Introduction
Le système nerveux central (SNC) peut être affectée par une variété de troubles impliquant vasculaire, structurelle et fonctionnelle, infectieux ou dégénératif. On estime que 6,8 millions de personnes meurent chaque année des suites de troubles neurologiques, qui représente un fardeau socio-économique mondiale croissante 1. Cependant, seulement quelques-uns des troubles ont traitements disponibles. Par conséquent, il existe un besoin critique de stratégies thérapeutiques innovantes pour les patients souffrant de troubles neurologiques. Malheureusement, de nombreuses thérapies ciblées SNC-échouent au cours des essais cliniques, en partie due à l'utilisation de modèles de recherche pré-clinique inadéquate, qui ne permettent pas une évaluation des impacts aigus et chroniques avec affichage fonctionnels physiologiquement pertinents.
En dépit des efforts de recherche importants au cours des dernières décennies, il ya une grande quantité inconnue sur la structure et la fonction du système nerveux central. Afin d'acquérir plus de connaissances, modèles animaux sont souvent de noused pour modéliser les états pathologiques, comme une lésion cérébrale traumatique (TBI) ou de démence, en particulier dans les études pré-cliniques. Toutefois, les animaux diffèrent de manière significative à la fois chez l'homme dans l'anatomie du système nerveux central, ainsi que de la fonction, et l'expression des gènes du métabolisme de 2-4. D'autre part, 2D cultures in vitro sont la méthode commune pour étudier la biologie cellulaire et sont couramment utilisés pour la découverte de médicaments. Cependant, des cultures de cellules 2D manquent de la complexité et de la pertinence physiologique par rapport au cerveau humain 7.5. Bien qu'il n'y ait pas de substitut pour le faible coût et la simplicité du 2D études de culture cellulaire ou de la complexité fournies par les modèles animaux, l'ingénierie tissulaire 3D pourrait générer des modèles de recherche améliorées pour combler l'écart qui existe entre la 2D in vitro et dans des approches in vivo. Ingénierie tissulaire 3D fournit des conditions expérimentales plus physiologiquement pertinents obtenus par les interactions entre les cellules et les signaux extracellulaires 3D fournis par les échafaudages de biomatériaux. Despite la preuve significative derrière la valeur des cultures 3D, il n'y a actuellement que quelques modèles de tissus 3D SNC tels que souches dérivées de cellules cultures organoïdes 8-10, neurospheroids 11 et dispersés cultures d'hydrogel 12,13. Y compris les méthodes techniques avancées multicouche 14 lithographie, impression en 3D et 15 ont été utilisées pour l'étude du poumon, du foie, du rein et le tissu. Cependant, il existe des modèles 3D absence du SNC qui permettent la croissance neuronale compartimenté, comme imitant l'architecture corticale et de la biologie. Séparé croissance des neurites à partir de corps cellulaires neuronaux a déjà été démontré dans les cultures 2D en utilisant microfabrication 16,17 permettant l'étude de traçage axone des voies, l'afflux de calcium, l'architecture du réseau et des activités. Cette idée nous a inspiré pour développer un tissu neural polarisée 3D où les corps cellulaires et les voies axonales sont situés dans des compartiments différents imitant l'architecture en couches du cerveau 18
Protocol
Le protocole d'isolement de tissu cérébral a été approuvé par le Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnelle de l'Université Tufts et est conforme avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institutional Animal Care et l'utilisation Comité B2011-45).
1. Préparation de la soie Échafaudages
- Préparation de la solution de soie de Bombyx mori cocons comme décrit précédemment 19,20.
- Couper chaque cocon en 8 morceaux égaux aide de ciseaux. Utilisez environ 11 cocons pour 5 g de cocons fragmentés. (15 min)
- Préparer 2 L de 0,02 M Na 2 CO 3 et porter à ébullition en utilisant une plaque chauffante. (15 min)
- Peser 5 g de cocons fragmentées et les faire bouillir dans Na 2 CO 3 pendant 30 min. Incorporer la soie bouillante toutes les deux minutes avec une spatule. Cette étape, également appelé de-gommage, purifie fibroïne de soie de protéines hydrophiles, sericins. (30 min)
- Placez la fibroïne humide sur une boîte de Pétri et sécher l'extrait de fibroïne dans la hotte à flux O / N.
- Le lendemain peser la masse de fibroïne sec et placer la fibroïne dans un récipient en verre. (15 min)
- Pour dissoudre la fibroïne de 9,3 M de solution de LiBr, calculer le volume nécessaire (en ml) de LiBr en multipliant la masse de fibroïne sec par 4. Verser lentement solution LiBr sur la fibroïne de soie et plongez toutes les fibres de fibroïne aide d'une spatule. Couvrir le bécher pour éviter l'évaporation et le placer à 60 ° C pendant 4 heures pour permettre aux fibres de se dissoudre. (15 min)
- Utilisation de la seringue, de recueillir la solution de fibroïne du bécher et le charger dans les MWCO 3.500 cassettes de dialyse. Effectuer une dialyse contre de l'eau distillée pendant 48 heures. Changez l'eau toutes les deux heures.
