Vi har utviklet et øye irritasjon test som benytter en tredimensjonal rekonstruert menneskelig hornhinnen lignende epithelial (RHCE) vev modell. Testen er i stand til å skille mellom okulær irriterende og etsende stoffer (GHS kategori 1 og 2 kombinert) og de som ikke krever merking (GHS Ingen kategori).
For å overholde den syvende Amendment til EU kosmetikkdirektivet og EUs REACH-regelverket, er validert ikke-animalske alternative metoder for pålitelig og nøyaktig vurdering av okulær toksisitet hos mannen trengte. For å møte dette behovet, har vi utviklet en øyeirritasjon test (EIT) som benytter en tredimensjonal rekonstruert menneskelig hornhinnen lignende epithelial (RHCE) vev modell som er basert på normale menneskelige celler. EIT er i stand til å skille okulære irritanter og korrosjonsmidler (GHS kategori 1 og 2 kombinert) og de som ikke krever merking (GHS Ingen kategori). Testen benytter to separate protokoller, en beregnet for flytende kjemikalier og en andre, tilsvarende protokollen for faste testartiklene. Den EIT prediksjon modellen bruker en enkelt eksponeringsperiode (30 minutter for væsker, 6 timer for faste stoffer) og et enkelt vev levedyktighet cut-off (60,0% som bestemt ved MTT-analyse). Basert på resultatene for 83 kjemikalier (44 væsker og 39 faste stoffer) EIT oppnådde 95,5 / 68,2 / og 81,8% sensitivity / spesifisitet og nøyaktighet (SS & A) for væsker, 100,0 / 68,4 / og 84,6% SS & A for faste stoffer, og 97,6 / 68,3 / og 83,1% for generelle SS & A. EIT vil bidra vesentlig til å klassifisere okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av flytende og faste kjemikalier uten bruk av dyr for å møte regulatoriske testkrav. Den EpiOcular EIT metoden ble implementert i 2015 inn i OECD retningslinjene som TG 492.
Forbrukerprodukter som kosmetikk, vaskemidler og vaskemidler inneholder en rekke kjemikalier som kan forårsake alvorlige skader hvis de kontakt med øynene. Derfor er testing av disse midlene for øyeirritasjon kreves av amerikanske og europeiske regulatoriske myndigheter for å sikre forbrukernes sikkerhet 1. En vurdering av øyeirritasjon potensialet i blandinger og formuleringer er også en forutsetning for å etterkomme REACH (Registration, Evaluation, Authorization, og begrensning av kjemikalier) regelverk for merking av kosmetiske ingredienser under EUs kosmetikkdirektiv for transport av kjemikalier, og for merking av plantevernmidler og husholdningsprodukter 2. Foreløpig etatene krever okulær risikovurdering ved bruk Globalt Harmonisert System for Klassifisering og merking av kjemikalier (GHS) 3. GHS er hovedsakelig basert på Draize øyeirritasjon test, den mest brukte øyeirritasjon analyse hvor fremmedstoffer og mixtures innføres direkte inn i konjunktivalsekken i det kaninøye 4. Ifølge GHS klassifisering, GHS kategori 1 (okulær corrosives) refererer til å teste kjemikalier som forårsaker alvorlig innledende skade på øyet vev eller alvorlig skade på øyet og synet som ikke er fullt reversible innen 21 dager etter eksponering 3,5. GHS kategori 2 refererer til å teste kjemikalier som produserer betydelige endringer i øyet som er fullt reversible innen 21 dager etter eksponering. Test kjemikalier som ikke er korroderende eller irriterende blir referert til som GHS No kategori.
For mer enn 40 år har Draize kaninøyne test blitt kritisert for sin manglende reproduserbarhet, overvurdering av menneskelige reaksjoner, og bruk av levende dyr 5-8. Disse bekymringer har oppmuntret mange forslag til avgrensning, reduksjon, og utskifting av in vivo-test 9. Behovet for validerte ikke-animalske alternativer ble ytterligere styrketved vedtakelsen av Seventh Endring til kosmetikkdirektivet, som forbød bruk av dyr i sikkerhetsevaluering av kosmetiske produkter (i 2005) og ingredienser (i 2009) 2.
