Abstract
Ход исследования пережил множество неудач в переводе нейропротекторные терапии в клинической практике. В отличие от реального мира терапия (тромболизис ТАП) редко производит преимущества в механических окклюзии на основе экспериментальных моделей, которые доминируют доклинические исследования хода. Этот раскол между скамейке и кровати предполагает необходимость использования ТАП отзывчивые модели в доклинических исследований инсульта. С этой целью, простой и ТРА-реактивного тромботической модели инсульта изобретен и описано здесь. Эта модель состоит из переходного окклюзии одностороннего общей сонной артерии и доставки 7,5% кислорода через лицевую маску у взрослых мышей в течение 30 мин, при поддержании температуры ректальное животных на 37,5 ± 0,5 ° C. Несмотря на то, обратимо лигирование сонной артерии одностороннего или гипоксии друг подавляется мозговое кровообращение лишь временно, сочетание обоих инсультов вызваны дефицитом прочного реперфузии фибрин и отложение тромбоцитов и большой infarКТ на территории средней мозговой артерии, в комплект поставки. Важно отметить, что в хвостовую вену рекомбинантного ТАП в 0,5, 1 или 4 ч после Тхи (10 мг / кг), при условии, зависящих от времени снижение уровня смертности и инфаркта размера. Эта новая модель хода проста и может быть стандартизированы по лабораториям сравнивать экспериментальные результаты. Кроме того, он вызывает тромбоз без удаление фрагментов костей черепа или введения предварительно сформированный эмболии. Учитывая эти уникальные достоинства, модель Тхи является полезным дополнением к репертуару доклинических исследований инсульта.
Introduction
Тромболизис и реканализация наиболее эффективная терапия острого ишемического инсульта в клинической практике 1. Тем не менее, большинство доклинических исследований нейропротекции была выполнена в переходном механической модели обструкции (внутрипросветного шов окклюзии средней мозговой артерии), который производит быстрое восстановление мозгового кровотока после снятия окклюзии сосудов и показывает практически нет преимущества, ТАП тромболизиса. Было высказано предположение, что сомнительно выбор моделей инсульта способствовало, по крайней мере частично, с трудностью в переводе нейропротекторное терапии для пациентов 2,3. Следовательно, есть увеличение вызов для трудоустройства ТАП отзывчивые модели тромбоэмболических инсульта в доклинических исследований, но такие модели также есть технические проблемы (см Обсуждение) 4-7. Здесь мы опишем новую модель тромбо инсульта на основе одностороннего переходного гипоксически-ишемическая (Тхи) оскорбление и его ответов на внутривенное ТАП терапии 8.
Модель Тхи ход был разработан на основе процедуры Levine (постоянное лигирования одностороннего общей сонной артерии с последующим воздействием на переходном гипоксии в камере), который был изобретен для экспериментов со взрослыми крысами в 1960 году 9. Первоначальная процедура Левин канули в безвестность, потому что это производится только переменную повреждение головного мозга, но то же самое оскорбление вызвало последовательное невропатологии грызунов щенков, когда он был вновь введен Робертом Vannucci и его коллегами в модели новорожденных гипоксически-ишемической энцефалопатии (HIE) в 1981 году 10. В последние годы, некоторые Исследователи повторно адаптированы модели Левина-Vannucci взрослым мышам путем регулирования температуры в гипоксической камере 11. Вполне вероятно, что противоречивые поражения головного мозга в оригинальной методике Левина может возникнуть от колебаний температуры тела взрослых грызунов в гипоксической камере. Чтобы проверить эту гипотезу, мы изменили процедуру Левин путем введения гипоксического газачерез маску, при сохранении внутренней температуры грызунов при 37 ° С на операционном столе 12. Как и ожидалось, контроль температуры тела жесткими значительно увеличилось воспроизводимость HI-индуцированной патологии головного мозга. HI оскорбление также вызывает коагуляцию, аутофагии, и серо и белого вещества травмы 13. Другие исследователи также использовали модель HI, чтобы исследовать после инсульта воспалительные реакции 14.
