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Bioengineering

편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

Published: October 23, 2015 doi: 10.3791/52970
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

Introduction

중추 신경계 (CNS)의 구조적 기능적, 감염성 또는 퇴행성 혈관을 포함하는 다양한 질환에 의해 영향을받을 수있다. 추정 6백80만명 1은 전 세계적으로 성장하고 사회 경제적 부담을 나타내는 신경 질환의 결과로 매년 죽는다. 그러나, 장애의 몇 가지 가능한 치료를해야합니다. 따라서, 신경계 질환을 앓고있는 환자를위한 치료 전략의 혁신적인 중요한 필요성이있다. 불행히도, 많은 CNS 타겟 치료제 인해 생리 학적으로 관련 기능 판독과 급성 및 만성 영향 평가를 허용하지 않는 부적절한 전임상 연구 모델의 활용에 부분적으로 임상 시험 중에 실패합니다.

지난 수십 년간 상당한 연구 노력에도 불구하고, CNS의 구조와 기능에 대해 알 수없는 방대한있다. 더 많은 지식을 습득하기 위하여, 동물 모델은 종종 우리 아르ED 특히 전임상 연구에서, 이러한 외상성 뇌 손상 (TBI), 또는 치매 병리 상태를 모델링한다. 그러나 동물은 인간에서 모두 중추 신경계의 해부학에서뿐만 아니라, 기능, 유전자 발현 및 대사 2-4에 유의 한 차이. 한편, 2D 체외 배양 세포 생물학을 연구하는 일반적인 방법이고 정기적 약물 발견에 사용된다. 그러나, 2 차원 세포 배양은 복잡하고 인간의 두뇌 5-7에 비해 생체 적합성이 부족하다. 저가 및 단순성 2D 세포 배양 연구 또는 동물 모델에 의해 제공되는 복잡성을 대신 없지만, 3 차원의 조직 공학은 시험 관내 및 생체 내 접근법에서 2D 사이에 존재하는 간극을 폐쇄 개선 연구 모델을 생성 할 수있다. 3 차원의 조직 공학은 3D 세포 - 세포 상호 작용에 의해 제공되는 지지체 생체 외 단서에 의해 달성 이상의 생리 학적으로 관련 실험 조건을 제공한다. Desp3D 배양 값 뒤에 상당한 증거 ITE, 거기 이러한 줄기 세포 유래 organoid 배양 8-10 같은 몇 3D CNS 조직 모델 11 neurospheroids는 현재 및 하이드로 겔 배양 12,13 분산. 다층 리소그래피 (14), 및 3D 인쇄 (15) 등의 고급 기술 방법은 폐, 간 및 신장 조직을 연구에 이용되어왔다. 그러나, 대뇌 피질의 구조 생물학을 흉내 낸으로 구획 된 신경 세포의 성장을 허용 3D CNS 모델의 부족이있다. 신경 세포 기관에서 신경 돌기의 분리 된 성장은 이전 축삭 기관의 추적, 칼슘 유입, 네트워크 아키텍처 및 활동의 연구를 허용 미세 (16, 17)를 사용하여 2D 문화에서 증명되었다. 이 아이디어는 세포체와 축삭 책자는 뇌 (18)의 계층 구조를 흉내 낸 다른 구획에있는 3D 편광 신경 조직을 개발하기 위해 우리에게 영감을

Protocol

뇌 조직 분리 프로토콜은 터프 츠 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인과 관리 및 사용 실험 동물의 (기관 동물 관리 및 사용위원회 B2011-45)에 대한 건강 가이드의 국립 연구소에 부합했다.

