Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel

Introduction

Het centrale zenuwstelsel (CNS) kan worden beïnvloed door een verscheidenheid van aandoeningen waarbij vasculaire, structurele, functionele, infectieuze of degeneratieve. Naar schatting 6,8 miljoen mensen per jaar sterven als gevolg van neurologische aandoeningen, die een groeiende sociaal-economische last vertegenwoordigt wereldwijd ^1. Slechts enkele van de aandoeningen beschikbare behandelingen. Daarom is er dringend behoefte aan innovatieve therapeutische strategieën voor patiënten met neurologische aandoeningen. Helaas zijn veel CNS-gerichte therapieën falen tijdens klinische studies, voor een deel te wijten aan het gebruik van onvoldoende pre-klinisch onderzoek modellen, die niet de beoordeling van acute en chronische effecten met fysiologisch relevante functionele uitlezing toestaan.

Ondanks aanzienlijke onderzoeksinspanningen van de afgelopen decennia, is er een enorme hoeveelheid onbekend over de structuur en functie van het centrale zenuwstelsel. Om meer kennis op te doen, diermodellen vaak onsed model pathologische toestanden, zoals traumatisch hersenletsel (TBI) of dementie, vooral in preklinische studies. Echter, dieren aanzienlijk verschillen van mensen zowel anatomie van CNS, evenals in functie genexpressie en metabolisme ^2-4. Anderzijds, 2D in vitro kweken zijn de gebruikte methode om celbiologie onderzoeken en worden routinematig gebruikt voor drug discovery. Echter, 2D celkweken niet de complexiteit en fysiologische relevantie ten opzichte van menselijke hersenen ^5-7. Hoewel er geen vervanging voor de lage kosten en eenvoud van 2D celkweek onderzoeken of de complexiteit door diermodellen kunnen 3D weefselengineering verbeterde onderzoeksmodellen genereren om het vacuüm tussen de 2D in vitro en in vivo technieken te sluiten. 3D tissue engineering biedt meer fysiologisch relevante bereikt door 3D cel-cel interacties en extracellulaire signalen die de Biomaterialen experimentele omstandigheden. Despite de significant bewijs achter de waarde van 3D-culturen, zijn er momenteel slechts een paar 3D-CNS weefsel modellen zoals stamcellen afgeleide organoïde culturen ^8-10, neurospheroids ^{11 en} verspreid hydrogel culturen ^12,13. Geavanceerde technische methoden waaronder meerlagige lithografie ¹⁴ en 3D printing ¹⁵ zijn gebruikt voor het bestuderen long-, lever- en nierweefsel. Er is echter weinig CNS 3D-modellen die het mogelijk maken gecompartimenteerde neuronale groei, zoals het nabootsen van de corticale architectuur en biologie. Gescheiden groei van neurieten van neuronale cellichamen is eerder in 2D culturen aangetoond met behulp van microfabricage ^16,17 waardoor de studie van de axon darmkanaal tracing, calciuminflux, netwerkarchitectuur en activiteiten. Dit idee inspireerde ons om een 3D-gepolariseerde zenuwweefsel, waar cellichamen en axonale stukken bevinden zich in verschillende compartimenten nabootsen van de gelaagde architectuur van de hersenen ¹⁸ ontwikkelen

Protocol

Het hersenweefsel isolatie protocol werd goedgekeurd door de Tufts University Institutional Animal Care en gebruik Comite en voldoet aan de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren (Institutional Animal Care en gebruik Comite B2011-45).

