偏神経組織のエンジニア3Dシルクコラーゲンベースモデル

Introduction

中枢神経系（CNS）は、血管構造、機能性、感染性または変性を伴う種々の障害の影響を受けることができます。推定680万の人々が世界中で成長している社会経済的負担^{1を表し、}神経学的障害の結果として毎年死にます。しかし、障害のほんの数は、利用可能な治療法があります。したがって、神経障害に罹患している患者のための革新的な治療戦略のための重要な必要性が存在します。残念ながら、多くのCNS標的治療による生理学的に関連する機能の読み出しと急性および慢性影響の評価を可能にしない不十分な前臨床研究モデルの利用、一部には、臨床試験中に失敗。

過去数十年にわたる重要な研究努力にもかかわらず、CNSの構造と機能についての未知の膨大な量があります。より多くの知識を得るために、動物モデルは、頻繁に私達でありますEDは、特に前臨床試験において、例えば、外傷性脳損傷（TBI）、または認知症のような病理学的状態をモデル化します。しかし、動物は、遺伝子発現および代謝^2-4、CNSの解剖学だけでなく、機能の両方で人間とは大きく異なります。一方、2D インビトロ培養は、細胞生物学を研究するための一般的な方法であり、日常的に薬物発見のために使用されます。しかし、二次元細胞培養物は、人間の脳^5-7と比較して複雑さおよび生理学的関連性を欠いています。動物モデルにより提供される2次元細胞培養研究や複雑さの低コストと単純に代わるはありませんが、3D組織工学は 、in vitroおよびin vivoのアプローチで 、2Dの間に存在するギャップを埋めるために改良された研究のモデルを生成することができます。 3D組織工学は、生体材料足場が提供する3D細胞 - 細胞相互作用および細胞外の合図によって達成より生理学的に関連する実験条件を提供します。 Desp3D培養物の値の背後にある重要な証拠をITEは、このような幹細胞由来オルガノイド文化^8-10としてわずか数3D CNS組織モデルは、現在ありますが^、11を neurospheroidsヒドロゲル培養^12,13を分散させました。多層リソグラフィー^14、および3D印刷^15を含む高度な技術の方法は、肺、肝臓、及び腎臓の組織を研究するために利用されています。しかし、そのような皮質アーキテクチャと生物学を模倣するように区画ニューロンの成長を可能にする3D CNSモデルの欠如があります。神経細胞体から神経突起の分離された成長は、以前に軸索道のトレース、カルシウム流入、ネットワークアーキテクチャや活動の研究を可能にする微細加工^16,17を使用することにより、2D培養で実証されています。この考えは、細胞体と軸索路は、脳¹⁸の階層化アーキテクチャを模倣異なる区画に配置されている3D偏神経組織を開発するために私たちに影響を与えました

Protocol

脳組織の分離プロトコルは、タフツ大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイド（施設内動物管理使用委員会B2011-45）の国立研究所に準拠していました。