Siden 1996 har rekonstruert hornhinne-lignende vev modellen blitt mye brukt av den kosmetiske industrien for å evaluere irritasjonspotensialet av råvarer, overflatebaserte formuleringer, og forsterket blandinger som er utviklet for bruk i, eller i nærheten av, øyet 10-13. Bruk av RHCE vevet modellen tillater direkte topisk applikasjon av testmaterialet på vevsoverflaten i sin native, ufortynnet form. På denne måte kan ikke-vannoppløselige formuleringer testes uten å fortynne dem med oppløsningsmidler. Som svar på EURL ECVAM (European Union Reference Laboratory europeiske senteret for validering av alternative metoder) anmodning om et allment gjeldende, grei, og økonomisk metoden Øyeirritasjonstest (EIT) som benytter en single eksponeringstid og er i stand til å skille okulære irritanter og korrosjonsmidler fra materialer som ikke krever merking ble utviklet (figur 1) 14. Basert på resultatene for 83 kjemikalier (44 væsker og 39 faste stoffer), EIT oppnådde 95,5 / 68,2 / og 81,8% sensitivitet / spesifisitet og nøyaktighet (SS-A) for væsker, 100,0 / 68,4 /, og 84,6% SS & A for faststoffer, og 97,6 / 68.3 / og 83,1% for generelle SS & A.
I 2007, en multi-laboratorium pre-valideringsstudie sponset av Cosmetics Europe (tidligere Colipa) i regi av den EURL ECVAM vurderes relevansen og påliteligheten av EIT med mål om å bringe det til formell validering 15. I denne studien ble 298 uavhengige studier utført i syv uavhengige laboratorier. Resultatene fra denne undersøkelsen viste 99,7% enighet i prediksjon med lave variasjonskoeffisienter tvers av alle deltakende laboratorier 15. Som et resultat i 2010 på EIT protokollen inngått en formell EURL ECVAMvalideringsprogram. Valideringsstudien benyttet 104 kodede test kjemikalier, inkludert enkeltstoffer og kjemiske blandinger, som i vivo referansedata (Draize øyeirritasjon data) var tilgjengelige. Basert på suksessen av dette arbeidet, ble en OECD utkast TG levert i 2014. Det er forventet at EIT betydelig bidrar til klassifisering av okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av materialer i henhold til FN GHS klassifisering og merking.
Vi har presentert den Øyeirritasjonstest (figur 1) som ble utviklet for EpiOcular vev modell. EIT er i stand til å skille okulære irritanter og korrosjonsmidler (GHS kategori 1 og 2 kombinert) fra materialer som ikke krever merking (GHS Ingen kategori) med høy grad av sensitivitet og spesifisitet 17. EIT som presenteres her ikke diskriminerer mellom GHS kategori 1 fra kategori 2 kjemikalier. EIT ble validert for klassifisering og merking av okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av kjemikalier, inkludert kosmetiske og farmasøytiske ingredienser. I forbindelse med andre in vitro tester, vil EIT tjene som en erstatning for den in vivo kanin øyeirritasjon test.
EIT bruker to lignende, men forskjellige protokoller for flytende og faste materialer, som varierer i lengde av eksponering og posteksponerings inkubasjonsperioder (figur 1). Sluttpunktet brukes i EITer vevet levedyktighet, bestemt ved MTT-analysen, som tidligere er blitt brukt i validerte humane epitel-vevsmodeller 20,21. For å utføre denne analysen, er ikke noe spesielt utstyr i tillegg til standard cellekultur utstyr som er nødvendig. På grunn av det høye nivået av vev til vev reproduserbarhet, n = 2 vev i stedet for den normalt anbefalte n = 3 blir brukt. Muligheten til å bruke n = 2 vev er en kritisk del av protokollen, siden det gir en erfaren operatør for å behandle to vev samtidig, for derved å minimalisere variasjonen av analysen som kan oppstå på grunn av forskjellig håndtering av individuelle vev 14. Også, ved hjelp av n = 2 vev per testartikkel, den irritasjon av 10 testsubstanser i samme fysiske tilstand (flytende eller fast), sammen med de positive og negative kontroller, kan evalueres ved hjelp av en kit (24 vev).