Уникальной особенностью модели HI инсульта является то, что внимательно следит триаде Вирхова образования тромбов, в том числе застой кровотока, повреждения эндотелия (например, вследствие HI-индуцированного окислительного стресса), и гиперкоагуляции (активации тромбоцитов HI-индуцированной) ( 1А) 15. Таким образом, модель HI может захватить некоторые патофизиологические механизмы, имеющие отношение к реальной ишемического инсульта. С этой идеей в виду, мы далее уточнили модель HI с реверсивным перевязки ООНilateral общей сонной артерии (поэтому, чтобы создать переходный HI оскорбление), и проходят его ответов на ТАП тромболизиса с или без Edaravone. Edaravone является свободных радикалов уже одобрен в Японии для лечения ишемического инсульта в течение 24 часов в начале 9. Наши эксперименты показали, что, как краткое, как 30 мин переходный HI вызывает тромботические миокарда, и что комбинированное лечение ТАП Edaravone дает синергический эффект 8. Здесь мы описываем подробные хирургических процедур и методологические аспекты модели Thi, которые могут быть использованы для оптимизации реперфузии лечения острого ишемического инсульта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол утвержден уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) из Университета Эмори в и следует Национальные институты здравоохранения руководящего по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Настройка
- Подготовка хирургического кровать на площадку потепления, связанного с тепловым насосом при температуре 37 ° С в течение не менее 15 мин до операции. Поместите рулон шеи, используя ствол 3 мл шприц на операционном кровати. Подготовка анестезии газа с 2% изофлуран в медицинской воздуха.
- Подготовка автоклавного щипцы, ножницы, микро иглодержатели, кровоостанавливающего, ватные тампоны и швов. Подготовка ткани клей и глазную мазь.
- Настройте систему гипоксия и температурные контроллеры с отопительной лампы и прямой кишки зондом. Подготовка гипоксия газ с 2% изофлуран в 7,5% O 2 уравновешивается 92,5% N 2.
- За один час до операции мышей analgesized путем подкожной инъекции с медленным высвобождением мелоксикам (4,0 мг / кг).
- Обезболить 10-13 неделя старый мужской C57BL / 6 мышей весом от 22 до 30 г в анестезии индукции камеры с 3% изофлуран пока животное не реагирует на ноги сжать, а затем удалить волосы на правой шеи с помощью электронного бритву.
- Место мышей на хирургическом постели, связанной с 2% изофлуран в медицинской воздухе при скорости потока 2 л / мин. Безопасные передние растягивается вдоль шеи ролл по бокам, используя медицинскую ленту.
- Очистите место операции для разреза с бетадином последующим алкоголя и затем ватным тампоном.
- Под микроскопом рассекает, сделать 0,5 см справа шейки разрез с помощью прямых щипцов и микро ножницы около 0,2 см отвода от средней линии кожи.
- Используйте пару мелких зубчатых щипцов растащить фасции и ткани, чтобы выставить правильный общей сонной артерии (АРУК). Осторожно отделите АРУК от блуждающего нерва с помощью пары тонких гладких щипцов.
- Живая узел два нарезанные 5-0 шелковый шов (разъемную) на АРУК, а затем зашить кожу, используя 4-0 Нейлон мононити шов (рис 1в).
- Применить глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
- Быстро передавать мышей системы гипоксии и поставить нос и рот в лицевую маску с 2% изофлуран в 7,5% O 2 при скорости потока 0,5-1 л / мин в течение 30 мин.
- При гипоксии, использовать регуляторы температуры нагревательными лампами контролировать ректальную температуру в 37,5 ± 0,5 ° C. Монитор дыхания на 80-120 вдохов / мин. Поддержание температуры тела выше 37 ° С в течение гипоксии важно создать последовательную инфаркта головного мозга. Низкая частота дыхания, как правило, происходит после 20 мин гипоксии. Снимите лицевую маску и позволить нормальную подачу воздуха, если частота дыхания падает ниже 40. Это занимает 1-2 минут, а не рассчитывать на длительности 30 мин гипоксии.
- После гипоксии, трансфермышей хирургической кровати и освободить двух швов из АРУК. Закройте рану, используя ткани клей, а затем вернуться мышей в клетку. Исключить животных, если оба из двух живых сучков неожиданно освобожден после гипоксии.
- Монитор мышей в течение 5-10 мин, чтобы оправиться от гипоксии и анестезии. Поместите смоченную еду в клетку и вернуть его ухода за животными.
Примечание: Животные, показывающие легкой до тяжелой поведения по кругу на 24 часов после того, как Тхи коррелируют с мозга нарушения. Большинство животных с симптомами приступов умирают до 24 ч после временной точки Тхи.
