Udviklet 3D Silke-collagen-baserede model for polariseret nervevæv

Introduction

Centralnervesystemet (CNS) kan påvirkes af en række lidelser, der involverer vaskulære, strukturelle, funktionelle, infektiøs eller degenerativ. Det anslås 6,8 millioner mennesker dør hvert år som følge af neurologiske lidelser, der udgør en stigende samfundsøkonomisk byrde på verdensplan ^1. Det er dog kun få af de lidelser har tilgængelige behandlinger. Der er derfor et kritisk behov for innovative terapeutiske strategier for patienter, der lider af neurologiske lidelser. Desværre er der mange CNS-målrettede lægemidler mislykkes i kliniske forsøg, delvis på grund af udnyttelsen af ​​utilstrækkelige prækliniske forskning modeller, som ikke tillader vurdering af akutte og kroniske virkninger med fysiologisk relevante funktionelle udlæsninger.

Trods betydelige forskningsindsats i løbet af de seneste årtier, er der et stort beløb ukendt om strukturen og funktionen af ​​CNS. For at få mere viden, dyremodeller ofte osed til at modellere patologiske tilstande, såsom traumatisk hjerneskade (TBI) eller demens, især i prækliniske studier. Adskiller sig imidlertid væsentligt fra dyr mennesker både anatomi CNS, samt i funktion, genekspression og metabolisme ^2-4. På den anden side, 2D in vitro kulturer er den fælles metode til at undersøge cellebiologi og anvendes rutinemæssigt til lægemiddelforskning. Men 2D cellekulturer mangler kompleksitet og fysiologiske relevans i forhold til menneskelige hjerne ^5-7. Mens der er ingen erstatning for de lave omkostninger og enkelhed i cellekultur studier 2D eller kompleksitet, som dyremodeller, kunne 3D tissue engineering generere forbedrede forskning modeller til at lukke hullet, der eksisterer mellem 2D in vitro og in vivo tilgange. 3D tissue engineering giver mere fysiologisk relevante forsøgsbetingelser opnået af 3D celle-celle interaktioner og ekstracellulære signaler fra de biomateriale stilladser. DespITE den betydelige beviser bag værdien af 3D-kulturer, der i øjeblikket kun få 3D CNS væv modeller som stamcelle-afledte organoide kulturer ^8-10, neurospheroids ¹¹ og spredte hydrogel kulturer ^12,13. Der er blevet anvendt avancerede tekniske metoder, herunder flerlags litografi ^{14 og} 3D-print ^{15 for} at studere lunge-, lever- og nyrevæv. Der er imidlertid manglen på 3D CNS modeller, der giver mulighed for opdelte neuronal vækst, såsom efterligne den korticale arkitektur og biologi. Adskilt væksten af neuritter fra neuronale cellelegemer er tidligere blevet påvist i 2D kulturer ved hjælp microfabrication ^16,17 tillader studiet af axon-tarmkanalen opsporing, calciumindstrømning, netværksarkitektur og aktiviteter. Denne idé inspireret os til at udvikle en 3D-polariseret nervevæv, hvor celle organer og axonale skrifter er placeret i forskellige rum efterligner den lagdelte arkitektur af hjernen ¹⁸

Protocol

Hjernevævet isolation protokol blev godkendt af Tufts University Institutional Animal Care og brug Udvalg og i overensstemmelse med de National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr (Institutional Animal Care og brug Udvalg B2011-45).