1. Silk Steiger Voorbereiding

1. Voorbereiding van zijde oplossing van Bombyx mori cocons zoals eerder beschreven ^19,20.
   1. Snijd elke cocon in 8 gelijke stukken met een schaar. Gebruik ongeveer 11 cocons voor 5 g van gefragmenteerde cocons. (15 min)
   2. Bereid 2 L van 0,02 M Na ₂ CO ₃ oplossing en breng het aan de kook met een hete plaat. (15 min)
   3. Weeg 5 g versnipperde cocons en kook ze in Na ₂ CO ₃ oplossing voor 30 min. Roer het kokende zijde om de paar minuten met een spatel. Deze stap, ook wel van ontgommen, zuivert zijde fibroin van hydrofiele eiwitten, sericins. (30 min)
   4. Plaats de natte fibroin op een petrischaal en droog de fibroin extract in de stroomkap O / N.
   5. De volgende dag de wegen droog fibroin massa en plaats de fibroin in een glazen beker. (15 min)
   6. Om de fibroin in 9,3 M oplossing LiBr Bereken het vereiste volume (in ml) LiBr ontbinden de massa droge fibroïne vermenigvuldigen met 4. Giet langzaam LiBr oplossing via zijdefibroïne en dompel alle fibroïnevezels behulp spatel. Bedek het bekerglas om verdamping te voorkomen en plaats deze bij 60 ° C gedurende 4 uur om de vezels te lossen. (15 min)
   7. Met behulp van de spuit, het verzamelen van de fibroïne oplossing uit de beker en plaats hem in de MWCO 3500 dialyse cassettes. Presteren dialyse tegen gedestilleerd water gedurende 48 uur. Ververs het water om de paar uur.
   8. Met behulp van de spuit, het verzamelen van de fibroin oplossing vande cassettes in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 9000 rpm twee keer (~ 12.700 xg) bij 4 ° C gedurende 20 min. Giet de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis na elke centrifugeren stap en de pellet gooi. (40 min)
   9. Meet de concentratie van de fibroïne door schatting van het drooggewicht. Giet 1 ml van zijde oplossing in een weeg boot. Droog het monster in de oven bij 60 ° C gedurende 2 uur. Weeg de droge zijdefibroïne en bereken de concentratie van zijdefibroïne oplossing door vermenigvuldiging verkregen gewicht van 100. De verwachte concentratie van zijde oplossing is 6-9% (w / v).
   10. Pas de zijde concentratie 6% (w / v) door verdunning in gedestilleerd water.
       Stopplaats: De vloeibare zijdefibroïne kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand in een gesloten container.
2. Bereiding van poreuze draagstructuren van zijde oplossing.
   1. Zeef de korrels NaCl scheiden de granules grootte 500-600 pm, die zal worden gebruikt in latere stappen. Gooi de korrels grootte beneden 500 pm en boven 600 urn. (15 min)
   2. Giet 30 ml 6% zijde oplossing in het polytetrafluoretheen (PTFE) mal (Figuur 1). Verstrooien voorzichtig 60 g gezeefde NaCl over de zijde. Tik de houder een uniforme laag zout te verkrijgen. Incubeer 48 uur bij kamertemperatuur aan de zijde polymeriseren.
   3. Plaats de scaffold PTFE schimmel in de oven bij 60 ° C gedurende 1 uur om de polymerisatie te voltooien en damp resterende vloeistof.
   4. Plaats de inhoud van de PTFE matrijs in een bekerglas met 2 liter gedestilleerd water gedurende 48 uur om uit te logen het zout. Veranderen 2-3 keer per dag het water. Verwijder de spons scaffolds uit de vorm wanneer het zout volledig uitgeloogd stoppunt. De sponsen kan worden opgeslagen ondergedompeld in water bij 4 ° C in een gesloten houder te voorkomen dat de steigers tegen uitdroging.
   5. Als u klaar bent, knip de steigers met 5 mm diameter biopsie punch. Voorgesneden de steigers tot ongeveer 2 mm in hoogte te bereiken. PuNCH ​​het midden van de steiger met 2 mm punch biopsie (figuur 2A). (1 hr)
   6. Autoclaaf de steigers ondergedompeld in water om ze te steriliseren (nat cyclus, 121 ° C, 20 min) stoppunt. De sponsen kan worden opgeslagen ondergedompeld in water bij 4 ° C in een gesloten houder te voorkomen dat de steigers tegen uitdroging.
   7. Voor de geplande cel enten dompel de steigers in steriele 0,1 mg / ml poly-D-lysine (PDL) oplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   8. Was de steigers 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om niet gebonden PDL verwijderen. (30 min)

2. Isolatie van Rat corticale neuronen

1. Ontleden cortex uit embryonale dag 18 (E18) Sprague-Dawley ratten zoals eerder beschreven door Pacifici en Peruzzi ²⁷ na goedgekeurde protocol dier wordt verkregen. (2 uur)
2. Incubeer 10 cortex in 5 ml 0,25% trypsine met 0,3% DNase I (van bovine pancreas) gedurende 20 min bij 37 ° C.
3. Inactivatie van het trypsine door toevoeging gelijk volume van 1 mg / ml soja-eiwit.
4. Vermaal de cortex met 10 ml pasteurpipet op en neer te pipetteren 20 totdat een enkele celsuspensie gegenereerd. Wees voorzichtig en vermijd luchtbel vorming. (10 min)
5. Centrifugeer de celsuspensie bij 127 xg gedurende 5 min.
6. Resuspendeer de cel pellet in 10 ml kweekmedium (Neurobasal medium, 1x B27 supplement, 1x Glutamax, 1% penicilline / streptomycine). Tel de cellen. De verwachte concentratiecel ongeveer 2x10 ⁷ / ml. (20 min)

