Ingivningsmängder och Fixering metoder som är användbara i Mus Lung Cancer Research

Summary

Målet med detta dokument är att beskriva enkla metoder som i hög grad kommer att hjälpa i installationen och analys av muslungor med lungcancer eller andra sjukdomar. Vi presenterar 3 protokoll för att enkelt och tillförlitligt genomföra lunginstillationer, fixering, och mätningar lungvolym.

Abstract

Förmågan att ingjuta levande medel, celler, eller kemikalier direkt in i lungan utan att skada eller döda mössen är ett viktigt verktyg i lung cancerforskning. Även om det finns ett antal metoder som har publicerats som visar hur man intubation möss för lungmätningar funktion, ingen är utan potentiella problem för snabb luftrör instillation i stora grupper av möss. I föreliggande dokument är en enkel och snabb metod beskrivs som möjliggör en utredare att utföra sådana instillationer på ett effektivt sätt. Metoden kräver inga speciella verktyg eller belysning och kan läras med mycket lite träning. Den involverar anesthetizing en mus, vilket gör ett litet snitt i halsen för att visualisera luftstrupen, och sedan sätta in en intravenös kateter direkt. Den litet snitt snabbt stängd med vävnadslim, och mössen fick återhämta sig. En skicklig student eller tekniker kan göra instillationer i genomsnitt 2 min / mus. När than cancer är etablerad, finns det ofta ett behov av kvantitativ histologisk analys av lungorna. Traditionellt patologer brukar inte bry sig om att standardisera lung inflationen under fixering och analyser bygger ofta på ett poängsystem som kan vara ganska subjektiv. Även om detta kan ibland vara tillräckligt tillfredsställande för grova uppskattningar av storleken på en lungtumör, någon riktig stereologisk kvantifiering av lungstrukturen eller celler kräver en reproducerbar fixering förfarandet och efterföljande mätning lungvolym. Här beskriver vi enkla tillförlitliga förfaranden för både fastställande av lungorna under tryck och därefter noggrant mäta den fasta lungvolym. Det enda kravet är en laboratorie balans som är korrekt över ett område av 1 mg-300 g. De förfaranden som presenteras här på detta sätt kunde avsevärt förbättra förmågan att skapa, behandla och analysera lungcancer hos möss.

Introduction

Av ett antal skäl, lungcancer har inte studerats ingående i mus. Ett skäl till detta är att tillgång till lungan är mycket svårt in vivo och kvantitativ analys av fasta lungor är inte ofta görs. De metoder som beskrivs i detta dokument syftar till att råda bot på denna situation. Målen här är att beskriva enkla metoder som i hög grad kommer att hjälpa i installationen och analys av muslungor med lungcancer eller andra sjukdomar. Även om ingen av dessa metoder är helt nya, har de inte presenteras tillsammans som fristående metoder i förenklat sätt som beskrivs här.

Det har förekommit ett antal manuskript som har beskrivit metoder för intubation av muslungan främst i syfte att göra upprepa lungfunktion eller bronkoalveolärt lavage i enskilda möss i longitudinella studier. Sedan den ursprungliga papper, har det förekommit flera andra tidningar som har beskrivit olika sätt att mouse intubering ^{1 -9.} Även om alla dessa metoder kan användas med framgång, kräver de vanligtvis betydande utbildning, och är ofta inte utan en nontrivial felfrekvens. Dessutom, för att utföra lungmätningar funktion, måste kanylen för att passa i luftstrupen tätt nog så att det inte finns något luftläckage. Emellertid är en annan praktisk användning för intubation för att leverera specifika medel (cancerceller eller andra förolämpningar) eller terapeutiska läkemedel direkt till lungan. Ett sådant förfarande kräver inte ett åtsittande kanyl eller någon sofistikerad lungfunktionsutrustning. Det nya särdrag hos denna metod visas här involverar ett mindre kirurgiskt ingrepp som gör det möjligt för intubering utan någon möjlighet av kanylen in i matstrupen. Denna enkla metod möjliggör framgångsrik intubation med relativt lite utbildning eller erfarenhet. Så många som 30 möss / timme kan behandlas med denna metod med en felfrekvens närmar sig noll.

