Fare Akciğer Kanseri Araştırma Faydalı instillation ve Fiksasyon Yöntemi

Summary

Bu yazının amacı, büyük ölçüde akciğer kanseri ya da diğer patolojiler ile kurulum ve fare akciğerlerin analizine yardımcı olacak basit yöntemler tarif etmektir. Biz sadece ve güvenilir akciğer instilasyonlar, fiksasyon ve akciğer hacim ölçümleri yürütmek için 3 protokol sunuyoruz.

Abstract

Yaralanmasına veya fareler öldürmeden doğrudan akciğere canlı ajanlar, hücreleri veya kimyasal aşılamak yetenek akciğer kanser araştırmalarında önemli bir araçtır. Solunum fonksiyon ölçümleri için fareler entübe nasıl gösteren yayınlanmış bir dizi yöntem olmasına rağmen, hiçbiri farelerin büyük kohortlarda hızlı trakeal damlatma potansiyel sorunsuz vardır. Bu yazıda, basit ve hızlı bir yöntem etkin bir biçimde bu tür instilasyonları yürütmek için bir müfettiş sağlayan tarif edilmektedir. Yöntem, herhangi bir özel alet veya aydınlatma gerektirmez ve çok az uygulama ile öğrenilebilir. Bu, bir fare anestezi trakea görselleştirmek için boyun küçük bir kesi yapıyor ve daha sonra doğrudan bir intravenöz kateter takmadan içerir. Ufak bir kesik hızlı bir doku yapışkanı ile kapatılır ve farenin iyileşmelerine izin verilir. Yetenekli bir öğrenci ya da teknisyen 2 dk / fare ortalama hızında instilasyonları yapabilirsiniz. T kezKanser kurulduğunda da akciğerlere kantitatif histolojik analiz için bir ihtiyaç sık sık vardır. Geleneksel fiksasyon sırasında akciğer enflasyonu standardize etmek zahmet etmeyin, genellikle patolog ve analizler genellikle oldukça öznel olabilir bir puanlama sistemine dayanmaktadır. Bu bazen bir akciğer tümörü büyüklüğü brüt tahminler için yeterli yeterli olabilirken, akciğer yapısı veya hücrelerin herhangi bir uygun stereolojik miktar tekrarlanabilir tespit prosedürü ve sonraki akciğer hacmi ölçümünü gerektirir. İşte biz de baskı altında akciğerleri sabitleme ve daha sonra doğru sabit akciğer hacmini ölçmek için basit, güvenilir prosedürler açıklanmaktadır. Tek şart, 1 mg-300 g aralığında doğru olan bir laboratuar dengedir. Böylece burada sunulan prosedürleri büyük ölçüde farelerde akciğer kanserlerini oluşturmak tedavi ve analiz etme yeteneğini geliştirmek olabilir.

Introduction

Bir takım nedenlerden, akciğer kanseri yaygın farede çalışılmamıştır. Bunun bir nedeni, akciğere erişim in vivo olarak çok zordur ve sabit akciğer kantitatif analiz genel olarak yapılmaz olmasıdır. Bu yazıda anlatılan yöntemler bu durumu düzeltmek için tasarlanmıştır. Hedefler burada büyük akciğer kanseri ya da diğer patolojiler ile kurulum ve fare akciğerlerin analizine yardımcı olacak basit yöntemler tarif vardır. Bu yaklaşımlardan hiç biri bütünüyle yeni olmakla birlikte, burada tarif edildiği gibi basitleştirilmiş biçimde tek başına yöntemlerle bir araya sunulmamıştır.