3. Construct Vergadering en Cultuur

1. Scaffold enten met cellen.
   1. Verplaats de steriele steigers en alle benodigde gebruiksvoorwerpen in een celkweek kap. Met behulp van een steriel pincet plaats de steigers in een 96-well celkweek plaat toekenning van een steiger per putje. (10 min)
   2. Dompel de steigers in celcultuur medium in evenwicht hen voorafgaand aan het zaad celing. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. (10 min)
   3. Zuig het overtollige van het medium uit de steigers.
   4. Breng 100 pi celsuspensie / scaffold. (10 min)
   5. Incubeer de cellen bij 37 ° CO / N om celhechting aan de steiger.
   6. De volgende morgen zuigen de niet gehechte cellen en toepassen 200 pl / putje vers kweekmedium. (10 min)
2. Steiger inbedding met collageen matrix. (2 uur)
   1. Plaats 10x PBS, water, 1 N NaOH en rat staart I collageen op ijs. Bereid een werkoplossing van collageen volgens de instructies van de fabrikant. Onderhouden op ijs totdat de cel gezaaid constructies zijn klaar (maximaal 1 uur).
   2. Verwijder de cel geplaatste zijde constructies uit de incubator en zuig het overtollige medium.
   3. Steriele tang overdracht van de steigers aan de lege putjes van de putjesplaat en dompel elke steiger in 100 gl 3 mg / ml collageenoplossing. Plaats de weefselkweek plaat terugin de incubator gedurende 30 minuten om polymerisatie van collageen toestaan.
   4. Breng 100 ul voorverwarmde celcultuur medium / putje. Cultuur constructen één week waarbij het medium elke dag vervangen slechts de helft van het volume van het medium.

4. Microscopie Analyse

1. Levend / dood kleuring (1 uur)
   1. Bereid voorraadoplossing van propidiumjodide (PI) 1 mg / ml (1,5 mM) in gedestilleerd water.
   2. Bereid voorraadoplossing van fluoresceïne diacetaat (FDA) 2 mg / ml in aceton.
   3. Bereid werkende oplossing bevattende 10 uM en 0,15 uM PI FDA verdund in PBS. Vooraf verwarmen van de oplossing tot 37 ° C in een waterbad.
   4. Was de cellen met voorverwarmd PBS het serum esterases verwijderen. Zuig het PBS.
   5. Breng de voorverwarmde werkoplossing aan de cellen gedurende 2 minuten en wassen met PBS.
   6. Gebruik epifluorescerende microscoop het imago van de cellen (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). De vlek blijft stabiel op 40 min. Langdurige kleuring kan leiden tot niet- specifieke kleuring gevolg van PI opname door de cellen en co-localisatie van PI / FDA in cellen.
2. Immunokleuring
   1. Op het gewenste tijdstip van cultuur vast de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Vanwege de toxiciteit van de PFA dampen vaststelling stap moet in de zuurkast worden uitgevoerd.
   2. Was steigers met 3x PBS stoppunt. De PFA gefixeerd constructen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C gedurende enkele dagen alvorens verdere stappen.
   3. Incubeer de steigers in 0,2% Triton, 0,25% runderserumalbumine (BSA) in PBS met primair antilichaam O / N bij 4 ° C.
   4. De volgende dag kleuroplossing weggooien en was de steigers 3 x 30 min met PBS om het niet-gebonden primair antilichaam te verwijderen.
   5. Incubeer de monsters met secundair antilichaam verdund in 0,2% Triton, 0,25% BSA in PBS gedurende 2uur bij KT.
   6. Verwijder de kleuroplossing en was de steigers 3 x 30 min met PBS om het niet-gebonden secundair antilichaam te verwijderen.
   7. Afbeelding de steigers behulp van een confocale microscoop met 20x objectief neem 100 urn z-gedeelten van het monster met 1 urn stap. De dunne neurites de beeldresolutie moet van minimaal 1024 x 1024 pixels te visualiseren.
3. RNA, DNA en eiwit isolatie
   Opmerking: RNA, DNA en eiwit isolatie wordt uitgevoerd met een commerciële AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Met behulp van een steriel pincet overdracht van de steigers van de cultuur plaat naar een 2 ml steriele buis. Plaats een steiger per buis.
   2. Voeg 200 ul RLT-buffer aan elke buis.
   3. Verstoren het construct door fragmenteren met steriele microscissors.
   4. Om de verstoorde weefsel te homogeniseren, de overdracht van de inhoud van de buis naar de spin kolom. Spin gedurende 2 minuten op volle snelheid in een microcentrifuge.Het lysaat wordt gehomogeniseerd als het door de spin kolom passeert.
   5. Verzamel de stroom door en gebruik het onmiddellijk te isoleren RNA, DNA en eiwitten volgens de fabrikant protocol.
   6. Kwantificeren van de opbrengst van de nucleïnezuren andere compatibele methode (bijv NanoDrop).
   7. Kwantificeren eiwitrendement via BCA Protein Assay volgens de instructies van de fabrikant. Meet het resultaat van analyse met gebruik microplaatlezer bij golflengte 562 nm.
      Opmerking: De verwachte opbrengst van nucleïnezuren en eiwitten per construct ten opzichte van de celdichtheid wordt getoond in figuur 4.