När than möss är redo att offras, de skadade eller cancer lungorna kan sedan tas bort för histologisk och patologisk analys. Men för att korrekt kvantifiera eventuella histologiska variabler för jämförelse med andra lungorna, är det viktigt att standardisera fixeringsförfaranden och korrekt kvantifiera den fasta lungvolym ^10. Detta dokument beskriver i detalj de enkla rutiner som gör att standardiserade fixeringsförfaranden samt ett sätt att mäta den fasta lungvolym. Volymen är en viktig måttenhet i kvantifieringen av histologi, eftersom utan en sådan volymbestämning, kan endast relativa densiteter mätas ^10. När lungvolymen är emellertid känt, absoluta mätningar av celler och andra strukturella mätningar i lungan kan därefter kvantifieras.

Protocol

Följande protokoll beskriver ett system som fungerar bra i 20-35 g möss. Metoden kan lätt kunna anpassas till större eller mindre möss bara genom att ändra kateterstorleken. Alla djurprotokoll godkändes av Johns Hopkins University Djurvård och användning kommittén.

1. Lunginstillation

1. Välj en kommersiell en tum lång 20 g intravenös kanyl som ska användas för intubering.
2. Ändra kateterspetsen manuellt böja den för att generera en liten krökning vid spetsen såsom illustreras i figur 1.
3. Söva musen med en blandning av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (15 mg / kg) injiceras IP och bekräfta anestesi genom frånvaron av reflexrörelse. Applicera veterinär salva på ögonen omedelbart efter anestesi. Omedelbart efter anestesi tillämpa veterinär salva för ögonen och ge karprofen (5-10 mg / kg SQ) för postoperativa och instilla smärtlindring.
4. Placera mouSE liggande på en sluttande plattform. Som visas i figur 2, ett stort kontor pärm med sutur slingor tejpade på verk mycket väl.
5. Raka den ventrala delen av halsen och rena och desinficera nackområdet med 70% alkohol. Med nya latex- och puderfria handskar, använd kirurgiska instrument desinficeras med 70% alkohol.
6. Använda vass sax gör ett litet kirurgiskt snitt i halsen ca 12 mm under den nedre framtand.
7. Med en pincett försiktigt dra huden i nacken caudally tills ventrala vägg luftstrupen kan ses.
8. Dra försiktigt tungan och för in kanylen med den böjda spetsen lutas mot den ventrala ytan av musen. Som i 1.4, dra försiktigt på huden i nacken, och för in kanylen i luftstrupen.
   OBS: Med lite övning kommer katetern vara synlig flytta ner i luftstrupen. Om det går i matstrupen, då blir det ingen visuell observation av kateterns rörelse. Inga snittgörs i luftstrupen.
9. När katetern ses i luftstrupen i halsen, avancerad det ca 5 mm för att vara tillförlitligt passerat stämbanden, men fortfarande en bra bit över carina.
10. Förbered dig på att ingjuta upp till 50 il vätska genom att injicera genom katetern med en gel lastning pipettspetsen. Placera spetsen i luer navet, men före injektion titta noggrant att observera rörelse av vätskan i spetsen synkront med musen andning. Sedan injicera instillat.
11. Med en 1 ml spruta, omedelbart göra en relativt snabb uppblåsning av 0,6 ml luft i lungorna genom katetern för att distribuera det flytande djupt i lungorna. Ta bort kanylen.
12. Ta bort kanylen.
13. Använd en liten mängd cyanoakrylatlim för att stänga den lilla kirurgiska såret enligt bipacksedeln anvisningar för VetBond. Placera möss i individuella burar och visuellt övervaka dem tills de vaknar upp och beter sig normalt utan någon indikation på discomfortera.