Öncelikle uzunlamasına çalışmalarda bireysel farelerde tekrar akciğer fonksiyonunu veya bronkoalveoler lavaj yapmanın amacıyla fare akciğer entübasyon için yöntemler tarif etmişlerdir el yazması bir dizi olmuştur. Orijinal kağıt beri, mous farklı yaklaşımlar tarif var diğer bazı kağıtlar olmuşture entübasyon ^{1 -9.} Bu yöntemlerin tümü başarıyla kullanılabilir olsa da, genellikle önemli bir eğitim gerektirir ve bir nontrivial başarısızlık oranı olmadan sık sık değildir. Buna ek olarak, akciğer fonksiyon ölçümleri gerçekleştirmek amacıyla, kanül herhangi bir hava kaçağı olmaması için yeterince sıkı bir şekilde uyacak trakea gerekmektedir. Ancak, entübasyon başka pratik kullanım akciğere doğrudan belirli maddeler (kanser hücrelerini ya da diğer hakaret) ya da tedavi edici ilaçlar teslim etmektir. Böyle bir prosedür sıkı uydurma kanül ne de herhangi bir gelişmiş solunum fonksiyon ekipman gerektirmez. Burada gösterilen bu yöntemin yeni özelliği yemek borusu giren kanülün herhangi imkanı olmadan entübasyon izin veren küçük bir cerrahi prosedür gerektirir. Bu basit yaklaşım, nispeten daha az eğitim veya deneyime sahip başarılı entübasyon sağlar. En çok 30 fareler / saat sıfıra yaklaşan bir başarısızlık oranı ile bu yaklaşımı kullanılarak tedavi edilebilir.

T kezO fareler yaralı ya da kanserli akciğerler sonra histolojik ve patolojik analiz için kaldırılabilir, kurban edilecek hazırız. Ancak, düzgün diğer akciğerler ile karşılaştırıldığında herhangi bir histolojik değişkenleri ölçmek için, bu tespit prosedürleri standardize ve düzgün bir şekilde monte akciğer hacmini ¹⁰ ölçmek esastır. Bu yazıda ayrıntılı olarak standardize tespit usullerinin yanı sıra sabit akciğer hacmini ölçmek için bir yol sağlayan basit yordamlar açıklanır. Böyle bir hacim tespiti olmadan, sadece göreli yoğunlukları ¹⁰ ölçülebilir çünkü hacim, histoloji miktarının önemli bir ölçümdür. Akciğer hacmi bilinmektedir Ancak, bir kez hücreler ve akciğerde diğer yapısal ölçümler mutlak ölçüm daha sonra ölçülebilir.

Protocol

Aşağıdaki protokol 20-35 g farelerde iyi çalışan bir sistemi tarif eder. Yöntem basitçe kateter boyutunu değiştirerek büyük veya daha küçük farelere adapte olabilir. Tüm hayvan protokolleri Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Akciğer damlatma

