Abstract
وقد عانى البحوث السكتة الدماغية العديد من النكسات في ترجمة العلاجات اعصاب في الممارسة السريرية. في المقابل، فإن العلاج في العالم الحقيقي (TPA الجلطات) نادرا ما تنتج فوائد في النماذج التجريبية الميكانيكية المستندة إلى انسداد، التي تهيمن على أبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية. هذا الانقسام بين مقاعد البدلاء، والسرير يوحي الحاجة إلى استخدام نماذج سكتة متجاوبة في مجال البحوث السكتة الدماغية قبل السريرية. تحقيقا لهذه الغاية، واخترع نموذجا السكتة الدماغية الخثاري بسيطة وسكتة التفاعلي وصفها هنا. ويتكون هذا النموذج من انسداد عابرة من جانب واحد مشترك الشريان السباتي والتسليم من 7.5٪ من الأكسجين من خلال القناع عن وجهه في فئران بالغة لمدة 30 دقيقة، مع الحفاظ على درجة حرارة الجسم في الحيوان 37.5 ± 0.5 ° C. على الرغم من أن ربط عكسها من الشريان السباتي من جانب واحد أو نقص الأكسجة قمعت كل تدفق الدم إلى المخ عابر فقط، والجمع بين كل من الشتائم تسبب العجز ضخه، الفيبرين وترسب الصفائح الدموية، وinfar كبير دائمط م في الأراضي التي يتم توفيرها من الشريان الدماغي المتوسطة. الأهم من ذلك، قدمت حقن المؤتلف سكتة عند 0.5، 1، أو 4 ساعات بعد ثي (10 ملغ / كلغ) الوريد ذيل الحد تعتمد على الوقت من معدل الوفيات واحتشاء الحجم. هذا النموذج السكتة الدماغية الجديد هو بسيط، ويمكن أن تكون موحدة في جميع أنحاء مختبرات لمقارنة النتائج التجريبية. وعلاوة على ذلك، فإنه يدفع الجلطة دون قطع القحف أو إدخال الصمات شكلت مسبقا. ونظرا لهذه المزايا الفريدة، ونموذج ثي هو إضافة مفيدة إلى مرجع للبحوث السكتة الدماغية قبل السريرية.
Introduction
الجلطات وإعادة الاستقناء هي العلاج الأكثر فعالية من السكتة الدماغية الحادة في الممارسة السريرية 1. بعد، تم تنفيذ معظم الأبحاث العصبية قبل السريرية في نموذج عابر ميكانيكي عرقلة (داخل اللمعة خياطة المتوسطة انسداد الشريان الدماغي) التي تنتج التعافي السريع من تدفق الدم إلى المخ على إزالة انسداد الأوعية الدموية ويظهر قليل من دون فوائد قبل سكتة الجلطات. وقد أشير إلى أن اختيار مشكوك فيها من نماذج السكتة الدماغية ساهم، جزئيا على الأقل، إلى صعوبة في ترجمة علاج الأعصاب لمرضى 2،3. وبالتالي، هناك دعوة متزايدة لتوظيف نماذج الانسداد التجلطي السكتة الدماغية سكتة متجاوبة في مجال البحوث قبل السريرية، ولكن لديها مثل هذه النماذج أيضا المشاكل التقنية (انظر مناقشة) 4-7. نحن هنا وصف نموذجا السكتة الدماغية الجلطات جديد يقوم على جانب واحد عابرة التأكسج الدماغية (ثي) إهانة وردودها على العلاج عن طريق الحقن الوريدي سكتة 8.