1.シルク足場の準備

1. カイコの繭からシルク溶液の調製以前に^19,20説明したように。
   1. はさみを使用して8等分に各繭をカットします。断片化された繭の5グラム約11繭を使用してください。 （15分）
   2. 0.02 MのNa _{2 CO} 3溶液の2リットルを用意し、ホットプレートを用いて沸騰するためにそれを持って来ます。 （15分）
   3. 断片化された繭を5g秤量し、30分間のNa ₂ CO _3溶液でそれらを沸騰。スパチュラで沸騰絹を数分おきにかき混ぜます。また、脱ガム引きと呼ばれるこのステップは、親水性タンパク質、セリシンから絹フィブロインを浄化します。 （30分）
   4. シャーレに湿ったフィブロインを置き、流フードO / Nでフィブロインの抽出物を乾燥させます。
   5. 次の日は、乾燥フィブロイン量を計量し、ガラスビーカー中フィブロインを配置します。 （15分）
   6. 9.3 MのLiBr溶液にフィブロインを溶解させるために、4で乾燥したフィブロインの質量を乗じてのLiBr（ml単位）必要な量を計算ゆっくり絹フィブロインを超える臭化リチウム水溶液を注ぎ、スパチュラを使用して、すべてのフィブロイン繊維を浸します。蒸発を防止し、繊維を溶解させるために4時間60°Cでそれを配置するビーカーを覆います。 （15分）
   7. シリンジを用いて、ビーカーからフィブロイン溶液を収集し、MWCO 3500透析カセットにロードします。 48時間蒸留水に対して透析を行ってください。水に数時間おきに変更します。
   8. シリンジを使用して、よりフィブロイン溶液を集めます20分間4℃で9,000 rpmで（〜12,700 XG）の2倍で50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にカセット。各遠心分離工程の後に新しいチューブに上清を注ぎ、ペレットを捨てます。 （40分）
   9. 乾燥重量を推定することによりフィブロインの濃度を測定します。計量ボートに絹溶液1mlを注ぎます。 2時間60℃のオーブン中でサンプルを乾燥させます。乾燥した絹フィブロインを秤量し、シルク溶液の予想濃度が6-9％（w / v）のある100により得られた重みを乗算して絹フィブロイン溶液の濃度を計算します。
   10. 蒸留水で希釈することにより（w / v）の6％絹濃度を調整します。
       停止ポイント液体絹フィブロインは、密閉容器内で最大1ヶ月間、4℃で保存することができます。
2. シルク溶液から多孔質足場の調製。
   1. 顆粒を分離するために、粒状のNaClをふるいは、後のステップで使用される500-600μmで、大きさ。顆粒を破棄Sは500ミクロン以下および600ミクロンを超えるサイズに。 （15分）
   2. ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）型（ 図1）への6％絹溶液30mlを注ぎます。静かに絹の上にふるいにかけられ、NaClの60グラムを散乱。塩の均一な層を得るために、コンテナをタップします。絹の重合に室温で48時間インキュベートします。
   3. 重合を完了し、残りの液体を蒸発させるために1時間60℃のオーブンで足場を有するPTFE製の金型を置きます。
   4. 塩を浸出するために48時間蒸留水2リットルを含むビーカー中のPTFE金型のコンテンツを配置します。水1日あたり2〜3回に変更します。塩が完全に溶出されたときに、金型からのスポンジ足場を削除ポイントの停止 ：スポンジ脱水から足場を防ぐために密閉容器中で4℃の水に浸漬し保存することができます。
   5. 準備ができたら、直径5mmの生検パンチで足場を切り出します。高さが約2mmに到達するために足場をプレカット。 Puの直径2mmの生検パンチ（ 図2A）で足場の中心をNCH。 （1時間）
   6. 。 ポイントの停止 （湿潤サイクル、121℃、20分）して滅菌水に浸漬した足場をオートクレーブ：スポンジ脱水から足場を防ぐために密閉容器中で4℃の水に浸漬し保存することができます。
   7. 計画された細胞播種の前に、滅菌した0.1 mg / mlのポリ-D-リジン（PDL）溶液中で足場を浸します。 37℃で1時間インキュベートします。
   8. 足場は非結合PDLを除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。 （30分）

ラット皮質ニューロンの2の単離

1. 承認された動物プロトコルが得られた後、以前にPacificiとペルッツィ^27で説明したように日胚から18（E18）Sprague-Dawleyラットを皮質を解剖。 （2時間）
2. 3で20分間（ウシ膵臓から）、0.3％のDNアーゼIを有する0.25％トリプシン5mlの10皮質をインキュベート7°C。
3. 1mg / mlの大豆タンパク質の等容積を添加することによってトリプシンを不活性化します。
4. 単一細胞懸濁液が生成されるまでピペットで10 mlのパスツールピペットを用いて皮質ダウン20回粉砕します。穏やかであると気泡の形成を避けます。 （10分）
5. 5分間127×gで細胞懸濁液を遠心。
6. 再懸濁培地10ml中の細胞ペレット（Neurobasal培地、1×B27サプリメント、1×グルタマックス、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。細胞を数えます。予想される細胞濃度が約2×10 ⁷ / mlです。 （20分）

