Abstract
Slagtilfælde forskning har udholdt mange tilbageslag i at oversætte neurobeskyttende terapier til klinisk praksis. I modsætning hertil den virkelige verden terapi (tPA trombolyse) sjældent frembringer fordele i mekaniske okklusion baseret forsøgsmodeller, som dominerer præklinisk slagtilfælde forskning. Denne splittelse mellem bænken og bedside antyder behovet for at ansætte tPA-responsive modeller i præklinisk slagtilfælde forskning. Til dette formål er en enkel og tPA-reaktivt trombotisk slagtilfælde model opfundet og beskrevet her. Denne model består af forbigående okklusion af den ensidige fælles carotidarterie og levering af 7,5% oxygen gennem en ansigtsmaske i voksne mus i 30 minutter, samtidig med at dyret rektale temperatur ved 37,5 ± 0,5 ° C. Selv reversibel ligering af den ensidige halspulsåren eller hypoksi hver undertrykt cerebral blodstrøm kun kortvarigt, kombinationen af begge fornærmelser forårsagede vedvarende reperfusion underskud, fibrin og blodpladeaflejring, og store infarct i den midterste cerebrale arterie-leveret område. Vigtigere, hale-vene injektion af rekombinant tPA ved 0,5, 1 eller 4 timer efter THI (10 mg / kg) billede tidsafhængig reduktion af dødeligheden og infarktstørrelse. Denne nye slagtilfælde model er enkel og kan standardiseres på tværs laboratorier til at sammenligne forsøgsresultater. Endvidere er det fremkalder trombose uden kraniektomi eller indfører præformede emboli. Givet disse unikke fortjenester, at THI modellen er en nyttig tilføjelse til repertoiret af prækliniske slagtilfælde forskning.
Introduction
Trombolyse og rekanalisering er den mest effektive terapi af akut iskæmisk slagtilfælde i klinisk praksis 1. Alligevel blev størstedelen af prækliniske neurobeskyttelse forskning udført i et transient mekaniker obstruktion model (intraluminale sutur mellem-cerebral arterie okklusion), der frembringer hurtig genopretning af cerebral blodstrøm efter fjernelse af vaskulær okklusion og viser lidt at ingen fordele ved tPA trombolyse. Det er blevet foreslået, at den tvivlsomme valg af slagtilfælde modeller bidrog, i det mindste delvist, af problemer med at oversætte neurobeskyttende terapi til patienter 2,3. Derfor er der et stigende krav om at ansætte tPA-responsive tromboembolisk slagtilfælde modeller i præklinisk forskning, men sådanne modeller har også tekniske problemer (se Diskussion) 4-7. Her beskriver vi en ny trombotisk slagtilfælde model baseret på ensidig forbigående hypoxisk-iskæmisk (THI) fornærmelse og dets reaktioner på intravenøs tPA terapi 8.
Den THI slagtilfælde Modellen er udviklet på grundlag af Levine procedure (permanent ligering af den ensidige fælles halspulsåren efterfulgt af udsættelse for forbigående hypoxi i et kammer), der blev opfundet for forsøg med voksne rotter i 1960 9. Den oprindelige Levine procedure falmet i ubemærkethed, fordi den kun produceret variabel hjerneskade, men den samme fornærmelse forårsagede konsekvent neuropatologi i gnavere hvalpe da den blev genindført af Robert Vannucci og hans kolleger som en model af neonatal hypoxisk-iskæmisk encefalopati (HIE) i 1981 10. I de senere år nogle undersøgere re-tilpasset Levine-Vannucci model til voksne mus ved at justere temperaturen i hypoksiske kammer 11. Det er sandsynligt, at de inkonsistente hjernelæsioner i den originale Levine procedure kan opstå svingende kropstemperatur af voksne gnavere i hypoxiske kammer. For at teste denne hypotese, ændrede vi Levine procedure ved at indgive hypoksisk gasgennem en ansigtsmaske, under opretholdelse af gnaver kernetemperatur ved 37 ° C på det kirurgiske bord 12. Som forventet stringent kropstemperatur kontrol stærkt forøget reproducerbarhed HI-induceret hjernen patologi. HI fornærmelse udløser også koagulation, autophagy og gray- og hvid substans skade 13. Andre forskere har også brugt HI-modellen til at undersøge efter slagtilfælde inflammatoriske reaktioner 14.