تم تطوير نموذج السكتة الدماغية ثي على أساس الإجراء ليفين (ربط دائم من جانب واحد الشريان السباتي المشترك يليه التعرض لنقص الأكسجين عابرة في غرفة) التي اخترعت لإجراء التجارب مع الفئران الكبار في عام 1960 9. تلاشى الإجراء ليفين الأصلي إلى الغموض ل انها تنتج سوى تلف في الدماغ متغير، ولكن تسبب نفس إهانة الأعصاب ثابت في الجراء القوارض عندما أعيد تطبيقها من قبل روبرت Vannucci وزملاؤه نموذجا من الأطفال حديثي الولادة بنقص التأكسج اعتلال الدماغ الإقفاري (عجل) في عام 1981 (10). وفي السنوات الأخيرة، بعض المحققون أعادت تكييف نموذج ليفين-Vannucci لفئران بالغة عن طريق ضبط درجة الحرارة في غرفة ميتة 11. فمن المعقول أن آفات الدماغ غير متناسقة في الإجراء ليفين الأصلي قد تنشأ من تذبذب درجة حرارة الجسم من القوارض الكبار في غرفة ميتة. لاختبار هذه الفرضية، ونحن تعديل الإجراء ليفين بالإدارة الغاز ميتةمن خلال قناع، مع الحفاظ على درجة الحرارة الأساسية القوارض في 37 ° C على طاولة الجراحة 12. كما هو متوقع، والتحكم في درجة حرارة الجسم صرامة زيادة كبيرة في استنساخ مرحبا الناجم عن أمراض الدماغ. الإهانة مرحبا أيضا يؤدي تجلط الدم، الالتهام الذاتي، وgray- وإصابة 13 بيضاء المسألة. وقد استخدم باحثون آخرون أيضا نموذج مرحبا للتحقيق في ما بعد السكتة الدماغية الاستجابات الالتهابية 14.
ومن المزايا الفريدة لنموذج مرحبا السكتة الدماغية هي أنها تتابع عن كثب ثالوث فيرشو لتشكيل خثرة، بما في ذلك ركود تدفق الدم، والإصابة البطانية (على سبيل المثال بسبب الإجهاد التأكسدي مرحبا يسببها)، وفرط التجلط (تنشيط صفائح الدم مرحبا يسببها) ( الشكل 1A) 15. على هذا النحو، فإن النموذج مرحبا قد قبض على بعض الآليات الفيزيولوجية المرضية ذات الصلة السكتة الدماغية في العالم الحقيقي. مع هذه الفكرة في الاعتبار، ونحن المكرر كذلك نموذج مرحبا مع ربط عكسها للأمم المتحدةilateral الشريان السباتي المشترك (وبالتالي لخلق مرحبا إهانة عابرة)، واختبار ردودها على سكتة الجلطات مع أو بدون Edaravone. Edaravone هو زبال الجذور الحرة وافقت بالفعل في اليابان لعلاج السكتة الدماغية في غضون 24 ساعة من بداية 9. وأظهرت تجاربنا أن مختصرة قدر 30 دقيقة عابرة مرحبا يطلق احتشاء الخثاري، والتي تجمع بين العلاج سكتة-Edaravone تمنح فوائد التآزر 8. نحن هنا وصف العمليات الجراحية مفصلة والاعتبارات المنهجية للنموذج ثي، والتي يمكن استخدامها لتحسين العلاجات ضخه من السكتة الدماغية الحادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة إيموري ويتبع المعاهد الوطنية للصحة المبدأ التوجيهي للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. إعداد
- إعداد السرير الجراحي على لوحة ظاهرة الاحتباس اتصال مع مضخة الحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الجراحة. وضع لفة الرقبة باستخدام برميل من 3 مل حقنة على السرير الجراحي. تحضير غاز التخدير مع 2٪ الأيزوفلورين في الهواء الطبي.
- إعداد ملقط تعقيمها، مقص، وأصحاب الإبرة الصغيرة، مرقئ، ومسحات القطن والخيوط الجراحية. إعداد الغراء الأنسجة ومرهم للعين.
- إعداد نظام نقص الأكسجة وتحكم في درجة الحرارة مع مصباح التدفئة والتحقيق المستقيم. يعد الغاز نقص الأكسجة مع 2٪ الأيزوفلورين في 7.5٪ O 2 متوازنة من 92.5٪ N 2.
- ساعة واحدة قبل الجراحة، وanalgesized الفئران عن طريق الحقن تحت الجلد من بطء الإفراج ميلوكسيكام (4.0 ملغ / كلغ).
- تخدير C57BL الذكور 10-13 أسبوع من العمر / 6 الفئران وزنها 22-30 غ في تحريض غرفة التخدير مع 3٪ الأيزوفلورين حتى الحيوان لا يستجيب لضغط القدم، ثم قم بإزالة الشعر على حق الرقبة باستخدام ماكينة حلاقة الإلكترونية.
- وضع الفئران على السرير الجراحي على اتصال مع 2٪ الأيزوفلورين في الهواء الطبي في معدل تدفق 2 لتر / دقيقة. امتدت الأمامية آمنة على طول لفة الرقبة على الجانبين باستخدام شريط الطبي.
- تنظيف الموقع الجراحي لشق مع betadine تليها الكحول ثم مسحات القطن.
