funksjon, ingen er uten potensielle problemer for rask tracheal drypping i store årskull av mus. I det foreliggende papir, er en enkel og rask metode som er beskrevet som lar en undersøker for å utføre slike instillasjoner på en effektiv måte. Metoden krever ingen spesielle verktøy eller belysning og kan læres med svært lite praksis. Det innebærer bedøvelse en mus, lage et lite snitt i nakken for å visualisere luftrøret, og deretter innføring av et intravenøst ​​kateter direkte. Den lite snitt er raskt lukket med vevlimet, og musene får lov til å komme seg. En dyktig student eller tekniker kan gjøre instillations til en gjennomsnittlig hastighet på 2 min / mus. Når tHan kreft er etablert, er det ofte et behov for kvantitativ histologisk analyse av lungene. Tradisjonelt patologer vanligvis ikke gidder å standardisere lunge inflasjon under fiksering, og analysene er ofte basert på et poengsystem som kan være ganske subjektiv. Selv om dette kan noen ganger være tilstrekkelig tilfredsstillende for grove beregninger av størrelsen av en lungetumor, en hvilken som helst passende stereological kvantifisering av lunge struktur eller celler krever en reproduserbar fremgangsmåte fiksering og påfølgende lungevolummåling. Her beskriver vi enkle pålitelige rutiner for både fikse lungene under press og deretter nøyaktig måling av fast lungevolum. Det eneste kravet er en laboratorie balanse som er nøyaktig over et område på 1 mg-300 g. Prosedyrene er presentert her og dermed kunne forbedre muligheten til å opprette, behandle og analysere lunge kreft hos mus.

Introduction

For en rekke grunner, lungekreft har ikke blitt omfattende undersøkt i mus. En grunn til dette er at tilgang til lungen er meget vanskelig in vivo, og kvantitativ analyse av faste lungene vanligvis ikke utført. Metodene som beskrives i denne artikkelen er konstruert for å avhjelpe denne situasjonen. Målene her er å beskrive enkle metoder som vil i stor grad hjelpe til oppsett og analyse av muse lungene med lungekreft eller annen patologi. Mens ingen av disse metodene er helt nytt, de har ikke blitt presentert sammen som frittstående metoder i forenklet måte som beskrevet her.

Det har vært en rekke manuskripter som er beskrevet fremgangsmåter for intubasjon av musen lunge primært i den hensikt å gjøre repetisjons lungefunksjon eller bronkoalveolar lavage på individuelle mus i de langsgående studier. Siden den opprinnelige papir, har det vært flere andre papirer som har beskrevet ulike tilnærminger til mouse intubasjon ^{1 -9.} Mens alle disse metodene kan brukes med hell, de vanligvis krever betydelig trening, og er ofte ikke uten en nontrivial strykprosent. I tillegg, for å utføre lungemålinger funksjon, må kanylen for å passe inn i luftrøret godt nok slik at det ikke er noen luftlekkasje. Imidlertid er en annen praktisk anvendelse for intubasjon å levere spesifikke midler (kreftceller eller andre fornærmelser) eller terapeutiske legemidler direkte til lungene. En slik fremgangsmåte krever ikke en tettsittende kanyle og heller ikke noen avansert lungefunksjon utstyr. Det nye trekk ved denne fremgangsmåten vist her omfatter et mindre kirurgisk inngrep som tillater intubasjon uten noen mulighet for kanylen inn i spiserøret. Denne enkle tilnærmingen gjør vellykket intubasjon med relativt lite trening eller erfaring. Så mange som 30 mus / time kan behandles ved hjelp av denne tilnærmingen med en feilrate som nærmer seg null.

Når tHan-mus er klar til å bli ofret, skadde eller kreft i lungene kan deretter bli fjernet for histologisk og patologisk analyse. Imidlertid, for å oppnå ønsket kvantifisere noen histologiske variabler for sammenligning med andre lungene, er det viktig å standardfesteprosedyrer og riktig kvantifisere den faste lungevolum ^10. Dette dokumentet beskriver i detalj de enkle prosedyrer som tillater standardiserte festeprosedyrer, så vel som en metode for å måle den faste lungevolum. Volumet er en viktig metrisk i kvantifiseringen av histologi, siden uten et slikt volum bestemmelse, kan bare relative tettheter måles ^10. Når lungevolumet er kjent, men absolutte målinger av celler og andre strukturelle målinger i lungen kan deretter kvantifiseres.

Protocol

Den følgende protokollen beskriver et system som fungerer godt i 20-35 g mus. Fremgangsmåten kan lett kunne tilpasses større eller mindre mus bare ved å endre kateteret størrelse. Alle dyre protokoller ble godkjent av Johns Hopkins-universitetet Animal Care og bruk komité.