3. Лазерная спекл Контрастность изображений
Примечание: Хотя это не является существенным процедура модели Thi, двумерная система 16 контраст изображения лазерного спекл может быть использован для характеристики изменений мозгового кровотока (CBF) во время или после транзиторной ишемии-гипоксии. Чтобы немедленно документировать изменения на CBF под Тхи, запись после улEP 2.6. Кроме того, для сравнения восстановление после CBF Thi инсульта, эти процедуры могут быть выполнены после стадии 2.10.
- Разместить наркозом мышь в положении лежа и выполнить 1 см длиной срединный разрез на коже головы с черепом открытой, но закрытой.
- Монитор МК в обоих полушариях головного мозга под кровотока тепловизора в соответствии с протоколом производителя и начать немедленно записи мозговой кровоток после операции CCAO (шаг 2.6). Продолжить в течение 50 мин.
- Показать CBF изображение с произвольных единицах в 16-цветной палитре и анализировать в режиме реального времени выбранные регионы с помощью программного обеспечения MoorFLPI следуя инструкциям изготовителя (рисунок 2).
- После записи изображения CBF, закрыть головы с тканевой клей и вернуть животное к клетке.
Администрация 4. ТАП
- Вводите животных в хвостовую вену с растворителем или 10 мг / кг рекомбинантного ТАП (220-300 &# 956; л 1 мг / м ТАП) при 0,5, 1 или 4 ч после tCCAo плюс гипоксии (фиг.4).
5. Повреждение мозга обнаружения с несколько различных вариантов
Примечание: Для того, чтобы собрать образцы мозга, усыпить мышей через 1, 4 или 24 ч после Тхи.
- Метод Выполните количественного объема инфаркта по в естественных условиях 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТК) в 24 часов после того, как Тхи оскорбление как предыдущая описано. 17
- Внутрибрюшинно вводят животным с 1,4 М раствора маннита (~ 0,1 мл / г веса тела) за 30 минут до transcardial перфузии. Transcardial заливать мышей с PBS следуют 10 мл 2% ТТС.
- Удалить мозг животных с хирургическими инструментами через 10 мин и поместить в 4% параформальдегида для фиксации ночь и секции в толщиной 1 мм с vibratome.
- Привязать серию из четырех секционных слайдов головного мозга с помощью цифрового микроскопа и квантаримента объем инфаркта как отношение зоны инфаркта (белая область в правой части) в области неповрежденной, контралатерального полушария с помощью программного обеспечения ImageJ.
- Кроме того, выполнять формирование тромбоза с помощью иммунофлуоресценции на 1 ч после Тхи оскорбление.
- Замораживание фиксированный мозг в октябре соединения и секции мозги в 12 мкм толщиной, используя криостат.
- Инкубируйте мозга слайд с кроличьей анти-фибриногена антител (1: 100), следующих козьих антител против кроличьего Alexa Fluro 488 красителя (1: 200) для наблюдения флуоресценции под флуоресцентным микроскопом.
- Кроме того, выполнение закупорке сосуда путем инъекции в хвостовую вену 100 мкл 2% синего красителя Эванса в 4 ч после инсульта Thi.
- Усыпить мышей и быстро вырезать голову, чтобы удалить мозги в 4% параформальдегида после Эванса синего инъекции. Примечание: Это займет 5-10 минут для голубого Эванса обращения с синим цветом и передних и задних конечностей.
- Sectiна фиксированных мозги толщиной 100 мкм с использованием скользящего микротома и наблюдать флуоресценцию с помощью фильтра выбросов по 680 нм на флуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Двумерная лазерной спекл Контрастность изображения (LSCI) 16 был использован для сравнения изменений мозгового кровотока (CBF) на 30 мин переходного одностороннее сонной окклюзии (tCCAO), 30 мин воздействия гипоксии (7,5% кислорода), и 30 мин одностороннее сонных перевязка в условиях гипоксии (Тхи). Этот эксперимент показал, что tCCAO под нормоксии подавляется БФК на сонной лигировали полушария ~ 50% от исходного уровня, который быстро восстанавливаться выше 85% после выпуска сонной окклюзии (R на рис 2А). Воздействие системной гипоксии в одиночку сократил МК примерно 75% от базового значения, которое временно отскок ~ 130%, вернувшись к гипоксическим атмосфере (рис 2B). В отличие сонной перевязки при гипоксии (Thi) быстро пониженном БФК в ипсилатеральной полушарии до менее чем 20% от исходного значения примерно 10 мин, которые редко восстановленного выше 30% при 20 мин после выхода из сонной ligatioп и возвращение к нормоксии. БФК на контралатеральной полушария (L), однако, колебалась от 20 до 50% при гипоксии, и быстро возвращены выше 80% после инсульта Thi (фиг.2с).