- تحت المجهر تشريح، وجعل شق 0.5 سم بزر الماوس الأيمن عنق الرحم باستخدام ملقط على التوالي، والمقص الصغير حوالي 0.2 سم الوحشي من الجلد خط الوسط.
- استخدام زوج من ملقط مسنن غرامة لمزق اللفافة والأنسجة لفضح الصحيح الشريان السباتي المشترك (RCCA). فصل بعناية RCCA من العصب المبهم باستخدام زوج من الملقط السلس الجميلة.
- يعيش عقدة اثنين قبل القطع 5-0 خياطة الحرير (نشره) على RCCA، ومن ثم خياطة الجلد باستخدام 4-0 النايلون حيدة خياطة (الشكل 1C).
- تطبيق مرهم العين في كلتا العينين لمنع جفاف.
- نقل بسرعة الفئران لنظام نقص الأكسجة ووضع الأنف والفم وجها قناع مع 2٪ الأيزوفلورين في 7.5٪ O 2 في معدل تدفق 0.5-1 لتر / دقيقة لمدة 30 دقيقة.
- خلال نقص الأكسجة، استخدم تحكم في درجة الحرارة مع مصابيح التدفئة للسيطرة على درجة حرارة الجسم 37.5 ± 0.5 ° C. رصد معدل التنفس في 80-120 الأنفاس / دقيقة. الحفاظ على درجة حرارة الجسم فوق 37 درجة مئوية خلال نقص الأكسجين مهم لخلق احتشاء الدماغ ثابت. انخفاض معدل التنفس يحدث عادة بعد 20 دقيقة نقص الأكسجة. إزالة جها قناع والسماح العرض الجوي العادي في حالة انخفاض معدل التنفس أدناه إلى 40. وهذا يأخذ 1-2 دقيقة ولا يعول في 30 دقيقة مدة نقص الأكسجة.
- بعد نقص الأكسجين، ونقلالفئران إلى سرير العمليات الجراحية والافراج عن اثنين من الغرز RCCA. إغلاق الجرح باستخدام الغراء الأنسجة، ومن ثم العودة الفئران إلى القفص. استبعاد الحيوانات إذا تم الإفراج عن كل من هما عقدة الحية بشكل غير متوقع بعد نقص الأكسجين.
- مراقبة الفئران لمدة 5-10 دقيقة للتعافي من نقص الأكسجين والتخدير. وضع الغذاء المبللة في القفص وإعادته إلى مرفق للرعاية الحيوان.
ملاحظة: ترتبط الحيوانات تظهر خفيفة الى سلوك شديد تحلق في 24 ساعة بعد ثي مع مخالفة الدماغ. معظم الحيوانات مع أعراض النوبة يموتون قبل timepoint 24 ساعة بعد ثي.
3. الليزر الرقطة التباين التصوير
ملاحظة: على الرغم من أن هذا ليس إجراء أساسيا من نموذج ثي، لطخة ليزر نظام التصوير النقيض ثنائي الأبعاد 16 يمكن أن تستخدم لوصف التغيرات في تدفق الدم الدماغي (البرازيلي) أثناء أو بعد عابرة نقص الأكسجة نقص التروية. لتوثيق التعديلات من الاتحاد البرازيلي تحت ثي، سجل فورا بعد الحاديالجيش الشعبي 2.6. بدلا من ذلك، لمقارنة الانتعاش البرازيلي بعد ثي إهانة، لا يمكن أن يؤديها هذه الإجراءات التالية الخطوة 2.10.
- وضع الماوس تخدير في وضعية الانبطاح وتنفيذ شق خط الوسط 1 سم طويل على فروة الرأس مع الجمجمة المكشوفة ولكن دون فتحها.
- رصد الاتحاد البرازيلي في كل من نصفي الكرة المخية تحت تصوير تدفق الدم وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وبدء تسجيل تدفق الدم إلى المخ مباشرة بعد عملية جراحية CCAO (الخطوة 2.6). يستمر لمدة 50 دقيقة.
- عرض الاتحاد البرازيلي صورة مع وحدات التعسفي في لوحة 16 لون وتحليل في الوقت الحقيقي في مناطق مختارة باستخدام برنامج MoorFLPI باتباع إرشادات الشركة المصنعة (الشكل 2).
- بعد تسجيل الصورة البرازيلي، إغلاق فروة الرأس مع الغراء الأنسجة ويعود الحيوان إلى القفص.