1. Entübasyon için kullanılacak ticari 1-inç uzunluğunda 20 g intravenöz kanül Select.
2. El ile Şekil 1 'de gösterildiği gibi, uç bir hafif bir eğrilik oluşturmak için büküm kateter ucunu değiştirin.
3. IP ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (15 mg / kg) karışımı ile fare enjekte anestezisi, ve refleks hareketinin olmaması ile anestezi teyit etmektedir. Hemen anestezi sonrası gözlerde veteriner merhem sürün. Anestezi gözleri veteriner merhem uygulamak ve cerrahi sonrası ve aşılama analjezi için Karprofen (5-10 mg / kg SQ) vermek hemen sonra.
4. Mou yerleştirineğimli bir platform üzerinde se yatar. Şekil 2'de gösterildiği gibi, ameliyat dikiş ipliği döngüler ile büyük bir ofis birleştirici çok iyi işler bantlanmış.
5. Boyun ve temiz ventral bölümünü Tıraş ve% 70 alkol ile boyun alanı dezenfekte edin. Yeni latex ve pudrayla eldivenlerle,% 70 alkol ile dezenfekte cerrahi aletler kullanmayın.
6. Kullanımı keskin makas yaklaşık 12 mm alt kesici altında boyun küçük bir cerrahi kesi yapmak.
7. Bir forseps yavaşça boyun cildi çekme ile trakea ventral duvarı görülebilir kaudale kadar.
8. Yavaşça dilini geri çekin ve fare ventral yüzeyine doğru eğik bükük ucu ile kanül yerleştirin. 1.4 gibi boyun cilt üzerinde nazikçe çekin ve trakea içine kanül yerleştirin.
   NOT: Küçük bir uygulama ile, kateter trakea aşağı hareket görünür olacaktır. O yemek borusu giderse, o zaman kateterin hareketinin hiçbir görsel nişan olacak. Hiçbir kesiTrakea yapılır.
9. Kateter boyun trakea görüldüğü sonra, güvenilir olmak o yaklaşık 5 mm ileri ses telleri geçti ama yine de karinanın üstünde.
10. Bir jel yükleme pipet ile kateter içinden enjekte edilerek sıvının 50 ul kadar aşılamak hazırlayın. Diş hub ucu yerleştirin, ancak farenin nefes ucu senkron sıvı hareketini gözlemlemek için dikkatle göz enjekte etmeden önce. Ardından instillate enjekte.
11. 1 ml şırınga ile hemen akciğerlerde sıvı derin dağıtma yardımcı olmak için kateter yoluyla akciğerlere hava 0,6 ml nispeten hızlı enflasyonu yapın. Kanül kaldırın.
12. Kanül kaldırın.
13. Vetbond için paket eki talimatlarına uygun olarak, küçük bir cerrahi yara kapatma siyanoakrilat yapıştırıcı madde küçük bir miktar kullanın. Bireysel kafeslerde fareler yerleştirin ve uyanmak kadar görsel onları izlemek ve discomf herhangi bir gösterge olmadan normal davranmayaort.

2. Akciğer Fixation

Not: tüm deney prosedürleri bir farede yapılır, akciğerler formaldehid (veya arzu edilen herhangi fiksatif) ile sabitlenmesi ile histolojik işlem için hazır hale edilebilir.

1. Bir IACUC kabul edilebilir prosedüre fare Kurban. Videoda gösterilen temsili fare, bir anestezi fare servikal dislokasyon kullanılır.
2. Cerrahi, trakea ventral tarafında ortaya küçük bir kesim yaparak ve trakea içine 18 G saplama iğne ucu takarak, ve iplik ile bağlayarak (zaten bitmiş değilse) bir trakeostomi gerçekleştirin.
3. Dikkatle, orta hat kesi ile göğüs kafesi açmak için diyaframı kesip, ve akciğerler açığa lateral göğüs duvarları kaldırmak.
4. Formaldehit içeren bir halka standında bir rezervuar iğnenin diş ucunu. Şekil 3 Bkz.
5. 25 cm MM'nin seviyesinden formaldehit üst yüzeyini ayarlamase. Şekil 3 Bkz. Sonraki bir vana sonuna dışarı akışkan çalıştırarak tespit tüp hava olduğundan emin olun. Rezervuar tüp trakea kanül diş ucunu. Formaldehit ile akciğerlerini şişirmek için musluğunu açın. En az 20 dakika boyunca basınç altında akciğerlere bırakın.
6. Formaldehit ile akciğerlerini şişirmek için musluğunu açın. En az 20 dakika boyunca basınç altında akciğerlere bırakın.
7. Sonra, saplama iğnenin ucunun ötesine trakea kapalı kravat. Bu uncannulated trakea daha açığa iğne geri yavaşça çekin yardımcı olabilir. Güvenli bağlı olduğunda, stopcock çıkarın.
8. Dikkatle akciğerleri teşrih.
9. Gecede formaldehit içinde akciğerleri yerleştirin. Daha uzun zaman ince ve bazı lekeler ya da prosedürler belirli süreleri belirtebilirsiniz. Ayrıca bu gibi z-düzeltme başka bir sıvı sabitleyici, uygulaması ve daldırma için kullanılabilir.
10. Daha fazla işlenmeden önce histolojik ölçmekBir sonraki açıklandığı gibi sabit akciğer hacmi.