3.アセンブリと文化を構築

1. 細胞と足場播種。
   1. 無菌の足場と細胞培養フード内のすべての必要な調理器具を移動します。滅菌ピンセットを使用して、ウェルごとに足場を割り当てる、96ウェル細胞培養プレート中で足場を置きます。 （10分）
   2. 前の細胞種にそれらを平衡化するために、細胞培養培地中での足場を浸しる。 37℃で1時間インキュベートします。 （10分）
   3. 足場からのメディアの過剰を吸引します。
   4. 細胞懸濁液/足場の100μLを適用します。 （10分）
   5. 足場への細胞接着を可能にするために37°のCO / Nで細胞をインキュベートします。
   6. 翌朝は、非付着細胞を吸引し、200μl/ウェルの新鮮な培養培地を適用します。 （10分）
2. コラーゲンマトリックスに埋め込む足場。 （2時間）
   1. 私は氷の上にコラーゲン10倍PBS、水、1NのNaOHおよびラットの尾を置きます。製造者の指示に従って、コラーゲンのワーキング溶液を調製します。細胞を播種した構築物は、（1時間まで）準備ができるまで、氷上に維持します。
   2. インキュベーターから細胞を播種した絹の構造を削除し、メディアの過剰を吸引。
   3. 滅菌ピンセットを使用すると、ウェルプレートの空のウェルに足場を転送し、3 mg / mlのコラーゲン溶液の100μlの各足場を浸します。バック組織培養プレートを置きコラーゲンの重合を可能にするために30分間インキュベーターインチ
   4. ウェル/予熱した細胞培養培地100μlを適用します。文化一週間構築物は、培地の半分だけボリュームを交換することにより、毎日培地を交換すること。

4.顕微鏡分析

1. 生/死染色（1時間）
   1. ヨウ化プロピジウム（PI）を蒸留水に1mg / mlの（1.5ミリモル）のストック溶液を調製します。
   2. アセトン中のフルオレセインジアセテート（FDA）の2mg / mlのストック溶液を調製します。
   3. PBSで希釈した10μMのPIおよび0.15μM、FDAを含むワーキング溶液を調製します。水浴中で37℃に溶液を予め温めます。
   4. 血清エステラーゼを除去するために、予め温めておいたPBSで細胞を洗浄。 PBSを吸引除去します。
   5. 2分間細胞に予め温めておいた作業溶液を適用し、PBSで洗ってください。
   6. FDAの元λ= 490 nは、画像への落射蛍光顕微鏡を使用する細胞（PIの元λ= 490 nmのは、EMλは570nmでの=mは、全角λ）は514nmのを=。染色は、40分かけて安定しています。長時間の染色は、細胞と細胞内でのPI / FDAの共局在によってPI取り込みに起因する非特異的な染色をもたらす可能性があります。
2. 免疫染色
   1. 培養物の所望の時点で、RTで30分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定します。 PFAの毒性に定着工程は、化学ヒュームフード内で行われるべきであるヒューム。
   2. 。 ポイントの停止 3倍PBSで足場を洗う：PFA-固定構築物は、さらなるステップに進む前に数日間4℃でPBS中に保存することができます。
   3. 4℃で一次抗体のO / Nを含有するPBS中の0.2％トリトン、0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）中で足場をインキュベートします。
   4. 次の日は、染色溶液を廃棄し、結合していない一次抗体を除去するためにPBSで足場を3×3​​0分を洗います。
   5. 0.2％トリトン中に希釈した二次抗体とサンプル、PBS中の0.25％BSAで2インキュベートRTで時間。
   6. 染色溶液を除去し、未結合の二次抗体を除去し、PBSで足場を3×3​​0分を洗います。
   7. 画像1μmのステップとサンプルの100μmのZ-セクションを取ることによって20Xの目的とした共焦点顕微鏡を用いて足場。細い神経突起を可視化するために画像の解像度は、最小1,024×1024ピクセルでなければなりません。
3. RNA、DNAおよびタンパク質の単離
   注：RNA、DNAおよびタンパク質の分離は、製造業者の説明書に従って商業AllPrep DNA / RNA /タンパク質ミニキットを用いて行われます。
   1. 滅菌ピンセットを使用すると、2ミリリットル滅菌チューブに培養プレートの外に足場を転送します。チューブあたり1足場を置きます。
   2. 各チューブにRLT緩衝液200μlを追加します。
   3. 滅菌microscissorsでそれを断片化することによって構造物を破砕。
   4. 破壊された組織を均質化するために、スピンカラムにチューブの内容を転送します。微量でフルスピードで2分間スピン。これは、スピンカラムを通過する際に溶解物を均質化します。
   5. フロースルーを収集し、製造業者のプロトコルに従ってRNA、DNAおよびタンパク質を単離するために、すぐにそれを使用しています。
   6. 核酸の収量互換性のある他の方法（例えば、光度計）を定量化します。
   7. 製造業者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを使用して、タンパク質収量を定量化。波長562nmでマイクロプレートリーダーを用いたアッセイの結果を測定します。
      注：細胞密度に関連して構築あたりの核酸およびタンパク質の予想収量は、 図4に示されています。