إدارة 4. سكتة
- حقن الحيوانات في الوريد الذيل مع المذيب أو 10 مغ / كغ المؤتلف سكتة (220-300 &# 956؛ ل 1 ملغ / م TPA) في 0.5، 1، أو 4 ساعات بعد tCCAo بالإضافة إلى نقص الأكسجة (الشكل 4).
5. تلف في الدماغ كشفها مع عدة خيارات مختلفة
ملاحظة: لجمع عينات من الدماغ، الموت ببطء الفئران في 1 أو 4 أو 24 ساعة بعد ثي.
- أداء الكمي لحجم احتشاء قبل في الجسم الحي 2،3،5-Triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) طريقة في 24 ساعة بعد ثي إهانة كما هو موضح السابق 17
- البريتونى حقن الحيوانات مع 1.4 M حل مانيتول (~ 0.1 مل / غرام من وزن الجسم) 30 دقيقة قبل نضح transcardial. الفئران يروي Transcardial مع PBS تليها 10 مل من 2٪ TTC.
- إزالة الدماغ من الحيوانات مع الأدوات الجراحية بعد 10 دقيقة والمكان الى 4٪ امتصاص العرق لتثبيت ليلة وضحاها والقسم إلى 1 مم مع vibratome.
- التقاط سلسلة من أربع شرائح الدماغ مقطوع بواسطة المجهر الرقمي وضليع في الرياضياتify حجم احتشاء كنسبة من منطقة محتشية (المنطقة البيضاء في الجانب الأيمن) لمنطقة التالفة، نصف الكرة الأرضية المقابل باستخدام برنامج يماغيج.
- بدلا من ذلك، نفذ تشكيل الجلطة المناعي في 1 ساعة بعد ثي الإهانة.
- تجميد الدماغ ثابتة في مجمع أكتوبر وقسم العقول في 12 ميكرومتر سمك باستخدام ناظم البرد.
- احتضان شريحة الدماغ مع أرنب الأجسام المضادة لمكافحة الفيبرينوجين (1: 100) التالية الماعز المضادة للأرنب اليكسا Fluro 488 صبغ (1: 200) لمراقبة مضان على المجهر الفلورسنت.
- بدلا من ذلك، نفذ السفينة عرقلة من قبل الذيل الوريد حقن 100 ميكرولتر 2٪ ايفانز صبغة زرقاء في 4 ساعات بعد ثي الإهانة.
- الموت ببطء الفئران وسرعان ما قطع رأسه لإزالة العقول إلى 4٪ امتصاص العرق بعد حقن ايفانز الأزرق. ملاحظة: يستغرق 5-10 دقيقة عن ايفانز تداول الأزرق مع اللون الأزرق من كلا fore- وهند أطرافه.
- Sectiعلى العقول ثابتة عند 100 سمك ميكرون باستخدام مشراح انزلاق ومراقبة مضان باستخدام فلتر انبعاث 680 نانومتر على المجهر الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام ثنائي الأبعاد التصوير رقطة الليزر المقابل (LSCI) 16 لمقارنة التغيرات في تدفق الدم الدماغي (البرازيلي) من خلال 30 دقيقة عابرة انسداد الشريان السباتي من جانب واحد (tCCAO)، والتعرض 30 دقيقة لنقص الأكسجة (7.5٪ أكسجين)، و 30 دقيقة من جانب واحد السباتي ربط ظل نقص الأكسجة (ثي). وكشفت هذه التجربة التي tCCAO تحت normoxia قمعها الاتحاد البرازيلي على الشريان السباتي ligated نصف الكرة إلى ~ 50٪ من قيمة خط الأساس، الذي تعافى بسرعة إلى فوق 85٪ بعد الافراج عن انسداد الشريان السباتي (R في الشكل 2A). التعرض لنقص الأكسجة النظامية وحدها قلل البرازيلي إلى ما يقرب من 75٪ من القيمة الأساسية، التي تنتعش بشكل عابر إلى ~ 130٪ بعد عودته إلى الغلاف الجوي normoxic (الشكل 2B). في المقابل ربط الشريان السباتي في ظل نقص الأكسجة (ثي) انخفاض بسرعة البرازيلي في نصف الكرة المماثل إلى أقل من 20٪ من قيمة خط الأساس حوالي 10 دقيقة، والتي نادرا ما انتعشت لتتجاوز 30٪ في 20 دقيقة بعد الإفراج عن ligatio السباتين والعودة إلى normoxia. الاتحاد البرازيلي على نصف الكرة الأرضية المقابل (L)، ومع ذلك، يتقلب بين 20 و 50٪ خلال نقص الأكسجة، وسرعان ما عاد إلى فوق 80٪ بعد إهانة ثي (الشكل 2C).