Через 24 ч после tCCAo (30 мин) или tCCAO плюс 30 мин гипоксии (Thi), в естественных условиях краситель ТТС был использован для обнаружения миокарда 17. Этот анализ не показал очевидное повреждение по оскорбления tCCAO, но значительную миокарда на территории средней мозговой артерии, поставляемого следующий Тхи оскорбление (рис 3а). Анти-фибрина (оген) иммуноокрашивание был использован для сравнения tCCAO- и Тхи-ранения мозги на 1 час восстановления и показал широкое отложение фибрина (Ogen), индикатор тромбоза, в Тхи ранения, но не tCCAO оспаривается мышь Мозг (Фиг.3В, с). В хвостовую вену Эванса синего красителя используется также для сравнения сосудистой перфузии tCCAO- и Тхи-травмированных мозги на 4 восстановления ч. Этот анализ показал, эффективность понижаетсяред перфузии головного мозга и интенсивный экстравазацию синего красителя Эванса в Тхи ранения, но не tCCAO оспаривается мозги мыши (рис 3D, Е).
Наконец, результаты Thi инсульта у мышей, получавших в хвостовую вену транспортного средства (на 0,5 часа) восстановления или рекомбинантного человеческого ТАП (Activase, 10 мг / кг, в 0,5, 1, или 4 часа после THI) были сравнены с использованием в Vivo пятно TTC на 24 ч восстановления (рис 4а). В обработанных носителем мышах, смертность в 24 ч после Тхи был 23,8%, и только один в 21-Тхи ранения мышей был за средним и 2 SD (аномальное значение). Смертность через 24 часа у мышей, получавших лечение ТАП при восстановлении 0,5 ч упала до 8,3%, но этот эффект был потерян, когда ТАП вводили в 1 или 4 часа после инсульта Thi (фиг.4В). Рисунок 4C графически размер инфаркта всех выжили мышей в четырех группах лечения. Следует отметить, что как 0,5 и 1 ч ТАП администрации сignificantly уменьшается размер инфаркта, когда по сравнению с лечения транспортного средства. Группа ТАП лечение 0,5 ч и показал значительно уменьшенный размер инфаркта, чем 4 ч группе ТАП лечения. Рисунок 4D показал репрезентативные результаты ТТК-пятно после каждой обработки.
Рисунок 1:. Процедура переходного церебральной ишемии-гипоксии (Thi) инсульта у взрослых мышей (А) триады Вирхова, который продвигает тромбоза включает застой кровотока, повреждения эндотелия и гиперкоагуляции в крови. (Б) схема процедуры инсульта Тхи. Два разъемные узлы были связаны на правой общей сонной артерии (ССА), и затем доставки 7.5% кислорода через носовой конус в течение 30 мин, в то время как ректальную температуру мыши поддерживали на уровне 37-38 ° С. После транснике, системная гипоксия, перевязка ОСО был выпущен, потянув один конец разъемных шовных узлов. MCA, средней мозговой артерии; МКА, внутренняя сонная артерия; ЭКА, наружной сонной артерии; ОСО, общей сонной артерии. (С) Хирургические процедуры для переходных правой ОСО окклюзии. 1. Два нарезанные шва (# 1 и # 2) были помещены под изолированной правой ВГА. Были сделаны 2. Два разъемные узлы. 3. Разрез линия была закрыта до швом # 3. Убедитесь, что концы шовного # 1 и # 2 были доступными за пределами линии разреза. 4. Осторожно потяните шва # 1 и # 2 извне, чтобы освободить CCA. При выполнении мягко, эта процедура не вызовет терзания ОСО.
Рисунок 2:. Анализ изменений головного мозга кровотока во время и после Тхи оскорблять изображений двумерных лазерный спекл контрастности (Л.С.ДИ) система была использована для оценки мозгового кровотока (CBF). R (справа) показывает сонную лигированную полушарие; L (слева) контралатеральной полушарии. () TCCAO под нормоксии подавляется БФК до ~ 50% от базовой стоимости на сонной лигированную полушарии (R) в течение по крайней мере 30 мин, который восстанавливается на выше 85% в течение 3 мин после освобождения сонной перевязки. (B) гипоксии (7,5% кислорода, 30 мин) без перевязки сонных артерий, БФК отказался 76% от исходного значения и временно подскочили примерно на 130%, вернувшись к нормоксии. (С) в переходном сонной перевязки при гипоксии (Тхи, 30 мин), БФК на сонной лигированную (R) полушарии быстро упал до менее чем 20% от базового значения, и он редко восстановлены выше 30% при освобождении сонных перевязка и возвращения в нормоксии. В противоположность этому, БФК на противоположной (L) полушарии колебалась от 20-50% при гипоксии, и быстро возвращается в> 80% от исходного уровнязначение после выхода сонной перевязки и возвращение к нормоксии. Показаны репрезентативные обводка CBF для п> 4 в каждой группе. Временные точки для представительных фотографий LSCI были отмечены серыми линиями в представительстве трассировки.