En unik egenskab ved HI slagtilfælde model er, at den nøje følger Virchow triade af trombedannelse, herunder stasis af blodgennemstrømningen, endotel skade (fx på grund af HI-induceret oxidativt stress), og hyperkoagulabilitet (HI-induceret blodpladeaktivering) ( figur 1A) 15. Som sådan kan HI model fange nogle patofysiologiske mekanismer er relevante for den virkelige verden iskæmisk slagtilfælde. Med denne idé i tankerne, vi yderligere forfinet HI model med reversibel ligation af unilateral fælles halspulsåren (derfor at skabe en forbigående HI fornærmelse), og afprøvet sine reaktioner på tPA trombolyse med eller uden Edaravone. Edaravone er et gratis radikaler der allerede er godkendt i Japan til behandling af iskæmisk slagtilfælde inden 24 timer for debut 9. Vores forsøg viste, at så kort som 30 min forbigående HI udløser trombotisk infarkt, og at kombineret tPA-Edaravone behandling giver synergistiske 8 fordele. Her beskriver vi detaljerede kirurgiske procedurer og metodiske overvejelser THI model, som kan anvendes til at optimere reperfusion behandlinger af akut iskæmisk slagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Emory University og følger National Institutes of Health Guideline for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Opsætning
- Forberede den kirurgiske seng på opvarmning pad forbundet med varmepumpe ved 37 ° C i mindst 15 minutter før operationen. Placer en hals roll hjælp tønde af 3 ml sprøjte på den kirurgiske seng. Forbered anæstesi gas med 2% isofluran i medicinsk luft.
- Forbered autoklaverede pincet, saks, micro nål indehavere, hæmostat, vatpinde og suturer. Forbered væv lim og øjensalve.
- Opsætte hypoxi-systemet og temperaturregulatorer med varme lampe og rektal sonde. Forbered hypoxi gas med 2% isofluran i 7,5% O 2 afbalanceret 92,5% N2.
- En time før kirurgi mus analgesized ved subkutan injektion af en langsom frigivelse Meloxicam (4,0 mg / kg).
- Bedøver 10-13 uger gamle mandlige C57BL / 6 mus, der vejer 22-30 g i anæstesi induktion kammer med 3% isofluran indtil dyret ikke reagerer på mund squeeze, og derefter fjerne hår på højre hals ved hjælp af en elektronisk barbermaskine.
- Placer mus på den kirurgiske bed forbundet med 2% isofluran i medicinsk luft ved strømningshastighed på 2 l / min. Sikker forlemmer strakt ud langs halsen roll på siderne ved hjælp af medicinsk tape.
- Rengør operationsstedet for snit med betadin efterfulgt af alkohol og derefter vatpinde.
- Under dissektionsmikroskop, lave en 0,5 cm højre cervikal incision ved hjælp af en lige pincet og en mikro saks ca. 0,2 cm sideværts fra midterlinjen hud.
- Brug et par fine savtakkede pincet til at trække fra hinanden fascia og væv for at blotlægge den højre, fælles carotidarterie (RCCA). Adskil forsigtigt RCCA fra vagusnerven anvendelse af et par fine glatte pincet.
- Levende knude to forskåret 5-0 silke sutur (kan frigøres) på RCCA, og sy op huden ved hjælp af 4-0 Nylon monofilament sutur (figur 1C).
- Anvend øjet salve på begge øjne til at forebygge tørhed.
- Hurtigt overføre musene på hypoxi, og sætte næse og mund i ansigt-maske med 2% isofluran i 7,5% O 2 ved strømningshastighed på 0,5-1 l / min i 30 min.