في 24 ساعة بعد tCCAo (30 دقيقة) أو tCCAO بالإضافة إلى 30 دقيقة نقص الأكسجة (ثي)، وكان يستخدم في الجسم الحي TTC وصمة عار للكشف عن احتشاء 17. وأظهر هذا التحليل أي إصابة واضحة من قبل إهانة tCCAO، ولكن احتشاء لا بأس به في الأراضي التي يتم توفيرها من الشريان الدماغي الأوسط بعد ثي إهانة (الشكل 3A). مكافحة الفيبرين (ogen) تم استخدام المناعية لمقارنة أدمغة tCCAO- وذي جرح-في 1 ساعة الانتعاش وأظهر ترسب على نطاق واسع من الفيبرين (ogen)، وهو مؤشر على تخثر الدم، في ثي الجرحى، ولكن لا الماوس tCCAO-الطعن العقول (الشكل 3B، C). تم استخدام حقن الذيل الوريد صبغة زرقاء ايفانز أيضا للمقارنة نضح الأوعية الدموية من العقول tCCAO- وذي جرح-في 4 ساعات الانتعاش. وأظهر هذا التحليل يقللإد التروية الدماغية والتسرب الشديد من صبغة زرقاء ايفانز في ذي الجرحى، ولكن ليس أدمغة فئران tCCAO تحدى (الشكل 3D، E).
وأخيرا، فإن نتائج ثي إهانة في الفئران تلقي حقن الوريد ذيل السيارة (عند 0.5 ساعة الإنعاش) أو الإنسان المؤتلف سكتة (Activase، 10 مغ / كغ، عند 0.5، 1، أو 4 ساعات بعد ثي) وتمت مقارنة استخدام في فيفو وصمة عار TTC في 24 ساعة الانتعاش (الشكل 4A). في الفئران المعالجة السيارة، كان معدل وفيات في 24 ساعة بعد ثي 23.8٪، وكان واحدا فقط في 21 ذي الفئران المصابين، إلى أعلى من المتوسط و 2 SD (والخارجة). انخفض معدل وفيات 24 ساعة في الفئران تلقي العلاج سكتة في الانتعاش 0.5 ساعة إلى 8.3٪، ولكن قد فقدت هذا التأثير عندما تدار سكتة في 1 أو 4 ساعات بعد إهانة ثي (الشكل 4B). الشكل 4C تآمر حجم احتشاء جميع نجا الفئران في مجموعات العلاج الأربعة. من المذكرة، على حد سواء 0.5 و 1 ساعة سكتة-إدارة الصورةانخفاض ignificantly حجم احتشاء، بالمقارنة مع العلاج السيارة. كما أظهرت مجموعة سكتة المعالجة 0.5 ساعة حجم احتشاء انخفاضا كبيرا من المجموعة سكتة المعالجة 4 ساعة. أظهر الشكل 4D تمثيلية النتائج TTC وصمة عار بعد كل معاملة.
وتشمل إجراءات عابرة الدماغي نقص الأكسجة نقص التروية (ثي) إهانة في الفئران البالغة (A) ثالوث فيرشو أن يدفع تخثر ركود تدفق الدم، والإصابة البطانية، وفرط التجلط في الدم: الرقم 1. (B) رسم تخطيطي لإجراء السكتة الدماغية ثي. كانوا مرتبطين هما عقدة نشره على الحق العام الشريان السباتي (CCA)، وتليها تسليم 7.5٪ أكسجين عبر مخروط الأنف لمدة 30 دقيقة، في حين تم الإبقاء على الماوس درجة حرارة الجسم في 37-38 درجة مئوية. بعد العابرةنقص الأكسجة النظامية ient، تم الإفراج عن ربط التقييم القطري المشترك من خلال الانسحاب واحدة من نهاية عقدة خياطة نشره. MCA، الشريان الدماغي الأوسط. ICA، الشريان السباتي الداخلي. اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، الشريان السباتي الخارجي؛ CCA، الشريان السباتي المشترك. (C) العمليات الجراحية لحق عابر CCA انسداد. وضعت 1. اثنان قبل القطع خياطة (رقم 1 ورقم 2) تحت CAA الصحيح معزولة. وقدمت 2. اثنين من عقدة نشره. 3. تم إغلاق خط شق من قبل خياطة # 3. تأكد من أن طرفي الخيط رقم 1 ورقم 2 وكانت ودود خارج خط الشق. 4. سحب بعناية خياطة رقم 1 ورقم 2 من الخارج للافراج عن CCA. عندما يقوم بلطف، وهذا الإجراء لا يسبب تمزق التقييم القطري المشترك.