Sabit Akciğer Hacim 3. Ölçüm

1. . Şekil 4'te gösterildiği gibi Archimedes prensibi kullanılarak akciğer hacmini ölçmek formaldehit sabit akciğer çıkarın ve kalp ve herhangi bir diğer non-akciğer dokusu disseke.
2. Tamamen su altında akciğerleri tutmak için kullanılan bir önce inşa basit ev yapımı tel destek aygıtı kullanın.
   NOT: Bu cihaz kullanılıyor hangisi denge ile uyumlu hale gerekmektedir. Şekil 5'te gösterilen tipik bir cihaz, plastik pipet ve ince (20 G) telden yapılır. Bu sistem videoda kullanılan denge ile iyi çalışır, ancak kolayca en Laboratuvar teraziler adapte olabilir.
3. Su içinde bir yerde destekleyici kafes denge ve dara su ≈200 ml beher yerleştirin. . Şekil 6'ya bakın metal kafes çıkarın; Su yüzeyinde akciğer koyun ve su altında basınkafesi ile.
4. Denge üzerinde ağırlığını kaydedin. Bu sayı, su yerinden hacmini yansıtır ve dolayısıyla akciğer hacminin doğrudan bir ölçüsüdür. Emin akciğer veya dikiş veya kenarlarına veya beher alt değmeyecek tel kafes herhangi bir bölümünü yapmak için dikkatli olun.
5. Doğruluk için, bu ölçümü tekrarlayın. Bir doku üzerinde su akciğer ve kurutun. Yerinde tekrar kafes ile beher dara ve akciğer hacim ölçümü tekrarlayın. İki hacim ölçümleri daha sonra ortalaması alınmalıdır.
   Not: akciğerler fazla yaklaşık bir hafta için formalin içerisinde kalır, akciğerlerdeki hava sıvı içinde çözülmektedir. Bu durumda, akciğer batar, bu nedenle batık akciğer tutmak için Şekil 5'te olduğu gibi herhangi bir cihazı kullanmak için artık gerekli değildir. Bu durumda hacmi, Şekil 4 'de gösterildiği gibi tamamen daldırılmış kadar ameliyat dikiş ipliği diziden biri ile akciğer tutarak, sadece ile ölçülebilir.

Representative Results

Prosedür, tek başına herhangi genel sonuçlara yol etmez ilk protokolde tarif eder. Bu, yalnızca doğrudan nefes borusu içine maddeleri aşılamak için çok güvenilir bir araç tarif eder. 7 trypan blue Burada anlatılan yöntemle damlatıldı olan bir akciğer bir örneğini göstermektedir. Trakea veya farelere ^11,12 doğrudan verilen diğer boyalar ya da izleyiciler ile görülmüştür ne benzer boya yaygın dağıtım vardır. Biz de sırasıyla yaygın fibrozis veya amfizem, sonuçlanan akciğer, için bleomisin veya elastaz ya teslim etmek için bu yöntemi kullanmışlardır.

Ölüm sonrası akciğerlerde yapısal değişiklikler miktarının için tarif edilen prosedürler 25 cm _H2O basınçta sabit akciğer birimlerde veri sağlamak Böyle bir hacim ölçümleri toplam sayıları ¹⁰ içine hücre veya doku yoğunlukları sonraki tarafsız histolojik ölçümler dönüştürmek için gereklidir. Bu makalede, ancak deçok hassas bir akciğer hacmini elde etmek anlamına gelir scribes. Dokuz 10-12 haftalık sağlıklı Balb / c farelerde biz (± SD) bir ortalama sol akciğer hacmi toplam yaklaşık% 30 olmak üzere 0.82 ± 0.09 ml sabit akciğer hacmini ölçtük. BALB / c fareleri, pankreatik elastaz 3 U verilen deney amfizem oluşturmak için (bu yazıda anlatılan yöntem ile), akciğer sabit hacim% 30 kalan sol akciğer fraksiyonu, 1.15 ± 0.13 mi yükselmiştir.