1. Silke Scaffold Forberedelse

1. Forbehandling af silke løsning fra Bombyx mori kokoner som beskrevet tidligere ^19,20.
   1. Skær hver puppe i 8 lige store stykker med en saks. Brug omkring 11 kokoner til 5 g af fragmenterede kokoner. (15 min)
   2. Forbered 2 liter 0,02 M Na ₂ CO _3-opløsning og bringe det til at koge under anvendelse af en varmeplade. (15 min)
   3. 5 g af fragmenterede kokoner vejes, og kog dem i Na ₂ CO ₃ opløsning i 30 minutter. Rør det kogende silke hvert par minutter med en spatel. Dette trin, også kaldet de-Gumming, renser silkefibroin fra hydrofile proteiner, sericins. (30 min)
   4. Placer den våde fibroin på en petriskål og tør fibroin ekstrakt i strømmen hætte O / N.
   5. Den næste dag vejer den tørre fibroin masse og placer fibroin i et glas bægerglas. (15 min)
   6. For at opløse fibroin i 9,3 M opløsning LiBr, beregner det nødvendige volumen (i ml) af LiBr ved at multiplicere massen af ​​tør fibroin med 4. Hæld langsomt LiBr opløsning over silkefibroinet og fordybe alle fibroin fibre ved hjælp af spatel. Bægerglasset dækkes for at forhindre fordampning og placere den ved 60 ° C i 4 timer for at tillade fibrene at opløse. (15 min)
   7. Ved hjælp af sprøjten, indsamle fibroin løsning fra bægeret, og læg det ind i MWCO 3.500 dialyse kassetter. Udfør dialyse mod destilleret vand i 48 timer. Skift vandet hver par timer.
   8. Ved hjælp af sprøjten, indsamle fibroin løsning frakassetterne i 50 ml koniske rør og centrifugeres to gange ved 9.000 rpm (12.700 x g ~) ved 4 ° C i 20 minutter. Hæld supernatanten til et frisk rør efter hvert centrifugeringstrin og kassér pellet. (40 min)
   9. Måle koncentrationen af ​​fibroin ved at estimere tørvægt. Hæld 1 ml silke opløsning i en vejer båd. Tør prøven i ovnen ved 60 ° C i 2 timer. Tør silkefibroinet vejes, og beregne koncentrationen af ​​silkefibroinet opløsning ved at multiplicere den opnåede vægt med 100. Den forventede koncentration af silke løsning er 6-9% (vægt / volumen).
   10. Juster silke fusions 6% (vægt / volumen) ved at fortynde det i destilleret vand.
       Stoppunkt: Den flydende silkefibroin kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned i en lukket beholder.
2. Udarbejdelse af porøse stilladser fra silke løsning.
   1. Si granulære NaCl at adskille granulatet størrelse 500-600 um, som vil blive anvendt i senere trin. Kassér granulatets størrelse under 500 um og 600 um over. (15 min)
   2. Hæld 30 ml 6% silke opløsning i polytetrafluorethylen (PTFE) formen (figur 1). Scatter forsigtigt 60 g sigtet NaCI over silke. Tryk på beholderen for at opnå et ensartet lag af salt. Inkuber 48 timer ved stuetemperatur for at polymerisere silke.
   3. Anbring formen PTFE stilladset-holdige i ovnen ved 60 ° C i 1 time for at færdiggøre polymerisation og fordampe den resterende væske.
   4. Placer indholdet af skimmel PTFE i et bægerglas indeholdende 2 l destilleret vand i 48 timer for at sive ud saltet. Skift vandet 2-3 gange om dagen. Fjern svamp stilladser fra formene når saltet er fuldstændigt udvaskes Standsningssted:. Svampene kan opbevares nedsænket i vand ved 4 ° C i en lukket beholder for at forhindre stilladser af dehydrering.
   5. Når du er klar, skåret ud af stilladser med 5 mm i diameter biopsi punch. Forskårne scaffolds at nå ca. 2 mm i højden. PuNCH ​​ud midten af stilladset med 2 mm diameter biopsitang (figur 2A). (1 time)
   6. Autoklaver stilladserne nedsænket i vand for at sterilisere dem (våd cyklus, 121 ° C, 20 min) Standsningssted:. Svampene kan opbevares nedsænket i vand ved 4 ° C i en lukket beholder for at forhindre stilladser af dehydrering.
   7. Før den planlagte cellepodning, fordybe stilladser i sterilt 0,1 mg / ml poly-D-lysin (PDL) opløsning. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
   8. Vask scaffolds 3x med phosphatbufret saltvand (PBS) for at fjerne ikke-bundet PDL. (30 min)

2. Isolering af rotte corticalneuroner

1. Dissekere cortex fra fosterdag 18 (E18) Sprague-Dawley-rotter som tidligere beskrevet af Pacifici og Peruzzi ^{27 efter} godkendt dyreprotokollen opnås. (2 timer)
2. Inkuber 10 cortex i 5 ml 0,25% trypsin med 0,3% DNase I (fra bovin pancreas) i 20 minutter ved 37 ° C.
3. Inaktivere trypsin ved tilsætning lige så stort volumen 1 mg / ml sojabønne protein.
4. Udriv cortex under anvendelse af 10 ml Pasteur pipette ved pipettering op og ned 20 gange, indtil en enkelt cellesuspension genereres. Være blid og undgå luftboble formation. (10 min)
5. Centrifuger cellesuspensionen ved 127 xg i 5 minutter.
6. Resuspender cellepelleten i 10 ml dyrkningsmedium (Neurobasal medium, 1x B27 supplement, 1x Glutamax, 1% penicillin / streptomycin). Tæl cellerne. Koncentrationen af forventede celle er omkring 2x10 ⁷ / ml. (20 min)