- Under hypoxi, brug temperaturregulatorer med varmelamper at kontrollere rektal temperatur ved 37,5 ± 0,5 ° C. Overvåg respirationsfrekvens på 80-120 vejrtrækninger / min. Vedligeholdelsen af kropstemperatur over 37 ° C under hypoxi er vigtigt at skabe ensartet hjerne infarkt. Lav respirationsfrekvens sker normalt efter 20 min hypoxi. Fjern face-maske og tillade normal lufttilførsel, hvis respirationsfrekvens falder under til 40. Det tager 1-2 min og tæller ikke i 30 min hypoxi varighed.
- Efter hypoxi, overføremus til en kirurgisk seng og løslade de to suturer fra RCCA. Lukke såret under anvendelse vævslim, og returnere mus til buret derefter. Udeluk dyrene, hvis begge to levende knuder er uventet løsladt efter hypoxi.
- Overvåg musene for 5-10 min at komme sig hypoxi og anæstesi. Placer fugtet mad i buret og returnere det til dyr pleje facilitet.
Bemærk: Dyr med mild til svær cirkelbevægelser adfærd ved 24 timer efter THI er korreleret med hjerne overtrædelse. De fleste dyr med beslaglæggelse symptomer dør før 24 timers tidspunkterne efter THI.
3. Laser Speckle Contrast Imaging
Bemærk: Selv om dette ikke er et væsentligt procedure af THI model kan en todimensional laser speckle kontrast imaging system 16 anvendes til at karakterisere ændringerne i cerebral blodstrøm (CBF) under eller efter transient hypoxi-iskæmi. At dokumentere ændringer af CBF under THI, rekord umiddelbart efter step 2.6. Alternativt at sammenligne CBF bedring efter THI insult, disse procedurer kan udføres efter trinet 2.10.
- Placer en bedøvet mus i bugleje og udfører en 1 cm lang midtlinieincision på hovedbunden med kraniet eksponeret, men uåbnet.
- Overvåg CBF i begge hjernehalvdele under en blodgennemstrømning imager ifølge producentens protokol og starte optagelsen den cerebrale blodgennemstrømning umiddelbart efter CCAO kirurgi (trin 2.6). Fortsæt i 50 minutter.
- Vis CBF billede med arbitrære enheder i en 16-farvepaletten og analysere i realtid de udvalgte områder med den MoorFLPI softwaren i overensstemmelse med producentens instruktioner (figur 2).
- Efter registrering af CBF billedet, lukker hovedbunden med væv lim og sende dyret tilbage til buret.
4. tPA Administration
- Injicere dyr på halevenen med opløsningsmidlet eller 10 mg / kg rekombinant tPA (220-300 &# 956; l på 1 mg / m tPA) ved 0,5, 1 eller 4 timer efter tCCAo plus hypoxi (figur 4).
5. Brain Damage Detection med flere forskellige muligheder
Bemærk: For at indsamle hjerne prøver, aflive mus ved 1, 4 eller 24 timer efter THI.
- Udfør kvantificering af infarktvolumen ved in vivo 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) metode ved 24 timer efter THI fornærmelse som tidligere beskrevet. 17
- Intraperitonealt injicere dyr med 1,4 M mannitol-opløsning (~ 0,1 ml / g legemsvægt) 30 min før transcardial perfusion. Transcardial perfundere mus med PBS efterfulgt af 10 ml 2% TTC.
- Fjern hjernen af dyr med kirurgiske instrumenter efter 10 min og anbringes i 4% paraformaldehyd til fiksering natten over og sektion i 1 mm tykkelse med en vibratome.
- Snap en serie af fire sektionerede hjernen slides ved digital mikroskop og quantgiv det infarktvolumen som forholdet af infarktområdet (hvidt område i højre side) til det område, som ubeskadiget, kontralaterale hemisfære hjælp af ImageJ software.
- Alternativt udføre trombose dannelse ved immunfluorescens på 1 time efter THI fornærmelse.
- Frys den faste hjernen i oktober sammensatte og afsnittet hjernerne hos 12 um tykkelse ved hjælp af en kryostat.