2. Lung Fixering

OBS: När alla experimentella procedurer utförs i en mus, kan lungorna bli klar för histologisk bearbetning av fixering med formaldehyd (eller någon annan önskad fixerings).

1. Offra musen med en IACUC acceptabelt förfarande. För den representativa musen visas i videon, är halsdislokation av en sövd mus används.
2. Utför en trakeostomi (om det inte redan gjort) genom att kirurgiskt exponera den ventrala sidan av luftstrupen, gör ett litet snitt, och infoga en 18 G stöta nålspets i luftstrupen, och knyta den med tråden.
3. Öppna försiktigt bröstkorgen med en mittlinjen snitt, skär bort membranet och ta bort sidoväggarna bröst att exponera lungorna.
4. Anslut luer änden av nålen till en reservoar på ett ringstativ innehållande formaldehyd. Se figur 3.
5. Ställ den övre ytan av formaldehyden 25 cm över nivån för MOUSE. Se figur 3. Nästa se till att det inte finns någon luft i fixerings slangen genom att köra vätska ur slutet av en kran. Anslut luer änden av trakeal kanyl till reservoaren slangen. Öppna kranen för att blåsa upp lungorna med formaldehyd. Lämna lungorna under tryck i minst 20 minuter.
6. Öppna kranen för att blåsa upp lungorna med formaldehyd. Lämna lungorna under tryck i minst 20 minuter.
7. Nästa, fästa luftstrupen bortom änden hos stubben nålen. Det kan underlätta att dra sig tillbaka långsamt på nålen för att exponera mer av uncannulated trakea. När bundet säkert bort kranen.
8. Försiktigt dissekera ut lungorna.
9. Placera lungorna i formaldehyd över natten. Längre tider är bra, och vissa fläckar eller förfaranden kan ange specifika tider. Också några andra flytande fixativ, såsom z-fix kan användas för instillation och nedsänkning.
10. Innan ytterligare histologiska behandling, mätaden fasta lungvolym såsom beskrivs härnäst.

3. Mätning av Fast lungvolym

1. Mät lungvolym med användning av Arkimedes princip som illustreras i fig 4. Avlägsna det fasta lungan från formaldehyd och dissekera hjärtat och alla andra icke-lungvävnad.
2. Använd en tidigare konstruerat enkel hemlagad tråd stödanordning som används för att hålla lungorna helt under vatten.
   OBS: Denna enhet måste göras förenlig med beroende balans används. En typisk anordning visas i fig 5 är tillverkad av plastpipetter och tunna (20 G) tråd. Detta system fungerar bra med balansen som används i videon, men kan lätt anpassas till de flesta laboratorievågar.
3. Placera en bägare med ≈200 ml vatten på balans och tara med stöd bur på plats i vattnet. Se figur 6 Ta bort metallburen. Placera lungan på vattenytan och tryck under vattenmed buren.
4. Registrera vikten på balansen. Detta antal återspeglar undanträngda vattenvolymen och är således ett direkt mått på lungvolymen. Var noga med att se till att lungorna eller sutur eller någon del av trådbur inte vidrör sidorna eller botten av bägaren.
5. För noggrannhet, upprepa denna mätning. Avlägsna lungan från vattnet, och torka på en vävnad. Tarera bägaren med buren på plats igen och upprepa lungvolym mätningen. De två volymmätningar bör då medelvärde.
   OBS: Om lungorna är kvar i formalin under mer än ungefär en vecka, kommer luften i lungorna lösas i vätskan. När detta händer kommer lungan sjunka, så det är inte längre nödvändigt att använda någon enhet såsom i fig 5 för att hålla lungorna under vatten. I ett sådant fall volymen kan mätas genom att helt enkelt genom att hålla lungan genom en av suturen strängar tills den är helt nedsänkt, såsom visas i fig 4.