3. Konstruer Samling og Kultur

1. Stillads podning med celler.
   1. Flyt sterile stilladser og alle de nødvendige redskaber i en cellekultur hætte. Ved hjælp af en steril pincet placere stilladser i en 96-brønds celledyrkningsplade fordeling én stillads per brønd. (10 min)
   2. Fordybe stilladser i cellekulturmedium at ækvilibrere dem forud for celle frøING. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C. (10 min)
   3. Aspirer overskud af mediet fra skeletterne.
   4. Påfør 100 pi cellesuspension / stillads. (10 min)
   5. Inkuber cellerne ved 37 ° CO / N for at tillade cellebinding til stilladset.
   6. Den følgende morgen aspirere de ikke-bundne celler og anvende 200 ul / brønd af frisk dyrkningsmedium. (10 min)
2. Scaffold indlejring med collagenmatrix. (2 timer)
   1. Placer 10x PBS, vand, 1 N NaOH og rotte hale I collagen på is. Forbered en arbejdsgruppe løsning af kollagen som pr fabrikantens anvisninger. Opretholde på is, indtil de celle-podet konstruktioner er klar (op til 1 time).
   2. Fjern celle-seedede silke-konstruktioner fra inkubatoren og opsug overskud af mediet.
   3. Ved hjælp af en steril pincet overføre stilladser til de tomme brønde på brøndplade og fordybe hvert stillads i 100 pi 3 mg / ml collagen-opløsning. Placer vævskulturplade tilbagei inkubatoren i 30 minutter for at tillade polymerisering af collagen.
   4. Påfør 100 pi foropvarmet celledyrkningsmedium / brønd. Kultur konstruktionerne i en uge ændre mediet hver dag ved kun at erstatte halvdelen af ​​volumenet af mediet.

4. mikroskopianalyse

1. Levende / dead farvning (1 time)
   1. Forbered stamopløsning af propidiumiodid (PI) 1 mg / ml (1,5 mM) i destilleret vand.
   2. Forbered stamopløsning af fluoresceindiacetat (FDA) 2 mg / ml i acetone.
   3. Forbered arbejdet opløsning indeholdende 10 uM PI og 0,15 uM FDA fortyndet i PBS. Pre-varme opløsningen til 37 ° C i et vandbad.
   4. Vask cellerne med forvarmet PBS for at fjerne de serumesteraser. Aspirere PBS.
   5. Anvend det foropvarmede brugsopløsning på cellerne i 2 minutter og vask det med PBS.
   6. Brug epifluorescensmikroskop til billedet cellerne (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). Pletten forbliver stabil over 40 min. Langvarig farvning kan resultere i uspecifik farvning som følge af PI-optagelse af cellerne og co-lokalisering af PI / FDA i celler.
2. Immunfarvning
   1. Ved det ønskede tidspunkt for kultur fikseres cellerne med 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter ved stuetemperatur. På grund af giftigheden af ​​PFA dampe fastsættelse trin skal udføres i stinkskab.
   2. Vask stilladser med 3x PBS Standsningssted:. PFA-faste konstruktioner kan opbevares i PBS ved 4 ° C i flere dage før man går videre med yderligere skridt.
   3. Inkubér stilladser i 0,2% Triton, 0,25% bovint serumalbumin (BSA) i PBS indeholdende primære antistof O / N ved 4 ° C.
   4. Den følgende dag skille farveopløsningen og vask stilladser 3 x 30 min med PBS for at fjerne det ubundne primære antistof.
   5. Inkuber prøverne med sekundært antistof fortyndet i 0,2% Triton, 0,25% BSA i PBS i 2timer ved stuetemperatur.
   6. Fjern farveopløsningen og vask stilladser 3 x 30 min med PBS for at fjerne det ubundne sekundært antistof.
   7. Billede stilladserne ved hjælp af en konfokal mikroskop med 20X målsætning ved at tage 100 um z-sektioner af prøven med 1 um trin. At visualisere de tynde neuritter billedets opløsning bør være på minimum 1.024 x 1.024 pixel.
3. RNA, DNA og protein isolering
   Bemærk: RNA, DNA og protein isolering udføres ved anvendelse af et kommercielt AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit ifølge producentens instruktioner.
   1. Ved hjælp af en steril pincet overføre stilladser ud af dyrkningsplade til et 2 ml sterilt rør. Placer en stillads per rør.
   2. Tilsæt 200 pi RLT buffer til hvert rør.
   3. Forstyrre konstruktionen ved at fragmentere det med sterile microscissors.
   4. At homogenisere forstyrret væv, overføre indholdet af røret til spin-søjle. Spin i 2 min ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge.Lysatet homogeniseres, idet den passerer gennem spinkolonne.
   5. Saml gennemstrømningen og bruge det samme at isolere RNA, DNA og protein ved at følge fabrikantens protokol.
   6. Kvantificere udbyttet af nukleinsyrerne enhver anden kompatibel metode (f.eks NanoDrop).
   7. Kvantificere proteinudbyttet hjælp BCA Protein Assay ifølge producentens instruktioner. Måle resultatet af assayet under anvendelse mikropladelæser ved en bølgelængde 562 nm.
      Bemærk: Det forventede udbytte af nukleinsyrer og protein pr konstruktion i forhold til celledensiteten er vist i figur 4.