1. Lung Instillasjon

1. Velg en kommersiell one-tommers lang 20 g intravenøs kanyle skal brukes for intubasjon.
2. Endre kateterspissen manuelt å bøye den til å generere en svak krumning på spissen som illustrert i figur 1.
3. Bedøve mus med en blanding av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (15 mg / kg) injisert IP, og bekrefter anestesi ved fravær av refleks bevegelse. Påfør veterinær salve på øynene umiddelbart etter anestesi. Umiddelbart etter anestesi søke veterinær salve på øynene og gi carprofen (5-10 mg / kg SQ) for post kirurgisk og drypping analgesi.
4. Plasser mouse liggende på en skrå plattform. Som vist i figur 2, et stort kontor perm med sutur løkker tapet på virker utmerket godt.
5. Barbere ventral del av nakken og rengjøre og desinfisere nakken med 70% alkohol. Med nye latex- og pulverfrie hansker, bruke kirurgiske instrumenter desinfisert med 70% alkohol.
6. Ved hjelp av skarpe sakser lage et lite kirurgisk innsnitt i halsen omtrent 12 mm under den nedre fortann.
7. Med en tang trekker forsiktig på huden i nakken caudally til ventral vegg av luftrøret kan sees.
8. Forsiktig trekke tungen og stikk kanylen med bøyd spiss vippet mot ventral overflaten av musen. Som i 1.4, trekker forsiktig på huden i nakken, og sette kanylen inn i luftrøret.
   MERK: Med litt trening, vil kateteret være synlig på vei ned i luftrøret. Hvis det går i spiserøret, så vil det ikke være noen visuelle glimt av kateteret bevegelse. Ingen snitter laget i luftrøret.
9. Når kateteret er sett i luftrøret i halsen, avansert det ca 5 mm for å være pålitelig passert stemmebåndene, men fortsatt godt over carina.
10. Forbered deg på å innpode opptil 50 ul væske ved å injisere gjennom kateteret med en gel lasting pipettespissen. Plasser spissen i luer navet, men før injisering utseende forsiktig for å observere bevegelsen av fluidet i spissen synkront med musens puste. Deretter injisere instillate.
11. Med en 1 ml sprøyte, straks gjør en forholdsvis hurtig oppblåsning av 0,6 ml av luft inn i lungene gjennom kateteret for å bidra til å fordele væsken dypt i lungene. Fjern kanylen.
12. Fjern kanylen.
13. Bruk en liten mengde cyanoacrylate lim for å lukke den lille operasjonssåret som per pakningsvedlegget instruksjoner for VetBond. Plasser mus i individuelle bur og visuelt overvåke dem før de våkner opp og oppfører seg normalt uten noen indikasjon på discomfort.

2. Lung Fixation

Merk: Når alle eksperimentelle prosedyrer er gjort i en mus, kan lungene klargjøres for histologisk behandling ved fiksering med formaldehyd (eller en hvilken som helst annen ønsket fikseringsmiddel).

1. Ofre mus med en IACUC akseptabel prosedyre. For representant musen vist i videoen, er halshugging av en bedøvet mus brukes.
2. Utfør en trakeostomi (hvis det ikke allerede gjort) ved kirurgisk utsette ventral side av luftrøret, noe som gjør et lite kutt, og setter inn en 18 G spire nålespissen inn i luftrøret, og knytte det med tråden.
3. Åpne forsiktig thorax med et midtlinjesnitt, klippe bort mellomgulvet, og fjern side brystet vegger for å eksponere lungene.
4. Koble luer enden av nålen til et reservoar på et ringstativ inneholdende formaldehyd. Se figur 3.
5. Angi at toppflaten av formaldehyd 25 cm over nivået for den mouSE. Se figur 3. Neste sørge for at det ikke er luft i festerøret ved å kjøre væske ut i enden av en stoppekran. Koble luer enden av tracheal kanyle til reservoaret slangen. Åpne stoppekranen å blåse lungene med formaldehyd. La lungene under trykk i minst 20 min.
6. Åpne stoppekranen å blåse lungene med formaldehyd. La lungene under trykk i minst 20 min.
7. Deretter feste luftrøret forbi enden av stussen nålen. Det kan bidra til å trekke tilbake sakte på nålen for å avdekke mer av uncannulated luftrøret. Når bundet sikkert, fjerne stoppekran.
8. Nøye dissekere ut lungene.
9. Plasser lungene i formaldehyd over natten. Lengre ganger er fine, og noen flekker eller prosedyrer kan spesifisere bestemte tider. Også andre flytende fiksativ, slik som z-fix kan brukes for instillering og nedsenkning.
10. Før ytterligere histologisk behandling, måleden faste lungevolum som beskrevet neste.