Рисунок 3: инфаркт мозга, спонтанное тромбоза и закупорке сосуда после инсульта Thi () В естественных TTC-пятно не показал видимого миокарда через 24 часа после 30 мин переходного перевязки правой общей сонной артерии (tCCAO), но добавление. 30 мин гипоксии (7,5% кислорода) для tCCAO производится значительное миокарда в ипсилатеральная полушария (звездочка), в основном в области средней мозговой артерии, поставляет. (B, C) Анти-фибрина (оген) иммуноокрашивания на 1 час после инсульта Тхи показал широко распространенные месторождения випсилатеральная полушарие. В противоположность этому, не было фибрина (оген) отложения на 1 ч после tCCAo (30 мин) инсульта (п> 4 для каждого). (D, E) церебральной перфузии оценивали в хвостовую вену в синий краситель Эванса на 4 ч после tCCAO (30 мин) или Thi (30 мин) инсульта. В пост-tCCAO мозга, Эванс синий краситель заполнено большинство кровеносных сосудов в ипсилатеральной полушарии. В противоположность этому, в пост-Thi мозга, Evan синий краситель заполнено меньше кровеносных сосудов и просочилась в паренхиму (п> 3). Масштабная линейка: 250 мкм.
Рисунок 4: Влияние ТАП тромболизиса в модели Тхи инсульта () План экспериментов, чтобы сравнить эффекты внутривенного введения ТАП (10 мг / кг) на 0,5, 1 или 4 ч после инсульта Тхи.. (Б) Резюме количества оперированных животных, Mortality в 24 ч после инсультов, выбросы (размер инфаркта пределами среднее +/- 2 SD), и количество животных, включенных для сравнения размера инфаркта. (С) Количественное показали усредненный 32% объем инфаркта в группе, получавшей наполнитель и значительное сокращение миокарда в 0,5 ч (до 16%) и 1 час (до 20%) группы (показаны среднее значение и SEM для каждой группы). P-значения определяются Т-тест. (D), представитель ТТК-окрашенных мозг от животных, которые были оспорены оскорбление Тхи и получивших лечение ТАП по указанному временной точке после травмы. В окрашивания TTC, живая ткань показали красный цвет; инфаркта ткань была бледно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инсульт является основной проблемой здоровья растет значение для любого общества с старение населения. В глобальном масштабе, инсульт является второй ведущей причиной смерти оценкам 5,9 млн роковых событий в 2010 году, что эквивалентно 11,1% всех случаев смерти 18. Инсульт также третьего по значимости причиной лет жизни, скорректированных на инвалидность (DALY) потеряны по всему миру в 2010 году, поднявшись с пятой позиции в 1990 году 19. Эти эпидемиологические данные подчеркивают необходимость более эффективных методов лечения острых (ишемический) инсульт. Однако, несмотря на интенсивные исследования в доклинической нейропротективного лечения, тромболизис ТАП остается только специфическая терапия острого ишемического инсульта, который одобрен Продовольственной и лекарствами в Соединенных Штатах, в то время как многочисленные перспективные раз нейропротективные агентов в исследованиях на животных не удалось в клинических испытаниях. Трудность в переводе нейропротекторные терапии пациентам есть много факторов, и нынешний акцент на хорошей лабораторной пракCE, мета-анализ нескольких наборов данных, а также международного сотрудничества в целях улучшения доклинические исследования хода 20,21. Тем не менее, есть мнение меньшинства предполагая, что поступательное трудности из-за плохого выбора механических моделей окклюзии сосудов (например, внутрипросветный шов окклюзии МСА) в большинстве доклинических исследований инсульта на сегодняшний день 2,3. Потому что модели механических сосудистые окклюзии редко вызывают тромбоз и мозговое реперфузии происходит слишком быстро после выпуска механической обструкции, эти модели ни откликнуться на реальном слово терапии (ТАП), ни фибринолиза обеспечить узкую терапевтическое окно, как те, у пациентов, перенесших инсульт. Следовательно, предлагаемое решение, чтобы подчеркнуть, по крайней мере, включать в себя модели тромбоэмболических инсульта в доклинических исследований хода 3.