Representative Results

Förfarandet beskrivs i det första protokollet inte i sig leda till några allmänna resultat. Den beskriver endast ett mycket tillförlitligt medel för att ingjuta ämnen direkt in i luftstrupen. Figur 7 visar ett exempel på en lunga där trypanblått instillerades med den här beskrivna metoden. Det finns en utbredd fördelning av färgämnet, liknande vad som har setts med andra färgämnen eller spårämnen ges direkt in i luftstrupen eller möss ^11,12. Vi har också använt denna metod för att leverera antingen bleomycin eller elastas till lungan, vilket resulterar i utbredd fibros eller emfysem, respektive.

De förfaranden som beskrivs för att kvantifiera de strukturella förändringar i postmortem lungor lämna uppgifter om lungvolym fastställdes vid ett tryck på 25 cm _H2O Sådana mätningar volym är nödvändiga för att konvertera efterföljande objektiva histologiska mätningar av cell- eller vävnadstätheterna i totala antalet ^10. Detta dokument endast debeskrivs hur medel till att skaffa en mycket noggrann lungvolym. I nio 10-12 veckor gamla friska Balb / c-möss mätte vi ett medelvärde (± SD) fast lungvolym av 0,82 ± 0,09 ml med vänster lungvolym är ca 30% av den totala. I Balb / c-möss som gavs 3 U av pankreatiskt elastas (med den metod som beskrivs i detta dokument) för att generera experimentell emfysem, ökade lungan fast volym till 1,15 ± 0,13 ml, med vänster lunga fraktion kvar på 30%.

Figur 1: Intravenös kateter med något krökt spets som används för instillation.

Figur 2: Lutande 3-ringpärmar används för att stödja möss för intubation Denna limbindning inrättats för att hålla 3 möss..

Figur 3:. Formalin fylld reservoar på ringen står i förbindelse med mus, med början i fluidum satt 25 cm ovanför musen Denna fixering bör normalt ske i ett dragskåp.

Figur 4:. Arkimedes Princip vikten av vattnet ersättas av en undervattensföremål ger volymen av objektet. Eftersom lungorna behåller normalt någon kvarvarande luft, erfordras en anordning såsom i fig 5 för att hålla lungan helt under vatten.

Figur 5: Lab gjorde stöd för att hålla lungorna helt undervattens enhet.konstruerad av plastpipetter och metalltråd.

Bild 6: Laboratoriumsvåg med bägare och tarerad nedsänkning enheten klar för lungvolymmätningen.

Bild 7: Exempel på en lunga given trypanblått genom intubation katetern.

Discussion

De förfaranden som beskrivs här har flera fördelar. Först den nödvändiga utrustningen är enkel och billig. För det andra kan den intubation vara snabbt gjort med få fel. För det tredje, förmågan att fixera lungorna vid ett konstant tryck, och sedan mäta den fasta lungvolym tillåter korrekt kvantifiering av strukturer eller celler i lungan ^10.

En möjlig nackdel för intubation är mindre operation. Detta kan begränsa möjligheten att upprepa proceduren om en ^2: a instillering krävs. Men med noggrann kirurgi och limappliceringen vi har kunnat rutinmässigt göra en andra indrypning en vecka eller två senare. Om kontinuerliga upprepade instillationer krävs eller om upprepade lungfunktionstester behövs, kan en annan intubation strategi vara mer önskvärt ^13,14.

Genom att göra instillationen, finns det flera praktiska frågor som bör nämnas. Det är viktigt to vara så skonsam som möjligt med rörelse av tungan i den första öppningen i munnen. Om pincett används, bör spetsarna täckas med gummislang, eftersom det är lätt att skada tungan, och detta kan leda till döden på musen. Även de metoder som här har utformats för intubation av möss som är äldre än 6 veckor, kan de enkelt anpassas till yngre möss.