الشكل 2: تحليل الدماغية التعديلات تدفق الدم خلال وبعد ثي إهانة A ثنائي الأبعاد ليزر التصوير البقع المقابل (LSوقد استخدم CI) نظام لتقييم تدفق الدم إلى المخ (البرازيلي). R (يمين) يدل على نصف الكرة الأرضية ligated الشريان السباتي. L (يسار) هو نصف الكرة الأرضية المقابل. (A) tCCAO تحت normoxia قمعها الاتحاد البرازيلي ل~ 50٪ من قيمة خط الأساس على-ligated الشريان السباتي نصف الكرة الأرضية (R) لمدة 30 دقيقة على الأقل، والتي انتعشت لتتجاوز 85٪ في غضون 3 دقائق على الافراج عن ربط الشريان السباتي. (B) في نقص الأكسجة (7.5٪ أكسجين و 30 دقيقة) دون ربط الشريان السباتي، انخفضت البرازيلي إلى 76٪ من قيمة خط الأساس وانتعشت بشكل عابر إلى حوالي 130٪ بعد عودته إلى normoxia. (C) في عابرة السباتي ربط ظل نقص الأكسجة (ثي، 30 دقيقة)، والبرازيلي على (R) نصف الكرة الأرضية ligated الشريان السباتي انخفضت بسرعة إلى أقل من 20٪ من قيمة خط الأساس، ونادرا ما انتعشت لتتجاوز 30٪ عند الافراج عن السباتي ربط والعودة إلى normoxia. في المقابل، البرازيلي على المقابل (L) نصف الكرة يتقلب بين 20-50٪ خلال نقص الأكسجة، وسرعان ما عاد إلى> 80٪ من خط الأساسالقيمة بعد الإفراج عن السباتي ربط والعودة إلى normoxia. أظهرت هي اقتفاء أثر البرازيلي تمثيلية للن> 4 في كل مجموعة. تميزت نقاط الوقت للصور الفوتوغرافية LSCI التمثيلية من خلال خطوط رمادية في البحث عن المفقودين تمثيلي.
الرقم 3: احتشاء الدماغ والجلطة عفوية والأوعية عرقلة بعد إهانة ثي (A) في الجسم الحي TTC وصمة عار لم تظهر أي احتشاء مرئية في 24 ساعة بعد 30 دقيقة ربط عابر الصحيح الشريان السباتي المشترك الشرايين (tCCAO)، ولكن إضافة. 30 دقيقة نقص الأكسجة (الأكسجين 7.5٪) لtCCAO تنتج احتشاء كبير في نصف الكرة المماثل (النجمة)، ومعظمها في منطقة توريد الشريان المخي المتوسط. (B، C) المضادة للالفيبرين (ogen) المناعية في 1 ساعة بعد إهانة ثي شهدت ودائع واسعة النطاق فينصف الكرة المماثل. في المقابل، لم يكن هناك الفيبرين (ogen) الودائع في 1 ساعة بعد tCCAo (30 دقيقة) إهانة (ن> 4 لكل منهما). (D، E) تم تقييم التروية الدماغية عن طريق الحقن الوريد ذيل ايفانز الأزرق صبغ في 4 ساعات بعد tCCAO (30 دقيقة) أو ثي (30 دقيقة) إهانة. في مرحلة ما بعد tCCAO الدماغ، ايفانز الأزرق صبغ شغل في معظم الأوعية الدموية في نصف الكرة المماثل. في المقابل، في مرحلة ما بعد ثي الدماغ، ايفان الأزرق صبغ شغل في الأوعية الدموية أقل وتسربت إلى لحمة (ن> 3). شريط مقياس: 250 ميكرون.