Representative Results

ドーナツ状にソリッドシルクスポンジのプレカットは、神経組織（ 図2A）に似た区画化アーキテクチャを実現するために、ユニークでシンプルなアイデアを表しています。小容積内の高細胞密度のシーディング及び成長を可能にする非常に高い表面積（2×10 ⁷ / mlで）（ 図2B）で約500μmの結果の細孔径を有する足場の高度に多孔性の構造。さらに、足場の高気孔率は、延長時間枠を超える高密度の細胞培養物の優れた生存性が得られ栄養素や老廃物の無制限の拡散を可能にします。神経細胞を播種時に迅速かつ均一に足場孔の表面に付着します。

細胞接着が完了し、細胞が絹基板上に平衡化された後、スポンジ足場は、軸索ネットワーク形成（ 図3では 、3D環境を提供するために、柔らかいコラーゲンマトリックスが充填されています図3B）で見られるような混合ネットワークでは、得られた細孔の表面に拡張を成長するにつれてコラーゲンマトリックスが存在しない場合には、軸索および細胞体の区画化することはできません。これとは対照的に、コラーゲンゲルは、神経細胞体はシルク足場（ 図3C）に付着したままながら、3Dで大規模な軸索 ​​伸長をサポートしている網目構造を提供します。この成長パターンは、細胞体および純粋な軸索 ​​ネットワーク、脳内の皮質の灰白質と白質に似ている（ 図3D）の区画につながります。

顕微鏡から離れて、構築物は、実験の背後にある問題に応じて、他の方法¹⁸の様々な評価することができます。例えば、構築物からのDNA、RNAおよびタンパク質の単離を容易に市販のキット（ 図4）を用いて行うことができます。核酸およびタンパク質PEの収率R構築物は、最初は絹の足場に播種した細胞の数によって異なります。より多くの細胞を播種したDNA、RNAおよびタンパク質の収率が高いです。

シルクスポンジ足場調製のために使用される図1のPTFE金型寸法：直径10cm、2cmの高さ、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2. 3D脳のような組織モデル。（A）は、多孔質シルクスポンジ足場。前コラーゲン（緑生細胞、赤死細胞）を埋め込 ​​むシルク足場に播種時の1日目でのニューロンの（B）生/死染色。右側のパネルは、MAを表示赤いフレームでキャプチャエリアのgnification。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3.神経3D脳のような組織モデルで区画さ伸長（A）足場コンパートメント：赤細胞体コンパートメント、青軸索コンパートメント。 （B）コラーゲン埋め込 ​​み前に播種時の1日目に神経成長パターン。 （C）。細胞体コンパートメントに播種時の7日目の神経突起伸長。 （D）軸索の区画に播種時の7日目の神経突起伸長。 βIIITubulin -グリーン。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。

（A）RNAおよびDNA、および足場ごとに播種された細胞の量に関連した構造物あたり（B）は、タンパク質の図4の期待利回り（±SD、n = 5）であった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346