1. 실크 비계 준비

  1. 누에 나방의 고치에서 실크 용액의 조제는 이전에 19, 20 설명한대로.
    1. 가위를 사용하여 8 개의 동일한 조각으로 각각의 누에 고치를 잘라. 조각난 고치 5 g을 약 11 고치를 사용합니다. (15 분)
    2. 0.02 M 나 2 CO 3 용액 2 L를 준비하고 핫 플레이트를 사용하여 끓여야 가져. (15 분)
    3. 조각난 고치의 5g의 무게를 30 분 동안 나 2 CO 3 용액을 끓인다. 주걱으로 끓는 실크에게 분에 한 번씩 저어. 또한 디 씹고라는이 단계는 친수성 ​​단백질 sericins에서 실크 피브로인 정화. (30 분)
    4. 페트리 접시에 젖은 피브로인을 놓고 흐름 후드 O / N에서 피브로인 추출물을 건조.
    5. 다음 날은 건조 피브로인 질량의 무게와 유리 비커에 피브로인을 배치합니다. (15 분)
    6. (4)에 의해 건조 피브로인의 질량을 곱하여의 LiBr 9.3 M의 LiBr 용액 (ML)에 필요한 양을 계산에 피브로인을 용해하기 위해 천천히 실크 피브로인 위에의 LiBr 용액을 붓고 주걱을 사용하여 모든 피브로인 섬유 젖어. 증발을 방지하고, 섬유를 용해 할 수 있도록 4 시간 동안 60 ° C에서 배치하는 비이커 커버. (15 분)
    7. 주사기를 사용하여, 비커로부터 피브로인 용액을 수집하고 3500 MWCO 투석 카세트에 적재. 48 시간 동안 증류수에 대해 투석을 수행합니다. 물을 시간의 각 한 쌍을 변경합니다.
    8. 주사기를 사용하여, 발 피브로인 수용액을 수집20 분 동안 4 ℃에서 9,000 RPM (~ 12,700 XG)에서 두 번 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 카세트. 각각의 원심 분리 단계 이후에 새로운 튜브에 뜨는을 붓고 펠렛을 폐기합니다. (40 분)
    9. 건조 중량을 추정하여 피브로인의 농도를 측정한다. 무게 배에 실크 용액 1 ㎖를 붓고. 2 시간 동안 60 ℃의 오븐에서 샘플을 건조. 건조 실크 피브로인을 달아 실크 (100)에 의해 용액의 농도를 예상 얻어진 가중치를 곱하여 실크 피브로인 수용액의 농도를 계산하는 단계 6-9%이다 (W / V).
    10. 증류수에 희석하여 (V / W)은 6 %로 실크 농도를 조정한다.
      정류소 : 액체 실크 피브로인은 밀폐 용기에서 한 달 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  2. 실크 솔루션에서 다공성 지지체의 제조.
    1. 과립은 이후 단계에서 사용될 500-600 μm의, 크기가 별도의 NaCl을 과립 체. 과립 폐기S는 500 μm의 아래에 600 μm의 위의 크기. (15 분)
    2. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 금형 (도 1)로 6 % 실크 용액 30 ㎖를 붓는다. 부드럽게 실크 통해 체질의 NaCl 60g을 산란. 소금의 균일 한 층을 얻기 위해 용기를 누릅니다. 실크 중합 실온에서 48 시간을 품어.
    3. 중합을 완료하고 남은 액체를 증발시켜 60 ℃에서 1 시간 동안 오븐에서 골격 함유 PTFE 금형을 배치.
    4. 염을 걸러 48 시간 동안 증류수 2 L를 넣은 비커에 PTFE 몰드의 콘텐츠를 배치했다. 물을 하루에 2 ~ 3 시간을 변경합니다. . 염이 완전히 정지 시점 침출시 몰드로부터 스폰지 지지체를 제거 스폰지가 탈수 비계 않도록 밀폐 용기 내에서 39 ° C의 물에 침지하여 저장 될 수있다.
    5. 준비가되면, 5mm 직경 생검 펀치와 비계를 잘라. 높이 약 2mm 도달하는 발판을 중고 컷. 푸2mm 직경 생검 펀치 (그림 2A)와 발판의 중심을 NCH. (1 시간)
    6. . 정지 점 (습식주기 121 ° C, 20 분)들을 살균 물에 침지하여 지지체를 압력솥 ​​: 스폰지가 탈수 비계 않도록 밀폐 용기 내에서 39 ° C의 물에 침지하여 저장 될 수있다.
    7. 계획된 세포 파종하기 전에, 멸균 0.1 ㎎ / ㎖ 폴리 -D- 라이신 (PDL) 솔루션의 발판을 담그지. 37 ℃에서 1 시간 동안 품어.
    8. 비계가 결합되지 않은 PDL을 제거하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 배 씻으십시오. (30 분)

쥐 두피 뉴런 2. 분리

  1. 승인 동물 프로토콜을 수득 한 후 이전과 Pacifici Peruzzi (27)에 의해 기술 된 바와 같이 태아 일부터 18 (E18) 흰쥐 피질을 해부. (2 시간)
  2. (3)에서 20 분 동안 (소 췌장)에서 0.3 %의 DNase I 0.25 % 트립신 5 ml의 10 피질을 부화7 ° C.
  3. 1 ㎎ / ㎖ 대두 단백질의 동일한 양을 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다.
  4. 단일 세포 현탁액이 생성 될 때까지 최대 10 ㎖ 피펫 팅 파스퇴르 피펫을 사용하여 피질 아래로 20 번 씹다. 부드러운하고 기포 형성을 피할 것. (10 분)
  5. 5 분 동안 127 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
  6. 다시 일시 배지 10ml에 세포 펠렛을 (로 Neurobasal 배지, 1X B27 보충제, 1X 루타, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 세포를 계산합니다. 예상 세포 농도는 약 2 × 7 / ㎖이다. (20 분)

3. 조립 및 문화를 구축

  1. 세포와 비계 파종.
    1. 세포 배양 후드 내부 살균 비계와 필요한 모든기구를 이동합니다. 사용 멸균 집게는 96 웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 골격은 하나의 골격을 할당하는 배치. (10 분)
    2. 그들 전에 종자를 셀에 평형화 세포 배양 배지에 담가 비계ING. 37 ℃에서 1 시간 동안 품어. (10 분)
    3. 지지체로부터 매체의 과잉 대기음.
    4. 세포 현탁액 / 비계의 100 μl를 적용합니다. (10 분)
    5. 지지체에 세포 부착을 허용하도록 37 ° CO / N에서 세포를 품어.
    6. 다음 아침에 비 부착 세포를 대기음 200 μL / 웰의 신선한 배양액을 적용합니다. (10 분)
  2. 콜라겐 매트릭스에 포함 비계. (2 시간)
    1. 나는 얼음에 콜라겐 10 배 PBS, 물, 1 N NaOH를 쥐 꼬리를 놓습니다. 제조업체의 지침에 따라 콜라겐의 작업 솔루션을 준비합니다. 셀 시드 구조 (1 시간까지) 준비가 될 때까지 얼음에 유지한다.
    2. 인큐베이터에서 셀 시드 실크 구조를 제거하고 매체의 초과를 대기음.
    3. 사용 멸균 집게는 잘 판에 빈 우물에 비계를 전송하고 3 ㎎ / ㎖ 콜라겐 용액 100 ㎕를 각 발판을 담그지. 다시 조직 배양 플레이트를 배치인큐베이터에서 30 분 콜라겐의 중합을 허용하는.
    4. 웰 / 예열 세포 배양 배지 100 μl를 적용한다. 일주일 배양 배지의 절반 체적을 대체하여 매일 배지를 변경하기위한 구조.

4. 현미경 분석

  1. 라이브 / 죽은 염색 (1 시간)
    1. 요오드화 프로피 듐 (PI) 증류수에 1 ㎎ / ㎖ (1.5 밀리미터)의 주식 솔루션을 준비합니다.
    2. 아세톤 플루 오레 디 아세테이트 (FDA) 2 ㎎ / ㎖의 주식 솔루션을 준비합니다.
    3. PBS에 희석하여 10 μm의 파이 0.15 μm의 FDA를 포함하는 작업 솔루션을 준비합니다. 수욕 중에서 37 ℃까지 용액을 미리 가온.
    4. 혈청 에스 테라 제를 제거하기 위해 미리 예열 PBS로 세포를 씻으십시오. PBS를 대기음.
    5. 2 분 동안 세포에 미리 예열 작업 솔루션을 적용하고 PBS로 씻어.
    6. FDA 전 λ = 490 N; 이미지에 epifluorescent 현미경을 사용하여 세포 (PI의 전 λ = 490 nm의은, EM λ는 570 nm의 =m은, EM λ)는 514 nm의 =. 얼룩은 40 분에 걸쳐 안정적으로 유지. 장시간 염색 PI의 세포에 의한 흡수와 세포에서 PI / FDA의 공동 지방화에 따른 불특정 오염의 원인이 될 수 있습니다.
  2. 면역 염색
    1. 배양 중 원하는 시점에서 RT에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)으로 세포를 고정한다. 인해 PFA의 독성에 고정하는 단계는 화학 퓸 후드에서 수행되어야 발연.
    2. . 배 PBS 중지 포인트 발판을 씻으 : PFA 고정 구조는 추가 단계를 진행하기 전에 며칠 동안 4 ° C에서 PBS에 저장 될 수있다.
    3. 4 ℃에서 일차 항체 O / N을 함유하는 PBS에서 0.2 % 트리톤, 0.25 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 골격을 부화.
    4. 다음 날은 염색 액을 버리고 언 바운드 차 항체를 제거하는 PBS로 골격을 3 × 30 분을 씻는다.
    5. 2 PBS에 트리톤 0.2 %에 희석 차 항체, 0.25 % BSA로 샘플을 품어실온에서 시간.
    6. 염색 액을 제거하고 언 바운드 차 항체를 제거하는 PBS로 골격을 3 × 30 분을 씻는다.
    7. 이미지 1 μm의 단계로 샘플의 100 μm의 Z-부분을 고려하여 20 배 목표와 공 초점 현미경을 사용하여 비계. 이미지 해상도가 최소 1,024 X 1,024 픽셀이어야 얇은 신경 돌기를 시각화합니다.
  3. RNA, DNA와 단백질 분리
    주 : RNA, DNA 및 단백질 분리는 제조자의 지시에 따라 상용 AllPrep DNA / RNA / 단백질 미니 키트를 사용하여 수행된다.
    1. 사용 멸균 집게는 2 ml의 멸균 튜브에 문화 판에서 발판을 전송합니다. 튜브 당 하나의 발판을 놓습니다.
    2. 각각의 튜브에 RLT 버퍼의 200 μl를 추가합니다.
    3. 멸균 microscissors로 세분화하여 구조를 방해.
    4. 분열 조직을 균일화하려면, 스핀 컬럼 튜브의 콘텐츠를 전송. 마이크로 원심에서 최고 속도로 2 분 동안 스핀.이 스핀 컬럼을 통과 할 해물 균질화된다.
    5. 을 통해 흐름을 수집하고 RNA, 제조 업체 프로토콜 다음 DNA와 단백질을 분리하는 즉시 사용할 수 있습니다.
    6. 핵산의 수율 호환되는 다른 방법 (예를 들면, NanoDrop)을 정량화.
    7. 제조업체의 지시에 따라 BCA 단백질 분석을 이용하여 단백질을 정량 수율. 파장 562 nm에서 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 분석의 결과를 측정한다.
      주 : 핵산 및 세포 밀도와 관련 구조체 당 단백질의 예상 수율은도 4에 도시된다.

Representative Results

도넛 모양 솔리드 실크 스폰지 미리 절단은 신경 조직 (그림 2A)를 닮은 구획 구조를 달성하기 위해 독특하고 간단한 아이디어를 나타냅니다. 작은 부피 내에 시드 및 높은 세포 밀도의 증가를 허용하는 매우 높은 표면적이 약 500 μm의 결과 공경 지지체의 다공성 구조 (2 × 7 / ㎖) (도 2B). 또한, 발판의 높은 다공성 연장 시간 프레임을 통해 고밀도 세포 배양의 뛰어난 생존 능력의 결과로 영양분과 폐기물의 무제한 확산 수 있습니다. 신경 세포를 파종시 신속하고 균일하게 발판 기공의 표면에 부착합니다.

세포 부착이 완료되고 세포 실크 기판 상에 평형화 된 후, 스폰지 지지체가 축삭 네트워크 형성 (도 3 차원 환경을 제공하기 위해 부드러운 콜라겐 매트릭스로 채워진다 (도 3b)와 혼합 발견 네트워크 결과 기공의 표면에 확장을 성장 콜라겐 매트릭스의 부재 축삭과 세포체의 구획화는 불가능하다. 반면에, 콜라겐 젤은 신경 세포 기관이 실크 발판 (그림 3C)에 부착 된 상태로 유지하면서, 3D 광범위한 축삭 가지를 지원하는 메쉬 작업을 제공합니다. 이러한 성장 패턴은 세포 기관과 순수 축삭 네트워크 뇌의 피질의 회색과 흰색 물질과 유사합니다 (그림 3D)의 구획화에 연결됩니다.

그렇다 현미경에서, 구조물은 실험 뒤에 질문에 따라, 다른 방법 (18)의 다양한 평가 될 수있다. 예를 들어, 구조물에서 DNA, RNA 및 단백질의 분리가 용이하게 상업적 키트를 (도 4)을 사용하여 수행 할 수있다. 핵산 및 단백질 PE의 수율R 구조체는 초기에 실크 비계에 시드 셀의 개수에 의존한다. 이상의 셀 시드 DNA, RNA 및 단백질의 높은 수율.

그림 1
실크 스폰지 지지체의 제조에 사용 그림 1. PTFE 금형 크기 :.. 10cm 직경 2cm 높이 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 3D 뇌와 같은 조직 모델입니다. (A) 다공성 실크 스폰지 발판. 전에 콜라겐 (녹색 살아있는 세포, 붉은 죽은 세포)를 포함 실크 인공 지지체에 파종에 따라 1 일에서 신경 세포의 (B) 라이브 / 죽은 얼룩. 오른쪽 패널은 엄마를 표시빨간색 프레임에서 캡처 영역의 gnification. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 신경 세포의 3 차원 뇌와 같은 조직 모델에서 구획 가지 (A) 비계 구획 :. 레드 셀 바디 컴, 블루 축삭 함. (B) 콜라겐 삽입 전에 파종에 따라 1 일에서 신경 세포의 성장 패턴. (C). 세포체 구획 씨딩 7 일에 신경 생장. (D) 축삭 구획에 파종시 7 일에 신경 가지. 녹색 -. βIIITubulin 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.

그림 4
(A) RNA와 DNA, 그리고 발판 당 시드 세포의 양에 관련 구조 당 (B) 단백질의 그림 4. 예상 수율 (± 표준 편차, N = 5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223530
LiBr Sigma-Aldrich 213225
MWCO 3500 dialysis cassettes  Thermo Fisher 66110
Heating plate Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge 5804 R Eppendorf
Sieve Fisher Scientific No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl Sigma-Aldrich 71382
Biopsy Punch 5 mm World Precision Instrument 501909
Biopsy Punch 2 mm World Precision Instrument 501908
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5MG final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS Sigma-Aldrich D1283-500ML
Trypsin Sigma-Aldrich T4049-500ML
DNase Roche 10104159001 final concentration 0.3%
Soybean protein Sigma-Aldrich T6522-100MG final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x Gibco 17504-044
Glutamax Gibco 35050-061
Penicilin Streptomycin Corning 30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 final concentration 3 mg/ml
NaOH Sigma-Aldrich S2770 corrosive
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170-10MG toxic
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378-5G
Olympus MVX10 Olympus
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody  Sigma-Aldrich T2200 rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546 Molecular Probes A11010 goat 1:250
goat serum Sigma-Aldrich G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope Leica objective 20X
QIAshredder Qiagen 79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit Qiagen 80004
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023 
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific
BCA protein assay Thermo Scientific 23225
Plate reader Spectramax M2 Molecular Devices absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type TedPella 1346

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References

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편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델
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Chwalek, K., Sood, D., Cantley, W.… More

Chwalek, K., Sood, D., Cantley, W. L., White, J. D., Tang-Schomer, M., Kaplan, D. L. Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue. J. Vis. Exp. (104), e52970, doi:10.3791/52970 (2015).

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