الرقم 4: آثار سكتة الجلطات في نموذج السكتة الدماغية ثي (A) لمحة عامة عن تجارب لمقارنة آثار الادارة سكتة عن طريق الوريد (10 ملغ / كلغ) في 0.5، 1، أو 4 ساعات بعد إهانة ثي. (B) ملخص عدد الحيوانات تشغيلها، موrtality في 24 ساعة بعد الشتائم والقيم المتطرفة (حجم احتشاء خارج الوسط +/- 2 SD)، وعدد من الحيوانات تضمن للمقارنة بين حجم احتشاء. (C) الكمي أظهر متوسط 32٪ حجم احتشاء في مجموعة المركبات والحد بدرجة كبيرة من احتشاء في 0.5 ساعة (16٪) و 1 ساعة (إلى 20٪) مجموعة (كما هو موضح هي المتوسط وSEM لكل مجموعة). يتم تحديد قيم p بواسطة اختبار (ت). (D) الممثل TTC الملطخة الدماغ من الحيوانات التي تم الطعن بها إهانة ذي وتلقى العلاج سكتة في الوقت المشار نقطة بعد الاصابة. في تلطيخ TTC، أظهرت الأنسجة الحية اللون الأحمر. وكانت الأنسجة احتشاء شاحب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
السكتة الدماغية هي مسألة صحية رئيسية من تزايد أهمية لأي مجتمع مع شيخوخة السكان. على الصعيد العالمي، والسكتة الدماغية هي ثاني سبب رئيسي للوفاة ما يقدر ب 5.9 مليون الأحداث القاتلة في عام 2010، أي ما يعادل 11.1٪ من مجموع الوفيات 18. السكتة الدماغية هي أيضا السبب الرئيسي الثالث للالمصححة باحتساب مدد العجز سنوات العمر (سنوات العمر) خسر على الصعيد العالمي في عام 2010، حيث ارتفعت من المركز الخامس في عام 1990 (19). وهذه البيانات الوبائية تبرز الحاجة إلى علاجات أكثر فعالية الحادة (الدماغية) السكتة الدماغية. ومع ذلك، على الرغم من البحث المكثف في علاج اعصاب قبل السريرية، تبقى سكتة-الجلطات وعلاج محدد فقط من السكتة الدماغية الحادة التي تتم الموافقة عليها من قبل إدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة، في حين فشل العديد من وكلاء اعصاب مرة واحدة واعدة في الدراسات على الحيوانات في التجارب السريرية. صعوبة في ترجمة العلاجات اعصاب إلى المرضى لديها العديد من العوامل، والتركيز في الوقت الحالي على الممارسين مختبر جيدم، والتحليل التلوي من مجموعات البيانات متعددة، والتعاون الدولي لتحسين البحوث السكتة الدماغية قبل السريرية 20،21. ومع ذلك، هناك رأي أقلية مما يدل على أن صعوبة متعدية هي نتيجة لسوء اختيار الميكانيكية نماذج انسداد الأوعية الدموية (على سبيل المثال داخل اللمعة خياطة MCA انسداد) في غالبية البحوث السكتة الدماغية قبل السريرية حتى الآن 2،3. لأن نماذج انسداد الأوعية الدموية الميكانيكية نادرا ما تحفز تجلط الدم وضخه الدماغي يحدث بسرعة كبيرة على الافراج عن انسداد الميكانيكية، وهذه النماذج لا يستجيب إلى العلاج كلمة حقيقية (سكتة انحلال الفيبرين) ولا توفر نافذة علاجية ضيقة كما هو الحال في مرضى السكتة الدماغية. ونتيجة لذلك، فإن العلاج المقترح هو التأكيد، على الأقل تشمل نماذج الانسداد التجلطي السكتة الدماغية السكتة الدماغية في مجال البحوث قبل السريرية 3.
هذه التوصية، ومع ذلك، فقد القيود التي فرضها النظام لنماذج السكتة الدماغية الانصمام الخثاري الحالية (خارجي تسليم الصمات، MCA-حقن رhrombin، وphotothrombosis) جميعا بعض العوائق الفنية 4. لنموذج الصمات خارجي، التسريب الوريدي النتائج الصمات في التباين الكبير في حجم احتشاء، والمكان، وكذلك استجابات غير متوقعة لسكتة الجلطات بسبب الاختلافات في إعداد جلطة 4،5. الحقن المباشر للالثرومبين في فرع MCA يتطلب قطع القحف، وفائدته لتحقيق الاستفادة المثلى من العلاج التخثر هي بعد أن ثبت 4،6. بدأت كيميائيا الجلطات الدموية القائمة على إدخال نظام لصبغ حساس (على سبيل المثال روز البنغال أو erythrosine B) والتشعيع من خلال الجمجمة تتعرض غالبا ما تنتج المجاميع الصفائح الدموية الوحيدة التي لا تستجيب للالجلطات 4،7. مجتمعة، هناك حاجة إلى نماذج الانصمام الخثاري أبسط وسكتة المستجيبة للبحوث السكتة الدماغية قبل السريرية.