- Inkubér hjernen slide med kanin-anti-fibrinogen-antistof (1: 100) efterfulgt af gede-anti-kanin Alexa Fluro 488 farvestof (1: 200) at observere fluorescensen på et fluorescerende mikroskop.
- Alternativt udføre karobstruktion ved haleveneinjektion af 100 pi 2% Evans blåt farvestof ved 4 timer efter THI insult.
- Aflive musene og hurtigt skæres hovedet for at fjerne hjerner i 4% paraformaldehyd efter Evans blue injektion. Bemærk: Det tager 5-10 min til Evans blå cirkulation med blå farve både for- og bagben.
- Sectipå faste hjerner ved 100 um tykkelse ved hjælp af en glidende mikrotom og observere fluorescensen ved anvendelse af en 680 nm emission filter på et fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Todimensional laser speckle kontrast imaging (LSCI) 16 blev anvendt til at sammenligne ændringer i cerebral blodstrøm (CBF) ved 30 min forbigående ensidig carotis okklusion (tCCAO), 30 min udsættelse for hypoksi (7,5% oxygen), og 30 min ensidig carotid ligation under hypoxi (THI). Dette forsøg viste, at tCCAO under normoxi undertrykte CBF på carotis ligeret halvkugle til ~ 50% af basislinieværdien, som hurtigt genvindes til over 85% efter frigivelse af carotis okklusion (R i figur 2A). Udsættelse for systemisk hypoxi alene reducerede CBF til ca. 75% af baseline-værdi, som forbigående rebound til ~ 130% efter vender tilbage til normoxisk atmosfæren (figur 2B). I modsætning carotis ligation under hypoxi (THI) hurtigt reduceret CBF i ipsilaterale hemisfære til mindre end 20% af baseline værdi omkring 10 min, der sjældent genvundet til over 30% ved 20 min efter frigivelsen af carotis ligation og vender tilbage til normoxi. CBF på den kontralaterale hemisfære (L) imidlertid svinget mellem 20 og 50% under hypoxi, og hurtigt tilbage til over 80% efter den THI insult (figur 2C).
Ved 24 timer efter tCCAo (30 min) eller tCCAO plus 30 min hypoksi (THI), blev in vivo TTC pletten anvendes til at detektere infarkt 17. Denne analyse viste ingen indlysende skade ved tCCAO fornærmelse, men målbare infarkt i den midterste cerebrale arterie-leverede område efter THI insult (figur 3A). Anti-fibrin (ogen) immunfarvning blev anvendt til at sammenligne de tCCAO- og THI-skadede hjerner 1 time genvinding og viste udbredt aflejring af fibrin (ogen), en indikator for trombose, i thi-skadet, men ikke tCCAO-udfordrede mus hjerner (figur 3B, C). Hale-vene injektion af Evans blue farvestof blev også anvendt til at sammenligne vaskulær perfusion af tCCAO- og THI-skadede hjerner på 4 timer recovery. Denne analyse viste mindskesed cerebral perfusion og intens ekstravasation af Evans blåt farvestof i thi-skadet, men ikke de tCCAO-udfordrede mus hjerner (figur 3D, E).
Endelig resultaterne af THI insult i mus, der modtog hale-vene injektion af vehikel (ved 0,5 timer genvinding) eller rekombinant humant tPA (Activase, 10 mg / kg, 0,5, 1, eller 4 timer efter Thi) blev sammenlignet ved anvendelse i vivo TTC plet på 24 hr gendannelse (figur 4A). I bærerbehandlede mus, dødeligheden ved 24 timer efter THI var 23,8%, og kun én ud af 21 THI-såret mus var ud over middelværdien og 2 SD (den outlier). 24 timers dødelighed i mus, der modtog tPA behandling ved 0,5 time nyttiggørelse faldet til 8,3%, men denne effekt blev tabt, når tPA blev administreret på 1 eller 4 timer efter THI insult (figur 4B). Figur 4C afbildet infarktstørrelsen af alle overlevede mus i de fire behandlingsgrupper. Notatet både 0,5 og 1 time tPA-administration significantly reduceret infarktstørrelse, når sammenlignet med vehikel behandling. Den 0,5 timer tPA-behandlingsgruppe viste også en signifikant reduceret infarktstørrelse end 4 timer tPA-behandlingsgruppe. Figur 4D viste repræsentative TTC-pletten resultatet efter hver behandling.