Representative Results

Solid silke svampe forskåret til doughnutform repræsenterer en unik og enkel ide at opnå en rumopdelt arkitektur ligner nervevæv (figur 2A). Den meget porøse struktur af stilladset med porestørrelse på ca. 500 um resulterer i usædvanligt højt overfladeareal muliggør podning og vækst af høj celledensitet inden for et lille volumen (2x10 ⁷ / ml) (figur 2B). Derudover høje porøsitet stilladset muliggør ubegrænset diffusion af næringsstoffer og affald resulterer i overlegen levedygtighed tætte cellekulturer over længere tidsrammer. Efter podning neuronerne hurtigt og ensartet vedhæfte til overfladen af ​​stilladset porer.

Efter cellebinding er færdig og cellerne ækvilibreres på silke substrat, svampen stillads fyldt med bløde collagenmatrix med henblik på at give et 3D-miljø for axonal netværksdannelse (figur 3 (figur 3B). I modsætning hertil kollagengelen giver en meshwork der understøtter omfattende axonal udvækst i 3D, mens neuronale cellelegemer forbliver fastgjort til silke scaffold (figur 3C). Dette mønster vækst fører til opdeling af celle organer og rene axonale netværk (figur 3D), som ligner den grå og hvide substans i cortex i hjernen.

Bortset fra mikroskopi, kan konstruktionerne evalueres med en række andre metoder ^18, afhængigt af spørgsmålet bag forsøget. For eksempel kan isolering af DNA, RNA og protein fra konstruktionerne let udføres under anvendelse af kommercielle kits (figur 4). Udbyttet af nukleinsyrer og proteiner peR konstrukt afhænger af antallet af celler oprindeligt podet på silke stilladser. Jo flere celler podet jo højere udbytte af DNA, RNA og protein.

Figur 1. PTFE støbeform anvendt til silke svamp stillads forberedelse Dimensionerne:.. 10 cm i diameter, 2 cm højde Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. 3D hjerne-lignende væv model. (A) porøs silke svamp stillads. (B) Levende / døde farvning af neuroner på dag 1 efter såning på silke stillads før kollagen indlejring (grøn-levende celler, røde døde celler). Paneler på højre side viser magnification af areal fanget i røde rammer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Neuronal opdelte udvækst i 3D hjerne-lignende væv model (A) Scaffold rum:. Rød-celle krop rum, Blue-axonal rum. (B) Neuronal vækstmønster på dag 1 efter såning før kollagen indlejring. (C). Neuronal udvækst på dag 7 efter podning i cellen kroppen rum. (D) Neuronal udvækst på dag 7 efter podning i axonal rum. Grøn -. ΒIIITubulin Klik her for at se en større version af dennefigur.

Figur 4. Forventede udbytte af (A) RNA og DNA og (B) protein pr konstruktionen i forhold til mængden af celler podet pr stilladset (± SD, n = 5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346