النموذج ذي أربع مزايا فريدة كنموذج الانسداد التجلطي السكتة الدماغية. أولا، تمارس الإهانة ثيالمكونات الداخلية لتشكيل خثرات في الموقع دون مساعدة من المواد الكيميائية الخارجية أو الصمات شكلت مسبقا. وبالتالي، تشكيل خثرة في نموذج ثي هو أكثر ملاءمة لظروف الفيزيولوجية. ثانيا، نموذج ذي يستجيب مواتية لالسريعة سكتة المعالجة (عند 0.5 و 1 ساعة بعد الإصابة) ولكن ليس إلى تأخر العلاج (في 4 ساعات). هذه النافذة العلاجية مشابه لتلك التي لوحظت في مرضى السكتة الدماغية. وبالتالي، يمكن أن تستخدم نموذج ثي عن البحوث التي تهدف إلى تحسين العلاج ضخه في السكتة الدماغية الحادة. ثالثا، العمليات الجراحية في نموذج ثي هي بسيطة ومباشرة، بالمقارنة مع خياطة MCA نموذج انسداد داخل اللمعة. مدة نقص الأكسجين في نموذج ثي هي أيضا يمكن السيطرة عليها. هذه الصفات تجعل نموذج ثي أقل عرضة للتغيرات إجرائية بين المختبرات المختلفة. وأخيرا، فإن النموذج ثي قد تسلط الضوء على آليات ضخه غير مكتمل على الرغم من إعادة الاستقناء الشرايين الكبيرة بعد الجلطات، وهوتحديا فريدا من نوعه في علاج السكتة الدماغية بالمقارنة مع نقص التروية القلبية 1،22. وبالتالي، يوفر نموذج ذي نظاما فريدا لدراسة آليات الأوعية الدموية ديسريغولاتيون السرير محددة الدماغي من الارقاء 23.
جميع النماذج التجريبية إصابات الدماغ لها حدود، ونموذج ثي ليست استثناء. وقد تم تحديد ثلاثة القيود التقنية الرئيسية لنموذج السكتة الدماغية ثي في التجربة. أولا، على عكس النماذج السكتة الدماغية الأخرى حيث هو إهانة تقتصر على الدماغ، ومزيج من نقص الأكسجين والشريان السباتي يؤدي إلى انسداد توسع الأوعية المحيطية وزيادة الطلب على النتاج القلبي 12. وهكذا، عند المقارنة بين آثار الطفرات الماوس أو وكلاء اعصاب ضد إهانة ثي، تأثيراتها على وظائف القلب والأوعية الدموية كما يجب مقارنة بعناية. ثانيا، وجدنا أن سلالات الفئران الفطرية المختلفة لها ردود المتغيرة للنموذج ثي، الذي قد يكون راجعا إلى المباح متفاوتة من COMMUN الخلفيicating الشريان 24، وظائف القلب متباينة، أو مزيج من الاثنين معا. وبالتالي، فمن المستحسن أن الجنس والعمر ووزن الجسم، والماوس سلالات بين مجموعتين تجريبيتين تكون قابلة للمقارنة في الدراسات العصبية. أخيرا، تعتمد السكتة الدماغية ثي على الحيوانات على التنفس في الغاز ميتة تحت شرط تخدير طفيفة. آثار التخدير على النتائج السكتة الدماغية بحاجة إلى أن يكون الحد الأدنى والاحتفاظ متناسقة بين الحيوانات. ومع ذلك، طالما هم باحثون يقظة من هذه التفاصيل التقنية والحد من المتغيرات من الحيوانات إلى الحيوانات، ونموذج السكتة الدماغية ثي يمكن أن تنشأ بسرعة لتحقق درجة عالية من احتشاء الدماغ.
باختصار، ثي هو نموذج بسيط السكتة الدماغية وموحد يستجيب بشكل إيجابي للعلاج في العالم الحقيقي (TPA الجلطات) في إطار الزمني ذات الصلة سريريا. هذا النموذج الجديد هو إضافة قيمة إلى البحوث قبل السريرية السكتة الدماغية، ويمكن أن يساعد على تحسين علاج الجلطات الدماغية الحادة فيالسكتة الدماغية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10-13 weeks old (22-30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-brain imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 | |
| Meloxicam SR | ZooPharm | NSAID analgesia |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