Figur 1:. Procedure for transient cerebral hypoxi-iskæmi (THI) insult i voksne mus (A) Virchow triade, som driver thrombose omfatter stasis af blodgennemstrømning, endotel skade, og hyperkoagulabilitet af blodet. (B) En skematisk diagram af THI slagtilfælde procedure. To udløselige knuder blev bundet på den højre, fælles carotidarterie (CCA), efterfulgt af levering af 7,5% oxygen via en næse kegle i 30 minutter, mens musen rektale temperatur blev holdt på 37-38 ° C. Efter det transeuropæiskeient systemisk hypoxia, blev CCA ligering udløses ved at trække ud den ene ende af den udløselige sutur knob. MCA, midterste cerebrale arterie; ICA, indre carotidarterie; ECA, ekstern halspulsåre; CCA, fælles carotidarterie. (C) Kirurgiske procedurer for forbigående højre CCA okklusion. 1. To forskåret sutur (# 1 og # 2) blev placeret under en isoleret rigtige CAA. 2. To udløselige knob blev foretaget. 3. Snittet linje blev lukket op af sutur # 3. Sørg for, at enderne af sutur # 1 og # 2 var tilgængelige uden snittet linje. 4. Træk forsigtigt sutur # 1 og # 2 udefra for at frigøre CCA. Når udføres forsigtigt, vil denne procedure ikke forårsage laceration af CCA.
Figur 2:. Analyse af cerebrale blodgennemstrømning ændringer under og efter THI fornærmelse En todimensional laser speckle kontrast imaging (LSSystemet Cl) blev anvendt til at evaluere cerebral blodstrøm (CBF). R (højre) angiver carotis-ligeret halvkugle; L (venstre) er den kontralaterale hemisfære. (A) tCCAO under normoxi undertrykt CBF til ~ 50% af baseline værdi på carotis-ligeret halvkugle (R) i mindst 30 minutter, hvilket steg til over 85% inden for 3 min ved deaktivering af den carotis ligation. (B) I hypoxi (7,5% ilt, 30 min) uden halspulsåren ligation, CBF faldt til 76% af baseline værdi og forbigående steg til omkring 130% efter at vende tilbage til normoxi. (C) I forbigående carotis ligation under hypoxi (THI, 30 min), CBF på carotis-ligeret (R) halvkugle hurtigt faldet til mindre end 20% af baseline-værdi, og det sjældent genvundet til over 30% ved frigivelse af carotid ligation og vender tilbage til normoxi. I modsætning hertil CBF på den kontralaterale (L) hemisfære svinget mellem 20-50% under hypoxi, og hurtigt tilbage til> 80% af basislinienværdi efter udgivelsen af carotis ligation og vender tilbage til normoxi. Vist er repræsentative CBF tracings for n> 4 i hver gruppe. De tidspunkter for repræsentative fotografier LSCI var præget af grå linjer i det repræsentative sporing.
Figur 3: Brain infarkt, spontan trombose og karobstruktion efter THI insult (A) In vivo TTC-farvning viste ingen synlige infarkt ved 24 timer efter 30 min forbigående ligering af den højre normale carotidarterie (tCCAO), men tilsætning af. 30 min hypoxi (7,5% ilt) til tCCAO producerede betydelige infarkt i den ipsilaterale hemisfære (stjerne), for det meste i midten cerebralarterie-leverer område. (B, C) Anti-fibrin (ogen) immunfarvning på 1 time efter, at THI fornærmelse viste udbredte aflejringer iipsilaterale hemisfære. I modsætning hertil var der ingen fibrin (ogen) indskud på 1 time efter tCCAo (30 min) insult (n> 4 for hver). (D, E) Cerebral perfusion blev vurderet ved hale-vene injektion af Evans blåt farvestof ved 4 timer efter tCCAO (30 min) eller THI (30 min) insult. I post-tCCAO hjerne, Evans blåt farvestof fyldt fleste af blodkarrene i den ipsilaterale hemisfære. I modsætning hertil i post-THI hjerne, Evan Blå farvestof fyldt færre blodkar og blev lækket til parenkym (n> 3). Målestok: 250 um.