Vår instillation förfarande ursprungligen utformad som ett alternativ till förfarandet enligt orofaryngeal aspiration ^11. Även om detta senare metoden kan lätt lärt sig, den verkliga volymen levereras till lungan fortfarande osäkert, eftersom en del av instillat kvar i svalget och blir förtäring. Med en direkt instillation i luftstrupen och efterföljande lung inflation som vi visar här är instillat levereras direkt till lungan. Det är värt att notera att även om det är möjligt att använda intubation för att leverera ämnen direkt till luftstrupen ^11,12, såsom intubation kan damage de övre luftvägarna eller stämband, och i allmänhet kräver en mycket högre nivå av utbildning för att säkerställa framgång 100% att vårt förfarande tillåter.

Fixeringsförfarandet vi beskriver liknar vad många forskare använder. Det finns ofta en viss variabilitet i inflationstryck som används för fixerings, men vi anser att 25 cm _H2O är en rimlig kompromiss som håller lungan helt uppblåst utan eventuella skador från över inflation. Det bör dock noteras att även om det kan tyckas att en lunga blåses upp med vätska till 25 cm _H2O bör vara en volym i närheten av vad den totala lungkapaciteten kan vara med luft inflationen på 35 cm _H2O, är detta långt ifrån sanningen. Faktum är att inflationen med fixeringsresulterar vanligtvis i en volym på 70% av luftlungkapacitet ^15,16. Och med efterföljande behandling med paraffininbäddning, sannolikt under funktionell resterande ca effektiv lungvolym sett i histologiska sektionerkapacitet (FRC). Den vanligaste fixerings är formalin eller z-fix, men för immunologisk färgning, är en Glutaraldehyd blandning krävs ofta. Utredare måste välja ett fixativ beroende på vad som behöver färgas, men ytterligare diskussion om den optimala fixerings ligger utanför ramen för denna metoder papper.

För att kunna göra en korrekt kvantitativ analys av histologiska sektioner är det viktigt att ha en mätning av lungvolymen ^10. Fastän det är möjligt att få lungvolymen från den fullständiga sekvensen av seriella sektioner (Cavalieri metoden), det är i muslunga ofta enklare att helt enkelt mäta den fasta lungvolym som vi har beskrivit i detta dokument och video. Proceduren beskriver vi tar bara några sekunder att göra och bör rutinmässigt gjort med alla lung upptagningar. Kom dock ihåg att volymen således mätas inte tar hänsyn till eventuella krympning med efterföljande bearbetning och inbäddning, och om detta är viktigt, Cavalieri metoden böranvändas. En sista anmärkning beträffande denna mätning fast volym är att den del av lungvolymen i den vänstra lungan i de fasta lungorna är betydligt mindre än den som har mätts in vivo. CT i lungorna in vivo av två stammar av möss vid funktionella residualkapacitet visade den vänstra lungan vara ca 40% av den totala ^17, medan det är i allmänhet endast 30% i ovanstående mätningar från lungor fixerade vid 25 cm _H2O . I dagsläget har vi inte förstår varför det skulle vara så annorlunda, men det bör hållas i åtanke när man analyserar förändringar i kvantitativa histologiska analyser. När det gäller studier av lungcancer, med en mätning av lungvolym gör en utredare att korrekt normalisera uppgifter om specifika kemiska desnsities eller tätheten av olika celltyper till absoluta tal i hela tumören eller hela lungan.

Sammanfattningsvis intubering förfarandet beskriver här är billig att tillverkaoch enkel att använda, och det bör göra det möjligt flesta utredare och laboratorietekniker för att snabbt lära sig att framgångsrikt ingjuta vätskor i mus lungorna med relativt liten erfarenhet. Dessutom förfaranden fixering och lungvolym mätning för histologisk analys av lungor ger ett medel för riktig repeterbar och kvantitativ analys av lungceller och lungstrukturen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors