Summary
Цель данной работы является описание простых методов, которые значительно помочь в настройке и анализа легких мышей с раком легких или других патологий. Мы представляем 3 протоколы просто и надежно выполнять инстилляций легких, фиксация и измерения объема легких.
Abstract
Возможность привить живые агенты, клетки, или химических веществ непосредственно в легких без ранили и убивали мышей является важным инструментом в исследовании рака легких. Хотя существует несколько методов, которые были опубликованы, показывающий, как интубации мыши для измерения функции легких, ни одна из них не потенциальных проблем для быстрого трахеи инстилляции в больших когортах мышей. В настоящей работе, простой и быстрый способ описан, что позволяет следователю для проведения таких инстилляций в эффективной манере. Метод не требует каких-либо специальных инструментов или освещение и могут быть извлечены с очень небольшой практики. Она включает в себя обезболивающее мышь, делая небольшой разрез на шее, чтобы визуализировать трахею, а затем вставить внутривенный катетер непосредственно. Небольшой разрез быстро закрыл с клеем ткани, и мыши могут восстановить. Квалифицированный студент или специалист может сделать инстилляций в среднем 2 мин / мышь. После того, как тОн рак установлено, существует потребность часто для количественного анализа гистологического легких. Традиционно патологи обычно не беспокоить, чтобы стандартизировать инфляции легких во время фиксации, и анализы часто основывается на балльной системе, что может быть весьма субъективным. Хотя это может иногда быть достаточно адекватными для грубых оценок размера опухоли легких, любой собственный стереологического количественное структуры легких или клеток требует воспроизводимый процедуру фиксации и последующего измерения объема легких. Здесь мы опишем простые надежные процедуры и фиксации легкие под давлением, а затем точного измерения фиксированного объема легких. Единственное требование состоит в лабораторных весах с точностью, что это в диапазоне от 1 мг-300 г. Процедуры, представленные здесь, таким образом, может значительно улучшить способность создавать, рассматривать и анализировать рак легких у мышей.
Introduction
Для ряда причин, рак легких не был широко изучен в мыши. Одной из причин этого является то, что доступ к легких очень трудно в естественных условиях, и количественный анализ основных легких обычно не делается. Методы, описанные в этой статье, предназначены для исправления этой ситуации. В данном Цели описать простые методы, которые значительно помочь в настройке и анализа легких мышей с раком легких или других патологий. В то время как ни один из этих подходов не совершенно новые, они не были представлены вместе в виде отдельных методов в упрощенном виде как описано здесь.
Там было несколько рукописей, которые, описанных методов для интубации легких мышей в первую очередь с целью ведения повтора функции легких или бронхоальвеолярного лаважа в отдельных мышей в продольных исследованиях. С этого оригинальной статье, было несколько других документов, которые описаны различные подходы к МОВе интубация 1 -9. В то время как все эти методы могут быть с успехом использованы, они обычно требуют значительной подготовки, и часто не без нетривиального отказов. Кроме того, для того, чтобы проводить измерения функции легких, канюля должна соответствовать трахею достаточно плотно, так что нет утечки воздуха. Тем не менее, другой практическое применение интубации является предоставление конкретных агентов (раковые клетки или другие оскорбления) или терапевтических лекарственных средств непосредственно в легкие. Такая процедура не требует плотно прилегающую канюли ни какой-либо сложный функцию оборудование легких. Роман особенность этого способа, показанного здесь включает в себя незначительные хирургические процедуры, что позволяет интубации без возможности канюли, входящего в пищевод. Этот простой подход позволяет успешно интубации с относительно небольшим подготовки или опыта. Целых 30 мышей / час можно лечить с помощью этого подхода с отказов к нулю.
После того, как тон мышей готовы принести в жертву, поврежденные или раковые легкие могут быть удалены для гистологического и патологического анализа. Тем не менее, для того, чтобы должным образом количественно любые гистологические переменные для сравнения с другими легких, важно, чтобы стандартизировать процедуры фиксации и правильно количественно фиксированный объем легких 10. Эта статья подробно описывает простые процедуры, позволяющие стандартизированных процедур фиксации, а также способ измерения фиксированного объема легких. Объем является важным метрики в количественной оценке гистологии, так как без такого определения объемной, только относительные плотности может быть измерена 10. После того, как объем легких Известно, однако, абсолютные измерения клеток и других структурных измерений в легких может быть количественно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол описывает систему, которая хорошо работает в 20-35 г мышей. Метод может быть легко адаптирована к большим или меньшим мышей, просто изменив размер катетера. Все протоколы животных были утверждены университета Комитета по уходу и использованию животных Джона Хопкинса по.
1. Внушение легких
- Выберите коммерческого один дюйм длиной 20 г внутривенно канюли, чтобы использовать для интубации.
- Измените катетера вручную сгибая ее, чтобы создать небольшое искривление на кончике, как показано на рисунке 1.
- Обезболить мышь смесью кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (15 мг / кг) вводили IP-и подтвердить анестезии отсутствие рефлекторной движения. Применить ветеринарной мазь на глазах сразу после анестезии. Сразу же после анестезии применяются ветеринарной мазь на глаз и дать карпрофена (5-10 мг / кг SQ) для послеоперационного обезболивания и закапывания.
- Поместите муSE на спине на наклонной платформе. Как показано на рисунке 2, большой офис связующего с шовных петель выявляются на работах отлично.
- Бритье вентральной части шеи и чистить и дезинфицировать область шеи с 70% алкоголя. С новыми latex- и порошковым свободных перчатки, использовать хирургические инструменты дезинфицируют 70% спиртом.
- Использование острыми ножницами сделать небольшой надрез в хирургическое шеи примерно 12 мм ниже нижнего резца.
- С пинцетом осторожно потяните кожу на шее каудально до брюшной стенки трахеи не может быть видно.
- Аккуратно убрать язык и вставьте канюли с загнутым кончиком наклоненной в сторону брюшной поверхности мыши. Как и в 1.4, осторожно потяните на коже в области шеи и вставьте канюлю в трахею.
ПРИМЕЧАНИЕ: После небольшой практики, катетер будет видно перемещение вниз по трахее. Если он идет в пищевод, то не будет никаких визуальных прицельной движения катетера. Нет разрезывыполнены в трахею. - Как только катетер видел в трахее в шее, расширенный это около 5 мм, чтобы быть надежно передается голосовые связки, но все еще значительно выше киля.
- Подготовьте привить до 50 мкл жидкости путем инъекции, через катетер с наконечником пипетки гель загрузки. Поместите кончик в Луер хаб, но прежде, чем тщательно инъекционных взгляд, чтобы наблюдать за движением жидкости в наконечник синхронного с дыханием мыши. Тогда вводить instillate.
- С 1 мл шприца, немедленно делают относительно быстрое надувание 0,6 мл воздуха в легкие через катетер, чтобы помочь распределить жидкость глубоко в легкие. Удалить канюлю.
- Удалить канюлю.
- Используйте небольшое количество клея цианакрилатного, чтобы закрыть рану небольшой хирургической согласно инструкции, вложенной в упаковку для VetBond. Место мышей в отдельных клетках и визуально контролировать их, пока они не проснутся и ведут себя нормально без указания discomfорт.
2. Фиксация легких
Примечание: После того как все экспериментальные процедуры сделаны в мыши, легкие могут быть подготовлены для гистологического обработки фиксации с формальдегидом (или любой другой желаемой фиксатора).
- Жертвоприношение мышь с IACUC приемлемой процедуры. Для представительства мыши, показанной на видео, шейки дислокации наркозом мыши используется.
- Выполните трахеостомия (если это еще не сделано) хирургическим путем воздействия на брюшной стороне трахеи, делая небольшой разрез, и вставив кончик иглы заглушки 18 G в трахею, и связывая его с резьбой.
- Осторожно откройте грудную клетку с срединный разрез, срежьте диафрагму и снимите боковые стенки грудной клетки, чтобы разоблачить легкие.
- Подключите конец Люэра иглы в резервуар на кольцевой подставке, содержащей формальдегид. Смотрите рисунок 3.
- Установите верхнюю поверхность формальдегида 25 см выше уровня муSE. Смотрите рисунок 3. Затем убедитесь, что там нет воздуха в трубке фиксации запустив жидкость из конца краном. Подключение конец Люэра трахеи канюли с трубкой резервуара. Откройте кран, чтобы раздуть легкие с формальдегидом. Оставьте легкие под давлением, по крайней мере 20 мин.
- Откройте кран, чтобы раздуть легкие с формальдегидом. Оставьте легкие под давлением, по крайней мере 20 мин.
- Далее, галстук трахеи за конец заглушки иглой. Это может помочь тянуть обратно медленно на иглу, чтобы выставить больше uncannulated трахеи. Когда он связан надежно, снять кран.
- Осторожно рассекают из легких.
- Поместите легкие в формальдегид ночь. Более длительное время являются штраф, и пятна или процедуры могут указать конкретные раз. Кроме того, любые другие жидкие фиксаторы, такие как г-исправление может быть использован для инстилляции и погружения.
- Перед дальнейшим гистологическим обработки, измеренияфиксированной объем легких, как описано в следующем.
3. Измерение фиксированной легких Том
- Измерьте объем легких, используя принцип Архимеда, как показано на рисунке 4. Снимите фиксированный легких от формальдегида и анализировать сердце и любой другой не-легочную ткань.
- Используйте ранее построенный простой самодельный провод опорное устройство, которое используется, чтобы сохранить легкие полностью под водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это устройство должно быть совместимы с какой баланс используется. Типичным устройство, показанное на фиг.5, изготовлены из пластика и пипетки тонкой (20 г) провод. Эта система хорошо работает с балансом, используемого в видео, но может быть легко адаптирована для большинства лабораторных весов. - Поставьте стакан с ≈200 мл воды на балансе и тары с опорной клетки на месте в воде. Смотрите рисунок 6 Снимите металлическую клетку. разместить легких на поверхности воды и под водой нажмитес клеткой.
- Запишите вес на баланс. Это число отражает объем вытесненной воды и, таким образом, прямое измерение объема легких. Будьте осторожны, чтобы убедиться, что легкие или шов или любую часть проволоки клетке не трогать стороны или дно стакана.
- Для точности, повторять это измерение. Удалить легких от воды, и сухой на ткани. Тары стакан с клеткой в месте и повторить измерение объема легких. Два измерения объема должны быть усреднены.
Примечание: Если легкие остаются в формалине в течение более чем примерно за неделю, воздух в легких будет растворяться в жидкости. Когда это происходит, легких будет опускаться, так что больше не нужно использовать любое устройство, как на рисунке 5, чтобы сохранить легкое водой. В таком случае объем может быть измерена простым путем проведения легкие одной из строк шовных, пока не будет полностью погружен, как показано на рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедура описания в протоколе первого само по себе не приведет к каким-либо обобщенных результатов. Это описывает только очень надежные средства, чтобы привить вещества непосредственно в трахею. Рисунок 7 показывает пример легкого, в котором трипанового синего вливали со способом, описанным здесь. Существует широкое распределение красителя, подобно тому, что было показано с другими красителями или индикаторов, приведенных непосредственно в трахею или мышей 11,12. Мы также использовали этот метод для доставки либо блеомицин или эластазы в легких, что приводит к широкому распространению фиброза и эмфиземы легких, соответственно.
Процедуры, описанные для количественного структурные изменения в посмертных легких представляет данные о легочных объемов основных при давлении 25 см H 2 O. Такие измерения громкости необходимо преобразовать последующие беспристрастные гистологические измерения плотностей клеток или тканей в общей численности 10. Эта статья только де-писцы средства для получения очень точного объема легких. В девяти 10-12 недельных здоровым BALB / C мышей мы измерили среднее (SD) фиксированный объем легких на 0,82 ± 0,09 мл слева объем легких составляет примерно 30% от общей суммы. В линии BALB / C мышей, получавших 3 U из панкреатической эластазы (с методом, описанным в данном документе), чтобы создать экспериментальную эмфизема, легких фиксированный объем увеличивается до 1,15 ± 0,13 мл, с левой фракции легких оставшихся 30%.
Рисунок 1: внутривенный катетер с наконечником слегка изогнутой, используемого для закапывания.
Рисунок 2: наклонных 3-кольцо связующего, используемого для поддержки мышей для интубации Это связующее создать провести 3 мышей..
Рисунок 3:. Формалин заполнено водохранилище на ринге стоят подключен к мыши, с верхней жидкости установлен 25 см выше мыши Это фиксация как правило, следует сделать в вытяжном шкафу.
Рисунок 4:. Архимеда принцип Вес воды, вытесненной погруженной объекта равен объему объекта. Потому что, как правило легких сохраняет некоторую остаточную воздуха, устройство как показано на рисунке 5 необходимо, чтобы держать легкие полностью погружен в воду.
Рисунок 5: Лаборатория сделал поддержку для сохранения легкие полностью подводный аппарат.построен из пластиковых пипеток и металлической проволоки.
Рисунок 6: Лабораторные весы с стакане и тарированный погружения устройства готовы для измерения объема легких.
Рисунок 7: Пример легкого данной трипановым синим через интубации катетера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедуры, описанные здесь, имеют несколько преимуществ. Во-первых необходимое оборудование является простым и недорогим. Во-вторых, интубации может быть быстро сделано с небольшим количеством ошибок. В-третьих, возможность устранить легкие при постоянном давлении, а затем измерить фиксированный объем легких позволяет правильно количественное структур или клеток в легких 10.
Одним из возможных недостатком интубации является малая хирургия. Это может ограничить способность повторить процедуру, если требуется 2-й закапывания. Тем не менее, при тщательном хирургии и нанесения клея мы смогли регулярно делать секунды закапывания в неделю или два позже. Если непрерывные повторные инстилляции требуется или если повторные исследования функции легких необходимы, другой интубация подход может быть более желательным 13,14.
При этом инстилляции, есть ряд практических вопросов, которые должны быть упомянуты. Важно, тO быть как можно более плавными с движением языка в начальной открыванием рта. Если щипцы используются, кончики должны быть покрыты резиновой трубки, так как легко повредить язык, и это может привести к гибели мышей. Хотя здесь методы были разработаны для интубации мышей старше 6 недель, они легко могут быть адаптированы для молодых мышей.
Наша методика инстилляции был первоначально разработан в качестве альтернативы методу ротоглотки аспирации 11. Хотя это последний способ может быть легко узнал, фактический объем доставлен в легкие остается неясным, так как некоторые из instillate остается в глотке и получает проглатывании. При прямом закапывании в трахею и последующей инфляции легких, как мы здесь продемонстрировать, то instillate доставляется в легкие. Стоит отметить, что, хотя можно использовать интубации, чтобы доставить вещества непосредственно в трахею 11,12, такие интубации может дамаг верхние дыхательные пути или голосовые связки, и в целом требует значительно более высокий уровень подготовки, чтобы обеспечить 100% успеха, что наша процедура позволяет.
Процедура фиксации мы описываем это похоже на то, использовать многие исследователи. Существует часто некоторые изменения в давлении воздуха, используемого для фиксатора, но мы считаем, что 25 см H 2 O является разумным компромиссом, который держит легких полностью надутый без возможного ущерба в результате чрезмерной инфляции. Следует отметить, однако, что, хотя это может показаться, что легкое надувают жидкости 25 см H 2 O должно быть в объеме близка к тому, общая емкость легких может быть с воздушным инфляции при 35 см Н 2 О, это далеко от истины. На самом деле, инфляция с фиксатором как правило, приводит в объеме на 70% мощности 15,16 воздуха легких. И с последующей обработкой с парафин, эффективный объем легких рассматривается в гистологических участков, скорее всего, ниже остаточной ок функциональнойpacity (FRC). Наиболее распространенным фиксатор формалином или г-фикс, но для иммунологического окрашивания, А glutaraldehye смесь часто требуется. Следователи должны выбрать закрепитель в зависимости от того, что необходимости быть окрашены, но дальнейшее обсуждение оптимального фиксатора выходит за рамки этого методы работы.
Для того чтобы сделать надлежащий количественный анализ гистологических участков важно иметь измерение объема легких 10. Хотя это возможно, чтобы получить объем легких от полной последовательности серийных срезов (метод Кавальери), в легких мышей часто проще просто измерить фиксированный объем легких, как мы описали в данном документе и видео. Процедура мы описываем занимает всего несколько секунд, чтобы сделать и должно быть сделано регулярно со всеми фиксаций легких. Имейте в виду, однако, что объем, таким образом, измеряется не зарегистрированы для любого усадки с последующей обработкой и вложения, и если это важно, метод Кавальери должениспользоваться. Последнее замечание относительно этого измерения фиксированного объема, что часть объема легких у левого легкого в основной легкие значительно меньше, чем то, что было измерено в естественных условиях. КТ изображений легких в естественных условиях двух линий мышей при функциональной остаточной емкости показали левого легкого, примерно 40% от общего 17, в то время как, как правило, только 30% в вышеуказанных измерений от легких, закрепленных на 25 см H 2 O , В настоящее время, мы не понимаем, почему это должно быть так различны, но она должна иметь в виду, при анализе изменений в количественном гистологическое анализов. Что касается исследований рака легких, имеющих измерение объема легких дает исследователю правильно нормализовать данные по конкретным химическим или desnsities плотности различных типах клеток к абсолютных цифрах в целом опухоли или всего легкого.
Таким образом, процедура интубации описывают здесь недорога в изготовлениии простой в использовании, и это должно позволить большинство исследователей и лаборантов быстро научиться успешно привить жидкостей в легких мышей с относительно небольшим опытом. Кроме того, процедуры фиксации и объема легкого измерения для гистологического анализа легких обеспечивают средства для правильного повторяемой и количественного анализа клеток легких и легочной структуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory Balance | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | Other balances can be used if they have a range of 1-300 g |
| 20 g Luer intravenous catheter | Insylte | Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva | |
| 500 ml laboratory bottle | Various | Several other possible vendors |
References
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab animal. 35, 39-42 (2006).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).
- Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives. Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).
- Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. In vivo measurement of lung volumes in mice. Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).