Şekil 1: damlatma için kullanılan hafif kavisli ucu ile intravenöz kateter.

Şekil 2:. Entübasyon için fareler desteklemek için kullanılan 3-ring binder 3 fareler tutmak için kurulmuş bu bağlayıcı Eğimli.

Şekil 3:. Sıvının üst fare üzerinde 25 cm set ile halka üzerinde Formol dolu rezervuar, fare bağlı standı Bu sabitleme normalde davlumbaz yapılmalıdır.

Şekil 4:. Arşimet ilkesi dalgıç bir nesne tarafından yerinden suyun ağırlığı nesnesinin birime eşittir. Akciğer, normal olarak bir miktar hava koruduğundan, Şekil 5 deki gibi bir aygıt tamamen su akciğer tutmak için gereklidir.

Şekil 5: Laboratuvar akciğerleri tamamen sualtı tutmak için destek yaptı Cihazı.plastik pipetler ve metal telden yapılmış.

Şekil 6: beher ve akciğer hacmi ölçümü için hazır daralı dalma cihazı ile Laboratuvar terazileri.

Şekil 7: entübasyon kateteri içinden tripan mavisi verilen akciğer örneği.

Discussion

Burada anlatılan prosedürler çeşitli avantajları vardır. İlk Gerekli ekipman basit ve ucuzdur. İkincisi, entübasyon hızla birkaç hatalar yapılabilir. Üçüncüsü, sabit akciğer hacmi sabit basınçta akciğerlere düzeltmek ve daha sonra ölçebilme akciğer ¹⁰ yapıların veya hücrelerin düzgün ölçümü sağlar.

Entübasyon için bir olası olumsuz küçük cerrahidir. Bu ^2. instillation gerekiyorsa prosedürü tekrarlayın yeteneğini sınırlayabilir. Ancak, yapıştırıcı dikkatli cerrahi ve uygulama ile rutin ya da iki sonra ikinci damlatma bir hafta yapmak mümkün olmuştur. Sürekli tekrarlanan instilasyonlar gereklidir veya tekrarlanan solunum fonksiyon testleri yapılması gerektiği takdirde, başka entübasyon yaklaşımı ^13,14 daha arzu edilebilir eğer.

Instilasyonunu yaparken, söz edilmelidir birkaç pratik sorunlar vardır. Önemli t,o ağız ilk açılışında dilin hareketi ile mümkün olduğunca nazik ol. Forseps kullanılması durumunda, ip uçları bu dil yaralama kolaydır çünkü, lastik boru ile örtülmelidir, ve bu fare ölüme yol açabilir. Burada yöntem 6 haftadan daha yaşlı farelerin intübasyonu için tasarlanmış olmakla birlikte, bunlar kolaylıkla daha küçük farelere uyarlanabilir.

Bizim instilasyon prosedürü başlangıçta orofaringeal aspirasyon ¹¹ yöntemine alternatif olarak tasarlanmıştır. Bu ikinci yöntem kolayca öğrenilebilir olsa instillate bazı yutak kalır ve yutulması alır çünkü, akciğer teslim fiili hacim, belirsizliğini koruyor. Trakea ve biz burada göstermek gibi sonraki akciğer enflasyona doğrudan bir damlatma ile instillate doğrudan akciğere teslim edilir. Bu tür entübasyon can trakea ^11,12 doğrudan maddelerin teslim entübasyon kullanmak da mümkün olmasına rağmen bu fazlalaştıüst solunum yolu ya da ses telleri mage, ve genel olarak bizim prosedür izin% 100 başarı oranı sağlamak için eğitim çok daha yüksek bir seviye gerektirir.