3. Måling av Fast lungevolum

1. Måle lungevolumet ved hjelp av Archimedes prinsipp som vist i figur 4. Fjern det faste lunge fra formaldehyd og dissekere hjerte og en hvilken som helst annen ikke-lungevev.
2. Bruk en tidligere konstruert enkel hjemmelaget ledning support enhet som brukes til å holde lungene helt under vann.
   MERK: Denne enheten må gjøres kompatibel med hvilken balanse blir brukt. En typisk anordning er vist i figur 5 er laget av plast pipetter og tynne (20 G) wire. Dette systemet fungerer godt med balansen som brukes i videoen, men kan lett tilpasses de fleste laboratorievekter.
3. Plasser begerglass med en ≈200 ml vann på balanse og tare med bærekassen på plass i vannet. Se figur 6 Fjern metallburet.; plassere lunge på vannoverflaten, og trykk under vannmed buret.
4. Spill vekten på balansen. Dette antallet reflekterer den mengde vann fortrenges, og er således et direkte mål på lungevolum. Vær nøye med å sørge for at lungene eller sutur eller noen del av ledningen buret ikke berører sidene eller bunnen av begeret.
5. For nøyaktighet, gjenta denne målingen. Fjerne lunge fra vannet, og tørt på en vev. Tare begeret med bur på plass igjen og gjenta målingen lungevolum. De to volummålinger skal da være et gjennomsnitt av.
   MERK: Hvis lungene igjen i formalin i mer enn omtrent en uke, vil luften i lungene bli oppløst i væsken. Når dette skjer, vil den tette synke, slik at det ikke lenger er nødvendig å bruke en hvilken som helst anordning som i figur 5 for å holde lungen under vann. I et slikt tilfelle volumet kan måles ved ganske enkelt ved å holde lungen av en av de sutur strengene til det er helt nedsenket, som vist i figur 4.

Representative Results

Fremgangsmåten beskriver i den første protokoll ikke i seg selv medføre noen generaliserte resultater. Den beskriver bare en meget pålitelig metode for å innpode stoffer direkte inn i luftrøret. Figur 7 viser et eksempel på en lunge der trypanblått ble innpodet med metoden som er beskrevet her. Det er utbredt fordeling av fargestoffet, i likhet med det som har blitt observert med andre fargestoffer eller sporstoff som gis direkte inn i luftrøret eller mus ^11,12. Vi har også brukt denne metoden til å levere enten bleomycin eller elastase til lungene, noe som resulterer i utstrakt fibrose eller emfysem, respektivt.

Prosedyrene som beskrives for å kvantifisere de strukturelle endringene i postmortem lungene gi data på lungevolum fast ved et trykk på 25 cm H _{2 O.} Slike volum målinger er avgjørende for å konvertere påfølgende objektive histologiske målinger av celle eller vev tettheter i totale antallet ^10. Dette papiret bare deskriftlærde midler til å få en svært nøyaktig lungevolum. Etter ni uker gamle 10-12 sunn Balb / c-mus målte vi en gjennomsnittlig (± SD) festet lungevolum på 0,82 ± 0,09 ml med lungevolum venstre er omtrent 30% av totalen. I Balb / c-mus som ble gitt 3 U av pankreatisk elastase (med metoden som er beskrevet i denne artikkelen) for å generere eksperimentell emfysem, økte lunge fast volum til 1,15 ± 0,13 ml, med den venstre lunge fraksjonen resterende 30%.

Figur 1: Intravenøst ​​kateter med svakt buet spiss benyttes for instillasjon.

Figur 2: 3-skrånende ringperm som brukes til å understøtte mus for intubasjon Dette bindemiddelet satt opp for å holde 3 mus..

Fig. 3: Formalin fylt reservoar på ring står koblet til mus, med toppen av fluid satt 25 cm over musen Denne fiksering bør normalt skje i en avtrekkshette.

Fig. 4: Archimedes prinsipp Vekten av vannet fortrengt av en neddykket gjenstand er lik volumet av objektet. Fordi den tette beholder som normalt noe gjenværende luften, er en innretning som i figur 5 er nødvendig for å holde den tette helt nedsenket.

Figur 5: Lab laget støtte for å holde lungene helt under vann Device.konstruert fra plastpipetter og metalltråd.

Figur 6: Laboratorium skalaer med beger og tarerte neddykking enheten klar for lungevolum måling.

Figur 7: Eksempel på en lunge gitt trypanblått intubasjon gjennom kateteret.

Discussion

Fremgangsmåtene som beskrives her har flere fordeler. Først nødvendig utstyr er enkel og rimelig. For det andre kan den intubasjon raskt gjøres med få feil. For det tredje, kan evnen til å feste lungene ved et konstant trykk, og deretter måle den faste lungevolumet riktig kvantifisering av strukturer eller celler i lungen ^10.

En mulig ulempe til intubasjon er mindre operasjon. Dette kan begrense muligheten til å gjenta prosedyren dersom en 2 ^nd drypping er nødvendig. Men med forsiktig kirurgi og påføring av klebemidlet har vi vært i stand til rutinemessig å gjøre en andre instillation en uke eller to senere. Hvis kontinuerlige gjentatte instillations er nødvendig eller om gjentatte lungefunksjonstester er nødvendig, kan en annen intubasjon tilnærming være mer ønskelig ^13,14.

Ved å gjøre det drypping, er det flere praktiske problemstillinger som bør nevnes. Det er viktig to være så skånsom som mulig med bevegelse av tungen i den innledende åpning av munnen. Hvis tang blir brukt, bør spissene være dekket med gummi slangen, siden det er lett å skade tungen, og dette kan føre til død av mus. Selv om metodene her ble utformet for intubasjon av mus som er eldre enn 6 uker, kan de lett tilpasses til yngre mus.

Våre instillasjon fremgangsmåte ble opprinnelig utviklet som et alternativ til fremgangsmåten i munnhule og svelg aspirasjon ^11. Selv om denne sistnevnte metode kan lett lært, forblir det faktiske volum leveres til lungene usikker, ettersom noe av det instillate forblir i svelget og blir svelget. Med en direkte drypping inn i luftrøret og påfølgende lunge inflasjon som vi demonstrere her, er instillate direkte levert til lungene. Det er verdt å merke seg at selv om det er mulig å bruke intubering for å levere stoffer direkte til luftrøret ^11,12, slik intubasjon kan damage de øvre luftveiene eller stemmebåndene, og generelt krever et mye høyere nivå av trening for å sikre 100% suksessrate på at vår prosedyre tillater.

Fiksering prosedyren vi beskriver er i likhet med hva mange etterforskere bruke. Det er ofte litt variasjon i inflasjonstrykket som benyttes for fiksativ, men vi føler at 25 cm H _{2 O} er et rimelig kompromiss som holder lungen fullt oppblåst uten mulig skade fra over-inflasjon. Det bør imidlertid bemerkes, at selv om det kan se ut til at en lunge blåst opp med fluid til 25 cm H _{2 O} bør være på et volum nær det totale lungekapasitet kan være med oppblåsing, ved 35 cm H _{2 O,} er denne langt fra sannheten. Faktisk inflasjons med fiksativ resulterer generelt i et volum på 70% av luftlungekapasitet ^15,16. Og med påfølgende behandling med parafin embedding, er trolig under funksjonell residual ca effektiv lungevolum sett i histologiske snittpacity (FRC). Den vanligste fiksativ er formalin eller z-fix, men for immunologisk farging, er en glutaraldehye blanding ofte nødvendig. Etterforskerne må velge et fiksativ avhengig av hva som ønsker å være farget, men videre diskusjon av optimal fiksativ er utenfor rammen av denne metoder papir.

For å kunne gjøre riktig kvantitativ analyse av histologiske snitt er det viktig å ha en måling av lungevolum ^10. Selv om det er mulig å få lungevolum fra en fullstendig sekvens av seriesnitt (Cavalieri metoden), i muse lungene er det ofte enklere å bare måle fast lungevolum som vi har beskrevet i dette dokumentet og video. Prosedyren beskriver vi tar bare sekunder å gjøre og bør rutinemessig gjøres med alle lungekreftfikseringer. Husk imidlertid at volumet dermed måles ikke står for noe krymping med påfølgende behandling og embedding, og hvis dette er viktig, bør den Cavalieri metodebli brukt. En endelig notat om dette fast volum målingen er at brøkdel av lungevolum i venstre lunge i de faste lungene er betydelig mindre enn det som er blitt målt in vivo. CT-avbildning av lungene in vivo av to stammer av mus ved funksjonell restkapasiteten viste venstre lunge til å være omtrent 40% av den totale ^17, mens det generelt er bare 30% i ovennevnte målinger fra lungene låst på 25 cm H _{2 O} . På det nåværende tidspunkt har vi ikke forstå hvorfor dette skulle være så forskjellig, men det bør holdes i bakhodet når analysere endringer i kvantitative histologisk analyser. Med hensyn til studier av lungekreft, har en måling av lungevolumet muliggjør en undersøker for å normalisere data på riktig måte på bestemte kjemiske desnsities eller tettheten av forskjellige celletyper i absolutte tall i hele tumoren eller hele lungen.

I sammendraget, intubasjon prosedyren beskriver her er billig å dikteog enkel å bruke, og det bør sette de fleste etterforskere og laboratorieteknikere til raskt å lære å lykkes innpode væsker inn muse lungene med relativt liten erfaring. I tillegg er feste prosedyrer og lungevolummåling for histologisk analyse av lungene tilveiebringe et middel for riktig repeterbar og kvantitativ analyse av lungeceller og lunge struktur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors