Engineered 3D Silk-kollagenbaserad modell av polariserat Neural Tissue

Introduction

Det centrala nervsystemet (CNS) kan påverkas av en mängd olika sjukdomar som involverar kärl, strukturella, funktionella, infektiös eller degenerativa. Uppskattningsvis 6,8 miljoner människor dör varje år till följd av neurologiska störningar, vilket innebär en växande socioekonomisk börda världen ^1. Men bara ett fåtal av de sjukdomar har tillgängliga behandlingar. Därför finns det ett kritiskt behov av innovativa behandlingsstrategier för patienter som lider av neurologiska störningar. Tyvärr har många CNS-riktade läkemedel misslyckas under kliniska prövningar, bland annat på grund av att användningen av otillräckliga prekliniska forskningsmodeller, som inte tillåter bedömning av akuta och kroniska effekter med fysiologiskt relevanta funktionella avläsning.

Trots betydande forskningsinsatser under de senaste decennierna, finns det en stor mängd okända om struktur och funktion CNS. För att få mer kunskap, djurmodeller är ofta ossed att modellera patologiska tillstånd, såsom traumatisk hjärnskada (TBI) eller demens, särskilt i pre-kliniska studier. Emellertid djur skiljer sig signifikant från människor både i anatomi CNS, såväl som i funktion, genuttryck och metabolism ^2-4. Å andra sidan, 2D in vitro kulturer är den vanligaste metoden för att undersöka cellbiologi och används rutinmässigt för läkemedelsupptäckt. Emellertid 2D cellkulturer saknar komplexiteten och fysiologiska relevansen jämfört med human hjärna ^5-7. Även om det finns inget substitut för den låga kostnaden och enkelheten i 2D cellodlingsstudier eller komplexiteten från djurmodeller, kan 3D-tissue engineering generera förbättrade forskningsmodeller för att överbrygga klyftan som finns mellan 2D in vitro och in vivo metoder. 3D vävnadsteknik ger mer fysiologiskt relevanta försöksbetingelser uppnås genom 3D cell-cell-interaktioner och extracellulära signaler som tillhandahålls av biomaterialet byggnadsställningar. Despite den betydande bevis bakom värdet av 3D-kulturer, det finns för närvarande endast ett fåtal 3D CNS vävnadsmodeller såsom stamcellshärledda organoid kulturer ^8-10, neurospheroids ¹¹ och spridda hydrogel kulturer ^12,13. Avancerade tekniska metoder inklusive flerskikts litografi ^14, och 3D-utskrift ¹⁵ har använts för att studera lunga, lever och njurvävnad. Emellertid det är brist på 3D CNS modeller som tillåter compartmentalized neuronal tillväxt, t.ex. härma den kortikala arkitektur och biologi. Separerad tillväxt av neuriter från neuronala cellkroppar har tidigare visats i 2D kulturer genom att använda mikro ^16,17 möjliggör studier av Axon kanalen spårning, kalciuminflöde, nätverksarkitektur och aktiviteter. Denna idé inspirerade oss att utveckla en 3D-polariserad nervvävnad där cellkroppar och axonal skrifter finns i olika fack som härmar den skiktade arkitekturen i hjärnan ¹⁸

Protocol

Hjärnvävnaden isolering protokoll godkändes av Tufts University Institutional Animal Care och användning kommittén och överensstämmer med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur (Institutional Animal Care och användning kommittén B2011-45).

1. Siden scaffold Framställning

1. Beredning av siden lösning från silkesfjäril kokonger som beskrivits tidigare ^19,20.
   1. Skär varje kokong i 8 lika stora bitar med hjälp av en sax. Använd ca 11 kokonger för 5 g av fragmenterade kokonger. (15 min)
   2. Förbered 2 liter 0,02 M Na ₂ CO ₃ lösning och föra den till koka med hjälp av en värmeplatta. (15 min)
   3. Väg 5 gram av fragmente kokonger och koka dem i Na ₂ CO _3-lösning under 30 minuter. Rör kokande silke varje par minuter med en spatel. Detta steg, även kallad degummering, renar siden fibroin från hydrofila proteiner, sericins. (30 min)
   4. Placera den våta fibroin på en petriskål och torka fibroin extraktet i flöde huva O / N.
   5. Nästa dag väger torr fibroin massan och placera fibroin i en glasbägare. (15 min)
   6. För att lösa fibroin i 9,3 M LiBr lösning, beräkna önskad volym (i ml) av LiBr genom att multiplicera massan av torr fibroin med 4. Häll långsamt LiBr lösning över siden fibroin och fördjupa alla fibroin fibrer med hjälp av spatel. Täck bägaren för att förhindra avdunstning och placera den vid 60 ° C under 4 timmar för att tillåta att fibrerna för att lösa upp. (15 min)
   7. Med hjälp av sprutan, samla fibroin lösningen från bägaren och ladda den i MWCO 3500 dialyskassetter. Utför dialys mot destillerat vatten under 48 timmar. Byt vatten varje par timmar.
   8. Med hjälp av sprutan, samla fibroin lösningen frånkassetterna i 50 ml koniska rör och centrifugera två gånger vid 9000 rpm (~ 12.700 xg) vid 4 ° C under 20 min. Häll supernatanten i ett nytt rör efter varje centrifugeringssteg och kasta pelleten. (40 min)
   9. Mäta koncentrationen av fibroin genom att uppskatta den torra vikten. Häll 1 ml av silke lösningen i en väga båt. Torka provet i en ugn vid 60 ° C under 2 h. Väg den torra silke fibroin och beräkna koncentrationen av silke fibroin lösning genom att multiplicera den erhållna vikten med 100. Den förväntade koncentrationen av silke lösning är 6-9% (vikt / volym).
   10. Justera silke koncentrationen till 6% (vikt / volym) genom att späda den i destillerat vatten.
       Stoppunkt: Vätske siden fibroin kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad i en sluten behållare.
2. Framställning av porösa ställningar från silke lösning.
   1. Sikta den granulära NaCl för att separera granulerna dimensionerade 500-600 | im, som kommer att användas i senare steg. Kassera granulenar dimensionerad under 500 ^ m och över 600 | im. (15 min)
   2. Häll 30 ml av 6% siden lösningen i polytetrafluoreten (PTFE) form (figur 1). Sprider försiktigt 60 g siktad NaCl över silke. Knacka på behållaren för att erhålla ett likformigt skikt av salt. Inkubera 48 timmar vid rumstemperatur för att polymerisera silke.
   3. Placera ställningen innehållande PTFE-mögel i ugn vid 60 ° C under 1 h för att slutföra polymerisationen och indunsta eventuell kvarvarande vätska.
   4. Placera innehållet av PTFE-formen i en bägare innehållande 2 liter destillerat vatten under 48 timmar för att laka ut saltet. Byt vatten 2-3 gånger per dag. Avlägsna svampen ställningar från formarna när saltet helt lakas ut Stoppunkt:. Svamparna kan förvaras nedsänkt i vatten vid 4 ° C i en sluten behållare för att förhindra att stöden från uttorkning.
   5. När du är klar, klipp ut ställningar med 5 mm biopsi diameter punch. Pre-cut ställningar för att nå cirka 2 mm i höjd. PuNCH ​​ut centrum av ställningen med 2 mm biopsi diameter stans (Figur 2A). (1 timme)
   6. Autoklavera de ställningar som är nedsänkta i vatten för att sterilisera dem (våt cykel, 121 ° C, 20 min) Stoppunkt:. Svamparna kan förvaras nedsänkt i vatten vid 4 ° C i en sluten behållare för att förhindra att stöden från uttorkning.
   7. Före den planerade cellsådd, sänk ned ställningar i steril 0,1 mg / ml poly-D-lysin (PDL) lösning. Inkubera i en timme vid 37 ° C.
   8. Tvätta ställningar 3x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna icke-bundet PDL. (30 min)

2. Isolering av rått-kortikala neuron

1. Dissekera cortex från embryonala dag 18 (E18) Sprague-Dawley-råttor såsom beskrivits tidigare av Pacifici och Peruzzi ²⁷ efter godkänd djurprotokoll erhålles. (2 tim)
2. Inkubera 10 cortex i 5 ml 0,25% trypsin med 0,3% DNas I (från bovin pankreas) under 20 min vid 37 ° C.
3. Inaktivera trypsinet genom att tillsätta lika stor volym av 1 mg / ml sojabönprotein.
4. Finfördela cortex användning av 10 ml pasteurpipett genom pipettering upp och ner 20 gånger tills en enkelcellsuspension genereras. Var försiktig och undvika luftbubbelbildning. (10 min)
5. Centrifugera cellsuspensionen vid 127 xg under 5 minuter.
6. Återuppslamma cellpelleten i 10 ml odlingsmedium (Neurobasal medium, 1x B27 tillägg, 1x Glutamax, 1% penicillin / streptomycin). Räkna cellerna. Den förväntade cellkoncentrationen är cirka 2x10 ⁷ / ml. (20 min)

3. Konstruera Montering och kultur

1. Scaffold ympning med celler.
   1. Flytta sterila byggnadsställningar och alla nödvändiga redskap i en cellkultur huva. Använda steril pincett placera ställningar i en 96-brunnars cellodlingsplatta allokera en byggnadsställning per brunn. (10 min)
   2. Doppa ställningar i cellodlingsmedium till jämvikt dem innan cell utsädeIng. Inkubera i en timme vid 37 ° C. (10 min)
   3. Aspirera överskottet av mediet från ställningar.
   4. Tillsätt 100 pl av cellsuspensionen / schavotten. (10 min)
   5. Inkubera cellerna vid 37 ° CO / N för att möjliggöra för cellbindning till ställningen.
   6. Följande morgon aspirera de grupplösa celler och applicera 200 | j, l / brunn av färskt odlingsmedium. (10 min)
2. Scaffold inbäddning med kollagenmatrisen. (2 tim)
   1. Placera 10x PBS, vatten, 1 N NaOH och råttsvans I kollagen på is. Bered en arbetslösning av kollagen i enlighet med tillverkarens instruktioner. Behåll på is tills de cell såddes konstruktionerna är redo (upp till 1 timme).
   2. Ta bort cell seedade siden konstruktioner från inkubatorn och aspirera överskottet av mediet.
   3. Använda steril pincett överföra ställningar till tomma brunnar på brunnar och doppa varje klätterställning i 100 ^ 3 mg / ml kollagenlösning. Placera vävnadsodlingsplatta tillbakai inkubatorn under 30 min för att medge polymerisation av kollagen.
   4. Tillsätt 100 pl av förvärmda cellkulturmedium / brunn. Kultur konstruktionerna för en vecka ändra mediet varje dag genom att ersätta endast halv volym av mediet.

4. Mikroskopi Analys

1. Live / dead färgning (1 tim)
   1. Bered stamlösning av propidiumjodid (PI) 1 mg / ml (1,5 mM) i destillerat vatten.
   2. Bered stamlösning av fluoresceindiacetat (FDA) 2 mg / ml i aceton.
   3. Bered arbetslösning innehållande 10 iM PI och 0,15 iM FDA utspädd i PBS. Pre-värma lösningen till 37 ° C i ett vattenbad.
   4. Tvätta cellerna med förvärmda PBS för att avlägsna serum esteraser. Aspirera PBS.
   5. Applicera förvärmda arbetslösning på cellerna under 2 minuter och tvätta den med PBS.
   6. Använd epifluorescent mikroskop för att avbilda celler (PI ex λ = 490 nm, = em λ 570 nm, FDA ex λ = 490 nm, = em λ 514 nm). Fläcken förblir stabil under 40 minuter. Långvarig färgning kan resultera i ospecifika färgning till följd av PI upptag av cellerna och samlokalisering av PI / FDA i celler.
2. Immunfärgning
   1. Vid den önskade tidpunkten kultur fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) under 30 min vid RT. På grund av toxiciteten hos PFA ångor fixeringssteget bör utföras i dragskåp.
   2. Tvätta ställningar med 3x PBS Stoppunkt. PFA-fasta konstruktioner kan lagras i PBS vid 4 ° C i flera dagar innan du fortsätter med ytterligare åtgärder.
   3. Inkubera ställningar i 0,2% Triton, 0,25% bovint serumalbumin (BSA) i PBS innehållande primär antikropp O / N vid 4 ° C.
   4. Följande dag kassera färgningslösningen och tvätta ställningar 3 x 30 min med PBS för att avlägsna den icke bundna primära antikroppen.
   5. Inkubera proverna med sekundär antikropp utspädd i 0,2% Triton, 0,25% BSA i PBS under 2h vid RT.
   6. Avlägsna färglösningen och tvätta ställningar 3 x 30 minuter med PBS för att avlägsna obunden sekundär antikropp.
   7. Bild ställningar med hjälp av ett konfokalt mikroskop med 20X objektiv genom att ta 100 | j, m z-sektioner av provet med en xm steg. För att visualisera de tunna neurites bildupplösning bör vara på minst 1024 x 1024 pixlar.
3. RNA, DNA och proteinisolering
   Notera: RNA, DNA och proteinisolering utförs med användning av en kommersiell AllPrep DNA / RNA / protein Mini Kit enligt tillverkarens instruktioner.
   1. Använda steril pincett överföra ställningar ur odlingsplatta till ett 2 ml sterilt rör. Placera en byggnadsställning per rör.
   2. Tillsätt 200 pl av RLT-buffert till varje rör.
   3. Störa konstruktionen genom fragmentering den med sterila microscissors.
   4. För att homogenisera den avbrutna vävnaden, överföra innehållet i röret till spinnkolonn. Spin för 2 min vid full hastighet i en mikrocentrifug.Lysatet homogeniserades när den passerar genom centrifugeringskolonn.
   5. Samla flödet genom och använda den omedelbart för att isolera RNA, DNA och protein enligt tillverkarens protokoll.
   6. Kvantifiera utbytet av nukleinsyror någon annan kompatibel metod (t.ex. Nanodrop).
   7. Kvantifiera protein utbyte med användning av BCA Protein Assay enligt tillverkarens anvisningar. Mät resultatet av analysen med hjälp av mikroplattläsare vid våglängden 562 nm.
      Obs: Det förväntade utbytet av nukleinsyror och protein per konstrukt i relation till celldensiteten visas i fig 4.

Representative Results

Fast siden svampar förskuret till munkform representerar en unik och enkel idé att uppnå ett fack arkitektur som liknar nervvävnad (Figur 2A). Den mycket porösa strukturen hos ställningen med porstorlek av ca 500 | j, m resulterar i exceptionellt hög ytarea som medger ympning och tillväxt av hög celldensitet inom en liten volym (2x10 ⁷ / ml) (Figur 2B). Dessutom hög porositet av ställningen möjliggör obegränsad diffusion av näringsämnen och avfall som resulterar i överlägsen livskraft täta cellkulturer över utökade tidsramar. Vid sådd nervceller snabbt och jämnt fäster på ytan av de byggnadsställnings porer.

Efter cellvidhäftning är fullständig och cellerna jämviktas på silke substratet, är svampen ställningen fylld med den mjuka kollagenmatrisen i syfte att åstadkomma en 3D-miljö för axonal nätverksbildning (Figur 3 (figur 3B). Däremot ger kollagengelen ett nätverket som stöder omfattande axonal utväxt i 3D, medan neuronala cellkroppar sitter kvar på silke schavotten (Figur 3C). Detta tillväxtmönster leder till uppdelning av cellkroppar och rena axonal nätverk (Figur 3D), som liknar den grå och vita substansen i hjärnbarken i hjärnan.

Bortsett från mikroskopi, kan konstruktionerna utvärderas med en rad olika andra metoder ^18, beroende på vilken fråga bakom experimentet. Exempelvis kan isolering av DNA, RNA och protein från konstrukten vara lätt utföras med hjälp av kommersiella kit (Figur 4). Utbytet av nukleinsyror och protein per konstruktionen beror på antalet celler som ursprungligen seedade på siden ställningar. Ju fler celler ympas desto högre avkastning av DNA, RNA och protein.

Figur 1. PTFE form som används för silke svamp ställnings förberedelse Måtten:.. 10 cm i diameter, 2 cm höjd Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. 3D hjärnliknande vävnadsmodell. (A) Porös silke svamp schavotten. (B) Live / dead färgning av nervceller vid dag 1 efter sådd på siden schavotten före kollagen inbäddning (grön levande celler, röda döda celler). Paneler på höger sida visar magnification av området som fångas i röda ramar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Neuronal fack utväxt i 3D hjärnliknande vävnadsmodell (A) Scaffold fack:. Röd-cellkroppen fack, Blue-axonal fack. (B) Neuronal tillväxtmönster på dag 1 efter sådd innan kollagen inbäddning. (C). Neuronal utväxt på dag 7 efter sådd i cellkroppen facket. (D) Neuronal utväxt på dag 7 efter sådd i axonal facket. Grön -. ΒIIITubulin klicka Vänligen här för att se en större version av dennafigur.

Figur 4. Förväntad avkastning (A) RNA och DNA, och (B) protein per konstruktion i förhållande till mängden av celler såddes per byggnadsställning (± SD, n = 5). Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346