Figur 4: Virkninger af tPA trombolyse i THI slagtilfælde model (A) Oversigt over eksperimenter for at sammenligne virkningerne af intravenøs tPA administration (10 mg / kg) ved 0,5, 1, eller 4 timer efter THI insult.. (B) Sammenfatning af antallet af opererede dyr, mortality i 24 timer efter fornærmelser, outliers (infarktstørrelsen uden middelværdien +/- 2 SD), og antallet af dyr, inkluderet til sammenligning af infarktstørrelse. (C) Kvantificering viste en gennemsnitlig 32% infarktvolumen i vehikelgruppen og signifikant reduktion af infarkt i 0,5 h (16%) og 1 time (til 20%) grupper (vist er middelværdier og SEM for hver gruppe). P-værdier bestemmes ved t-test. (D) Repræsentant TTC-farvede hjernen fra dyr, der blev udfordret af THI fornærmelse og modtaget tPA behandling på det angivne tidspunkt-punkt efter skade. I TTC-farvning, levende væv udviste rød farve; infarkt væv var bleg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slagtilfælde er et stort sundhedsproblem med voksende betydning for ethvert samfund med en aldrende befolkning. Globalt slagtilfælde er den anden dødsårsag med en anslået 5,9 mio fatale begivenheder i 2010, svarende til 11,1% af alle dødsfald 18. Slagtilfælde er også den tredje-hyppigste årsag til handicap leveår (DALY) mistede globalt i 2010, stiger fra femte position i 1990 19. Disse epidemiologiske data understreger behovet for mere effektive behandlingsformer af akut (iskæmisk) slagtilfælde. Men på trods af intens forskning i præklinisk nervebeskyttende behandling, tPA-trombolyse er den eneste specifik behandling af akut iskæmisk slagtilfælde, som er godkendt af Food and Drug Administration i USA, mens mange gang lovende neurobeskyttende midler i dyreforsøg mislykkedes i kliniske forsøg. Vanskeligheden med at oversætte neurobeskyttende terapier i patienter har mange faktorer, og den nuværende lægges vægt på god laboratoriepraksis prakce, meta-analyse af flere datasæt, og internationalt samarbejde for at forbedre præklinisk slagtilfælde forskning 20,21. Der er imidlertid en mindretalsudtalelse tyder på, at den translationelle vanskelighed skyldes et dårligt valg af mekaniske vaskulære okklusion modeller (f.eks intraluminale sutur MCA-okklusion) i de fleste prækliniske slagtilfælde hidtidige forskning 2,3. Fordi mekanisk vaskulære okklusion modeller sjældent fremkalde trombose og cerebral reperfusion sker for hurtigt efter udgivelsen af mekanisk obstruktion, hverken disse modeller reagere på real-word terapi (tPA fibrinolyse) giver heller ikke et snævert terapeutisk vindue som dem i patienter med slagtilfælde. Derfor den foreslåede løsning er at understrege, mindst omfatte, tromboembolisk slagtilfælde modeller i præklinisk slagtilfælde forskning 3.
Denne anbefaling har imidlertid sine begrænsninger, fordi de nuværende tromboemboliske slagtilfælde modeller (eksogen emboli levering, MCA-injektion af thrombin, og photothrombosis) har alle visse tekniske 4 ulemper. For det exogene emboli model, intravaskulær infusion af emboli resulterer i signifikant variation i infarkt størrelse og placering, samt uforudsigelige reaktioner på tPA trombolyse grund af forskelle i koagel forberedelse 4,5. Direkte indsprøjtning af thrombin i filialen MCA kræver kraniektomi, og dens anvendelighed til optimering af trombolytisk behandling er endnu ikke bevist 4,6. Kemisk initieret tromboemboli baseret på systemisk injektion af et lysfølsomt farvestof (f.eks Rose Bengal eller erythrosin B) og bestråling gennem den blotlagte kraniet ofte frembringer blodplade-kun aggregater, der ikke reagerer trombolytisk 4,7. Tilsammen er der behov for mere enkle og tPA-responsive tromboemboliske modeller til præklinisk slagtilfælde forskning.
Den THI paradigme har fire unikke fordele som en tromboembolisk slagtilfælde model. For det første THI fornærmelse svingedeendogene komponenter til dannelse in situ tromber uden hjælp af exogene kemikalier eller foruddannede emboli. Således thrombedannelse i THI model er mere relevant for fysiologiske betingelser. For det andet reagerer gunstigt for hurtig tPA-behandling af THI-modellen (ved 0,5 og 1 time efter skaden), men ikke til forsinket behandling (ved 4 timer). Denne terapeutiske vindue svarer til dem, der observeres hos patienter med slagtilfælde. Således kan THI model anvendes til forskning med henblik på at forbedre reperfusionsbehandling i akut iskæmisk slagtilfælde. Tredje, de kirurgiske procedurer i THI-modellen er enkel og ligetil, når man sammenligner med den intraluminale sutur MCA-okklusion model. Varigheden af hypoxia i THI model er også styrbar. Disse egenskaber gør THI model mindre modtagelige for proceduremæssige forskelle mellem forskellige laboratorier. Endelig kan THI model kaste indsigt i mekanismerne i ufuldstændig reperfusion på trods rekanalisering af store arterier efter trombolyse, hvilket eren unik udfordring ved slagtilfælde terapi sammenlignet med hjerteiskæmi 1,22. Derfor er THI modellen giver et unikt system til at studere mekanismerne i den cerebrale vaskulære seng-specifikke dysregulering af hæmostase 23.
Alle eksperimentelle hjerneskade modeller har begrænsninger, og THI model er ingen undtagelse. Tre store tekniske begrænsninger i THI slagtilfælde model er blevet identificeret i eksperimentet. Første, i modsætning til andre slagtilfælde modeller, hvor fornærmelsen er begrænset til hjernen, kombinationen af hypoxi og carotis okklusion fører til perifer vasodilation og en større efterspørgsel efter minutvolumen 12. Således når man sammenligner effekten af musen mutationer eller neurobeskyttende midler mod THI fornærmelse, deres indvirkning på det kardiovaskulære funktioner skal også nøje sammenlignes. Sekund, fandt vi, at forskellige mus indavlede stammer har variable reaktioner på THI model, som kan skyldes ujævn åbenheden af den posteriore communicating arterie 24, uens hjertefunktion eller en kombination af begge. Det derfor anbefales, at køn, alder, legemsvægt, og musestammer mellem to forsøgsgrupper være sammenlignelige i neuroprotektion studier. Endelig THI slagtilfælde afhængig dyr at ånde i hypoksisk gas under en let bedøvet tilstand. Virkningerne af anæstesi på slagtilfælde resultater skal minimeres og holdes konsistent mellem dyr. Ikke desto mindre, så længe forskerne er årvågne af disse tekniske detaljer og reducere variablerne fra dyr til dyr, den THI slagtilfælde model kan hurtigt etableret til at give høj konsistens af hjernens infarkt.
Sammenfattende THI er en enkel og standardiseret slagtilfælde model, der reagerer positivt på den virkelige verden terapi (tPA trombolyse) i en klinisk relevant tidsmæssig vindue. Denne nye model er en værdifuld tilføjelse til præklinisk slagtilfælde forskning, og kan bidrage til at forbedre trombolyse behandling i akut iskæmiskslagtilfælde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10-13 weeks old (22-30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-brain imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 | |
| Meloxicam SR | ZooPharm | NSAID analgesia |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