Andre viktige punkter som sikrer pålitelig klassifisering av materialer er spesifikasjoner for den positive kontrollen substance (tissue levedyktighet ≤50.0%), reproduserbarhet mellom dupliserte vev (forskjell <20,0%), og negativ kontroll OD-avlesninger (> 0,8 og <2,5).
Når du utfører EIT test, er det viktig å følge den godkjente protokollen og til foreslått dosering og skylle tidsplaner (tabell 3 og 4), siden avvik fra protokollen eller endringer i de inkubasjonsperioder kan resultere i endret utfallet. Likeledes vil avvik fra tre timers tid for MTT inkubasjon resultere i forskjellige MTT opplesninger og kan påvirke analyseresultatet.
Av og til kan en test kjemisk ha optiske eller andre egenskaper som kan forstyrre MTT vev levedyktighet analysen eller forårsake reduksjon av MTT. For eksempel kan en prøve kjemisk direkte redusere MTT til blå-purpur reaksjonsprodukt, eller det kan være et farget stoff som absorberer lys i det samme området som MTT formazan (~ 570 nm). Imidlertid vil disse testkjemikalier prESENT et problem bare, om i den tiden av MTT-analysen, er en tilstrekkelig mengde av materiale som fremdeles er tilstede på (eller absorberes av) vevet. For å unngå dette interferens, er omfattende renseprosedyrer innlemmet i EIT protokollen. Hvis skylling fjerner ikke TA og TA forstyrrer MTT reduksjon, må ytterligere kontroller brukes til å avdekke og korrigere for det. I korte trekk, hvis direkte MTT reduksjon av forsøksstoff er mistenkt, blir 50 ul (eller 50 mg for faste stoffer) av det aktuelle kjemikaliet inkubert i 3 timer med arbeids MTT-løsning ved SCC (NC, 50 ul sterilt deionisert vann, bør kjøre samtidig). Dersom MTT løsningen blir blå-purpur, blir testartikkel antatt å ha redusert MTT. I dette tilfellet er en funksjonskontroll ved bruk av fryse-drepte vev kontroller må utføres for å vurdere hvorvidt testmaterialet binding til vev, og fører til et falsk MTT-reduksjon signal. Hvis det er merkbart MTT reduksjon i TA-eksponerte, drepte vevskontroll(i forhold til mengden i det ubehandlede levedyktig vev), den midlere levedyktighet av vev testartikkelen må korrigeres ved å subtrahere den midlere levedyktighet av drepte kontroll.
EIT feiler på siden av sikkerhet, som demonstrert av den lave forekomsten av falske negative klassifikasjoner 14,15,18. Viktigere, ingen av GHS kategori 1 kjemikalier, som er etsende for øyet og som representerer den mest alvorlige okulær fare, ble klassifisert som ikke-irriterende i denne analysen 14,15,18,19. Endelig er en av de store fordelene med den RHCE in vitro testmetode er mulighet for testing av ren væske og faste materialer (som ikke er mulig med to-dimensjonale, neddykkede cellekulturer).
EIT vil bidra vesentlig i å bestemme okulær irritasjon potensialet i et bredt spekter av materialer i henhold til FN GHS klassifisering og merking. Utskiftningen av dyr for å bestemme osielt toksisitet har vært et mål for toksikologisk forskning i mange år. EIT testmetode har gjennomført en formell valideringsstudie støttet av EURL ECVAM i 2014 og EpiOcular EIT ble implementert i OECDs test retningslinjer som OECD TG 492 i 2015.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Dr. John Harbell for sin vitenskapelig støtte og tid dedikert til EIT prosjektet. Forfatterne ønsker også å takke Beiersdorf AG (Tyskland), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Sveits), Laboratoire Pierre Fabre (Frankrike), Harlan Laboratories (Storbritannia), og LVMH Parfume (Frankrike) for deltakelse i Multi-senter International Pre-validering og valideringsstudier av Øyeirritasjonstest 15.