Biz tanımlayan tespit prosedürü pek çok araştırmacı kullanmak ne benzer. Orada fiksatif için kullanılan enflasyon baskısı bazı farklılıklar genellikle, ama biz 25 cm _H 2 O aşırı enflasyon olası zarar vermeden tam olarak şişen akciğer tutan makul bir uzlaşma olduğunu hissediyorum. O 25 cm H sıvı ile şişirilmiş bir akciğer _{2 O} total akciğer kapasitesi 35 cm H _{2 O} hava enflasyon ile ne olabileceği yakın bir hacimde olmalıdır görünse Ancak, unutulmamalıdır, bu uzakta gerçeği. Aslında, sabitleme maddesi ile enflasyonu genellikle hava akciğer kapasitesi ^15,16% 70 bir hacimde sonuçlanır. Ve parafine ile sonraki işlem ile, histolojik bölümlerde inceledi etkili akciğer hacmi fonksiyonel rezidüel ca altında olasıdırkapasiteli bir (FRC). En yaygın sabitleyici formalin ya da z-fix, ancak immünolojik boyama, bir glutaraldehid karışımı genellikle gereklidir. Müfettişler lekeli gerek ne bağlı bir fiksatif seçmeniz gerekir, ancak optimum sabitleştirici daha tartışma bu yöntemler kağıt kapsamı dışındadır.

Histolojik kesitlerin uygun kantitatif analiz yapabilmek için akciğer hacmi ¹⁰ ölçümünü olması esastır. O seri bölümleri (Cavalieri yöntemi) tam diziden akciğer hacmini elde etmek mümkün olsa da, fare akciğerlerinde biz bu belgede ve video tarif ettiğim basit sabit akciğer hacmini ölçmek için genellikle basittir. Biz açıklamak prosedür yapmak için sadece birkaç saniye sürer ve rutin tüm akciğer tespitler yapılmalıdır. Böylece ölçülen hacim işlenmek ve gömme ile herhangi bir büzülme için hesap olmadığını, ancak aklınızda tutun ve bu önemli ise, Cavalieri yöntemi olmalıdırkullanılabilir. Bu sabit hacim ölçümü ile ilgili son bir not sabit akciğerlerde sol akciğerde akciğer hacminin kesir in vivo olarak ölçülmüş olan bu daha küçük olmasıdır. Genellikle 25 cm H sabit akciğerlerden yukarıdaki ölçümler sadece% 30 iken, fonksiyonel rezidüel kapasitede farelerin iki suş in vivo Akciğerlerin BT görüntüleme, toplam ¹⁷ yaklaşık% 40 olarak sol akciğer gösterdi _{2 O} . Bu kadar farklı olmalıdır neden Şu anda, biz anlamıyoruz, ama nicel histolojik analizler değişiklikleri analiz ederken akılda tutulmalıdır. Akciğer hacminin ölçüsü olan akciğer kanseri çalışmaları ile ilgili olarak uygun bir şekilde, spesifik kimyasal desnsities veya bütün tümör ya da bütün akciğerde mutlak sayıları, çeşitli hücre tiplerinin yoğunluğu verileri normalleştirmek için bir araştırmacı sağlar.

Özetle, entübasyon işlemi burada açıklamak imal etmek ucuzve kullanımı basit ve hızlı bir şekilde başarıyla nispeten daha az deneyime sahip fare ciğerlerine sıvıların aşılamak öğrenmek için en müfettişler ve laboratuar teknisyenleri etkinleştirmeniz gerekir. Buna ek olarak, akciğer histolojik analizine yönelik sabitleme işlemleri ve akciğer hacim ölçümü, akciğer hücreleri ve akciğer yapısının uygun tekrarlanabilir ve kantitatif analiz için bir araç sağlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory Balance	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter	Insylte		Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle	Various		Several other possible vendors