Эта рекомендация, однако, имеет свои ограничения, поскольку существующие тромбоэмболические модели инсульта (экзогенные поставки эмболии, MCA-инъекция тhrombin и фототромбоза) имеют определенные технические недостатки 4. Для экзогенного модели эмболии, внутрисосудистого вливания результатов эмболии в значительной изменчивостью размера инфаркта и места, а также непредсказуемые реакции на ТАП тромболизиса из-за различий в подготовке сгустка 4,5. Прямой впрыск тромбина в отрасли MCA требуется удаление фрагментов костей черепа, и его полезность для оптимизации тромболитической терапии еще не доказано, 4,6. Химически инициативе тромбоэмболии на основе системного введения светочувствительного красителя (например бенгалроза или эритрозин B) и облучения через открытую черепа часто производит пластинчатые только агрегаты, которые не реагируют на тромболиз 4,7. Взятые вместе, существует потребность в более простых и ТРА-чувствительных тромбоэмболических моделей доклинических исследований инсульта.
Тхи парадигма имеет четыре уникальные преимущества как модели тромбоэмболических инсультов. Во-первых, оскорбление Тхи рукахэндогенные компоненты образуют на месте тромбов без помощи внешних химических или предварительно сформированный эмболии. Таким образом, образование тромба в модели Тхи является более актуальным для физиологических условиях. Во-вторых, модель Тхи отвечает выгодно быстрого ТАП-обработки (в 0,5 и 1 ч после травмы), но не отсроченного лечения (в 4 часа). Это терапевтическое окно аналогична тем, которые наблюдались у пациентов, перенесших инсульт. Таким образом, модель Тхи может быть использована для исследований, направленных на улучшение реперфузионной терапии при остром ишемическом инсульте. В-третьих, хирургические процедуры в модели Thi просты и просты, по сравнению с внутрипросветного окклюзии модели MCA шва. Продолжительность гипоксии в модели Thi также контролировать. Эти свойства делают модель Тхи менее восприимчивы к процедурным вариаций среди разных лабораториях. Наконец, модель Тхи может пролить понимание механизмов неполной реперфузии, несмотря реканализации крупных артерий после тромболизиса, которыйуникальная задача в терапии инсульта по сравнению с сердечной ишемии 1,22. Следовательно, модель Тхи дает уникальную систему для изучения механизмов головного сосудистого русла конкретных регуляции гемостаза 23.
Все экспериментальные модели травмы головного мозга имеют ограничения, и модель Тхи не является исключением. Три основных технических ограничений модели Thi инсульта были идентифицированы в эксперименте. Во-первых, в отличие от других моделей, где инсульта инсульт ограничивается мозга, сочетание гипоксии и сонной окклюзии приводит к периферической вазодилатации и повышению спроса на сердечный выброс 12. Таким образом, при сравнении эффектов мутаций мыши или нейропротекторы против оскорбления Тхи, их воздействие на сердечно-сосудистую функций также должен быть тщательно сравнивать. Во-вторых, мы обнаружили, что различные мыши инбредных линий имеют различные ответов на модели Thi, которые могут быть из-за неравномерного проходимости задней коммунicating артерии 24, разнородные сердечные функции, или сочетание того и другого. Следовательно, рекомендуется пол, возраст, вес тела, и мыши штаммов между двумя экспериментальными группами быть сравнимы по нейропротекция исследований. Наконец, ход Тхи опирается на животных, чтобы дышать в гипоксического газа в слегка под наркозом состоянии. Эффекты анестезии на результатах хода должны быть сведены к минимуму и все согласуется между животными. Тем не менее, до тех пор, исследователи бдительности из этих технических деталей и снизить переменные от животных к животным, модель Thi хода может быть быстро создана, чтобы получить высокую согласованность инфаркта мозга.
В целом, это Тхи простой и стандартной модели инсульта, который отвечает положительно на реальных терапии (ТАП) тромболизиса в клинически значимых временного окна. Эта новая модель является ценным дополнением к доклинических исследований инсульта, и может помочь улучшить тромболизис терапии при остром ишемическомХод.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10-13 weeks old (22-30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-brain imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 | |
| Meloxicam SR | ZooPharm | NSAID analgesia |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