- Utilisation de la seringue, de recueillir la solution de fibroïne deles cassettes dans 50 ml tubes coniques et centrifuger à 9000 rpm deux fois (~ 12 700 x g) à 4 ° C pendant 20 min. Verser le surnageant dans un nouveau tube après chaque étape de centrifugation et jeter le culot. (40 min)
- Mesurer la concentration de la fibroïne en estimant le poids sec. Verser 1 ml de solution de soie dans une barque peser. Sécher l'échantillon à l'étuve à 60 ° C pendant 2 heures. Peser la fibroïne de soie sèche et calculer la concentration de la solution de fibroïne de soie en multipliant le poids obtenu par 100. La concentration de la solution attendue de soie est 6-9% (p / v).
- Ajuster la concentration de soie à 6% (p / v) en le diluant dans l'eau distillée.
Point d'arrêt: La fibroïne de soie liquide peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à un mois dans un récipient fermé.
- Préparation des supports poreux de solution de soie.
- Tamiser les granulés de NaCl pour séparer les granules calibrés de 500 à 600 um, qui sera utilisé dans les étapes ultérieures. Jeter le granulés taille inférieure à 500 um et 600 um ci-dessus. (15 min)
- Verser 30 ml de solution de soie de 6% dans le moule de polytétrafluoroéthylène (PTFE) (Figure 1). Disperser doucement 60 g de NaCl tamisé sur la soie. Appuyez sur le récipient pour obtenir une couche uniforme de sel. Incuber 48 h à température ambiante pour polymériser la soie.
- Placez le moule contenant PTFE d'échafaudage dans le four à 60 ° C pendant 1 heure pour finaliser la polymérisation et évaporer tout liquide restant.
- Placer le contenu du moule en PTFE dans un bêcher contenant 2 litres d'eau distillée pendant 48 heures à lessiver le sel. Changez l'eau 2-3 fois par jour. Retirez les échafaudages d'éponges des moules lorsque le sel est complètement lessivé point d'arrêt:. Les éponges peuvent être stockés immergé dans l'eau à 4 ° C dans un récipient fermé pour éviter les échafaudages de la déshydratation.
- Lorsque vous êtes prêt, découpez les échafaudages avec 5 mm de diamètre biopsie punch. Pré-couper les échafaudages pour atteindre environ 2 mm de hauteur. PuNCH le centre de l'échafaud avec le poinçon 2 mm de diamètre de biopsie (figure 2A). (1 h)
- Autoclaver les échafaudages immergés dans l'eau pour les stériliser (le cycle humide, 121 ° C, 20 min) Point d'arrêt:. Les éponges peuvent être stockés immergé dans l'eau à 4 ° C dans un récipient fermé pour éviter les échafaudages de la déshydratation.
- Avant l'ensemencement des cellules prévu, plonger dans les échafaudages / ml de poly-D-lysine (PDL) de solution stérile de 0,1 mg. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
- Laver les échafaudages 3x avec du tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer PDL non-lié. (30 min)
2. Isolement du Rat neurones corticaux
- On dissèque le cortex de rats de 18 jours embryonnaires (E18) Sprague-Dawley, comme décrit précédemment par Peruzzi Pacifici et 27 après protocole approuvé animal est obtenue. (2 h)
- Incuber 10 cortex dans 5 ml de trypsine à 0,25% à 0,3% de DNase I (provenant de pancréas de bovin) pendant 20 min à 37 ° C.
- Inactiver la trypsine en ajoutant un volume égal de 1 mg / ml de protéine de soja.
- Triturer les cortex à l'aide de 10 ml de pipette Pasteur par aspiration et refoulement 20 fois jusqu'à une suspension cellulaire unique est généré. Soyez doux et éviter la formation de bulles d'air. (10 min)
- Centrifuger la suspension de cellules à 127 xg pendant 5 min.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de culture (milieu Neurobasal, 1x supplément B27, 1x Glutamax, 1% de pénicilline / streptomycine). Compter les cellules. La concentration cellulaire est d'environ 2x10 prévu 7 / ml. (20 min)
3. Construire Assemblée et de la culture
- Échafaudage ensemencement avec des cellules.
- Déplacer les échafaudages stériles et les ustensiles nécessaires tous à l'intérieur d'une hotte de culture cellulaire. Aide de pinces stériles placent les échafaudages dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits attribution d'un échafaudage par puits. (10 min)
- Plonger les échafaudages dans un milieu de culture cellulaire pour équilibrer les graines avant de la celluleing. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. (10 min)
- Aspirer l'excédent du milieu des échafaudages.
- Appliquer 100 pi de suspension de cellules / échafaudage. (10 min)
- Incuber les cellules à 37 ° CO / N pour permettre la fixation des cellules à l'échafaud.
- Le lendemain matin, aspirer les cellules non-inscrits et applique 200 pl / puits de milieu de culture frais. (10 min)
- Échafaudage intégration avec matrice de collagène. (2 h)
- Placez 10x PBS, de l'eau, 1 N NaOH et queue de rat de collagène sur la glace. Préparer une solution de travail de collagène selon les instructions du fabricant. Maintenir sur la glace jusqu'à les constructions ensemencées cellules sont prêts (jusqu'à 1 heure).
- Retirer les constructions de soie cellulaires graines de l'incubateur et aspirer l'excès de milieu.
- Aide de pinces stériles transférer les échafaudages dans les puits vides sur la plaque de puits et immergent chaque échafaudage dans 100 pi de 3 mg / ml solution de collagène. Placer la plaque de culture de tissus de retourdans l'incubateur pendant 30 min pour permettre la polymérisation du collagène.
- Appliquer 100 ul de milieu préchauffé de culture de cellules / puits. Culture constructions depuis une semaine changeant le milieu tous les jours en remplaçant seulement la moitié du volume du milieu.
4. Microscopie Analyse
- Direct coloration / morts (1 h)
- Préparer une solution stock d'iodure de propidium (PI) 1 mg / ml (1,5 mm) dans de l'eau distillée.
- Préparer une solution stock de diacétate de fluorescéine (FDA) 2 mg / ml dans de l'acétone.
- Préparer la solution de travail contenant 10 uM PI et 0,15 uM FDA dilué dans du PBS. Préchauffer la solution à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Laver les cellules avec préchauffé PBS pour éliminer les estérases sériques. Aspirer le PBS.
- Appliquer la solution de travail pré-chauffé sur les cellules pendant 2 min et le laver avec du PBS.
- Utilisez microscope à épifluorescence à l'image les cellules (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). La tache reste stable plus de 40 min. Coloration prolongée peut provoquer une coloration non spécifique résultant de PI absorption par les cellules et co-localisation de PI / FDA dans les cellules.
- Immunocoloration
- Au point de temps désiré de la culture fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 30 min à température ambiante. En raison de la toxicité de la PFA vapeurs d'l'étape de fixation doit être réalisée dans la hotte d'aspiration chimique.
- Laver échafaudages avec 3x PBS point d'arrêt:. Les constructions PFA-fixes peuvent être stockés dans PBS à 4 ° C pendant plusieurs jours avant de procéder à de nouvelles mesures.
- Incuber les échafaudages dans 0,2% de Triton, 0,25% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS contenant l'anticorps primaire O / N à 4 ° C.
- Le lendemain, jeter la solution de coloration et laver les échafaudages 3 x 30 min avec du PBS pour éliminer l'anticorps primaire non lié.
- Incuber les échantillons avec l'anticorps secondaire dilué dans 0,2% de Triton, 0,25% de BSA dans du PBS pendant 2heure à température ambiante.
- Retirer la solution de coloration et laver les échafaudages 3 x 30 min avec du PBS pour éliminer l'anticorps secondaire non lié.
- Image les échafaudages en utilisant un microscope confocal à l'objectif 20X en prenant 100 um z-sections de l'échantillon avec 1 um étape. Pour visualiser les neurites minces la résolution de l'image doit être d'un minimum de 1024 x 1024 pixels.
- ARN, l'ADN et l'isolement de la protéine
Remarque: l'ARN, l'ADN et l'isolement de la protéine est effectuée en utilisant un kit commercial Mini AllPrep ADN / ARN / protéine selon les instructions du fabricant.- Utilisation des pinces stériles transférer les échafaudages sur plaque de culture dans un tube stérile de 2 ml. Placez un échafaudage par tube.
- Ajouter 200 ul de tampon RLT à chaque tube.
- Perturber la construction en fragmentant avec microciseaux stériles.
- Pour homogénéiser le tissu perturbé, transférer le contenu du tube à la colonne de centrifugation. Spin pendant 2 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse.Le lysat est homogénéisé lors de son passage à travers la colonne de centrifugation.
- Recueillir l'écoulement à travers et l'utiliser immédiatement pour isoler l'ARN, ADN et de protéines en suivant le protocole du fabricant.
- Quantifier le rendement en acides nucléiques de toute autre méthode compatible (par exemple, NanoDrop).
- Quantifier le rendement en protéines en utilisant BCA Protein Assay selon les instructions du fabricant. Mesurer les résultats de test utilisant un lecteur de microplaques à longueur d'onde 562 nm.
Remarque: Le rendement attendu d'acides nucléiques et des protéines par construction par rapport à la densité de cellules est représenté sur la Figure 4.
Representative Results
Solide éponges de soie prédécoupé à la forme de beigne représentent une idée unique et simple à réaliser une architecture compartimentée ressemblant le tissu nerveux (figure 2A). La structure très poreuse de l'échafaudage avec la taille de pores d'environ 500 um résultats dans la zone de surface exceptionnellement élevé permettant l'ensemencement et de croissance de forte densité de cellules dans un petit volume (7 2x10 / ml) (figure 2B). En outre, la grande porosité de l'échafaudage permet la diffusion sans restriction de nutriments et de déchets résultant de la viabilité supérieure de cultures cellulaires denses plus de prolongement des délais. Après ensemencement des neurones fixer rapidement et uniformément à la surface des pores de l'échafaudage.
Après la fixation des cellules est terminée et les cellules sont équilibrées sur le substrat de soie, l'échafaudage de mousse est rempli avec la matrice de collagène souple afin de fournir un environnement 3D pour la formation du réseau axonale (Figure 3 (figure 3B). Par contre, le gel de collagène fournit un maillage large qui supporte la croissance axonale en 3D, alors que corps cellulaires neuronaux restent attachés au squelette de soie (figure 3C). Ce modèle de croissance conduit à cloisonnement des corps cellulaires et les réseaux axonales purs (Figure 3D), qui ressemble à la matière grise et blanche du cortex dans le cerveau.
En dehors de microscopie, les constructions peuvent être évalués avec une variété d'autres procédés de 18, en fonction de la question derrière l'expérience. Par exemple, l'isolement de l'ADN, de l'ARN et de protéines à partir des constructions peut être facilement réalisée en utilisant des kits commerciaux (Figure 4). Le rendement en acides nucléiques et de protéines per construction dépend du nombre de cellules initialement ensemencées sur l'échafaudage de soie. Les cellules ensemencées plus plus le rendement de l'ADN, de l'ARN et des protéines.
Figure 1. PTFE moule utilisé pour la préparation éponge de soie d'échafaudage Les dimensions:.. 10 cm de diamètre, 2 cm de hauteur S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. 3D modèle de tissu du cerveau comme. (A) poreux éponge de soie échafaud. (B) en direct coloration / morts de neurones à jour 1 sur l'ensemencement sur échafaudage de soie avant de l'intégrer collagène (cellules vertes-live, les cellules rouges morts). Panneaux sur le côté droit montrent la MAgnification de zone capturée dans des cadres rouges. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. neuronale de l'excroissance cloisonnée dans le modèle de tissu cérébral comme 3D (A) compartiments d'échafaudage:. Rouge-cellule compartiment du corps, compartiment Blue-axonale. (B) de modèle de croissance neuronale au jour 1 après l'ensemencement avant collagène encastrement. (C). Excroissance neuronale au jour 7 après l'ensemencement dans le compartiment de corps cellulaire. (D) de l'excroissance neuronale au jour 7 après l'ensemencement dans le compartiment axonal. Vert -. ΒIIITubulin S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.
Figure 4. Rendement prévu de (A) ARN et l'ADN, et (B) protéines par construction par rapport à la quantité de cellules ensemencées par échafaudage (± SD, n = 5). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Disclosures
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223530 | |
| LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | |
| MWCO 3500 dialysis cassettes | Thermo Fisher | 66110 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | ||
| Sieve | Fisher Scientific | No. 270, No. 35, No. 30 | |
| PTFE mold | made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Biopsy Punch 5 mm | World Precision Instrument | 501909 | |
| Biopsy Punch 2 mm | World Precision Instrument | 501908 | |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | final concentration 10 μg/ml, dissolved in water |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1283-500ML | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| DNase | Roche | 10104159001 | final concentration 0.3% |
| Soybean protein | Sigma-Aldrich | T6522-100MG | final concentration 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | warm up to 37 °C before use |
| B27 supplement 50x | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Penicilin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Collagen I, rat tail, 100 mg | Corning | 354236 | final concentration 3 mg/ml |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | corrosive |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170-10MG | toxic |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378-5G | |
| Olympus MVX10 | Olympus | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | toxic, final concentration 4% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | |
| anti-βIIITubulin antibody | Sigma-Aldrich | T2200 | rabbit 1:500 |
| anti-rabbit Alexa-546 | Molecular Probes | A11010 | goat 1:250 |
| goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-5ML | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica | objective 20X | |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | |
| AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit | Qiagen | 80004 | |
| Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Plate reader Spectramax M2 | Molecular Devices | absorbance 562 nm | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | TedPella | 1346 |
References
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