Representative Results

Solide zijde sponzen voorgesneden naar de donut vorm vormen een uniek en simpel idee om een verzuilde architectuur lijkt op zenuwweefsel (Figuur 2A) te bereiken. De sterk poreuze structuur van het skelet met poriegrootte van ongeveer 500 urn resultaten in uitzonderlijk hoog specifiek oppervlak zodat het zaaien en groei van hoge celdichtheid in een klein volume (2x10 ⁷ / ml) (Figuur 2B). Daarnaast is de hoge porositeit van de steiger maakt onbeperkte diffusie van voedingsstoffen en afvalstoffen resulteert in een superieure levensvatbaarheid van dichte celculturen gedurende langere tijdframes. Bij het zaaien de neuronen snel en uniform hechten aan het oppervlak van het schavot poriën.

Na celhechting voltooid en cellen in evenwicht gebracht op de zijde substraat, wordt de spons schavot gevuld met zachte collageen matrix teneinde een 3D-omgeving voor axonale netwerkformatie (figuur 3 (figuur 3B). In tegenstelling, de collageengel verschaft een maaswerk die uitgebreide axonale uitgroei in 3D ondersteunt, terwijl neuronale cellichamen blijven zitten aan de zijde scaffold (figuur 3C). Groeipatroon leidt tot compartimentering van cellichamen en pure axonale netwerken (figuur 3D), waarbij de grijze en witte stof van de cortex in de hersenen lijkt.

Naast microscopie, kunnen de constructen worden geëvalueerd met een verscheidenheid aan andere methoden ^18, afhankelijk van de vraag achter het experiment. Zo kan de isolatie van DNA, RNA en eiwit van de constructen gemakkelijk worden uitgevoerd met gebruikmaking van commerciële kits (figuur 4). De opbrengst van nucleïnezuren en eiwitten per construct afhankelijk van het aantal cellen eerst gezaaid op de zijde steigers. Hoe meer cellen uitgezet hoe hoger het rendement van DNA, RNA en eiwitten.

Figuur 1. PTFE mal gebruikt voor zijde spons schavot voorbereiding De afmetingen:.. Diameter van 10 cm, 2 cm hoogte Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. 3D brain-achtig weefsel model. (A) poreuze zijde spons schavot. (B) live / dood kleuring van neuronen op dag 1 na het zaaien op zijde schavot voor collageen inbedden (groene-levende cellen, rode-dode cellen). Panelen aan de rechterkant tonen de magnification van het gebied dat wordt vastgelegd in het rood frames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Neuronale gecompartimenteerd uitgroei in de 3D ​​hersenen-achtig weefsel model (A) Steiger compartimenten:. Rood-cel lichaam compartiment, Blue-axonale compartiment. (B) Neuronale groeipatroon op dag 1 na het zaaien voordat collageen inbedding. (C). Neuronale uitgroei op dag 7 na het zaaien in de cel lichaam compartiment. (D) neuronale uitgroei op dag 7 na het zaaien in het axonale compartiment. Groen -. ΒIIITubulin Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.

Figuur 4. Verwachte opbrengst van (A) RNA en DNA, en (B) eiwit per construct in verhouding tot de hoeveelheid cellen uitgezet per steiger (± SD, n = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346