Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
재생 의학 및 조직 공학의 분야는 빠르게 기관 및 신장 재생이 주목할만한 최근의 성과에 돌파구로 진행된다. 조직 공학에서 개발 된 생체 재료는 덜 전문 실험실에 이러한 프로토콜을 전송 할 수있는 기회, 더 접근되고있다. 생체 물질의 사용 증가를 통해 이익을 준비하는 하나의 필드는 체외 진단이다.
시험관 연구에서 단일 세포 유형 내에서 세포 내 신호 전달 경로를 조사하는 중요한 플랫폼이며, 수많은 질병 pathophysiologies을 기본 메커니즘의 윤곽을 도왔다. 이러한 연구는 일반적으로 조직 배양 플라스틱 (TCP)에 단층으로서 배양 한 세포 형에 의존하고; 훨씬 덜 탄성 다공성 3 차원 환경 세포보다 2 차원 강성 표면은 조직 또는 기관 내에서 노출된다. 동물 모델은 전통적 E왔다또한 전체 조직 번역 관내에서 발견 효과를 확인 mployed, 또한 인간의 질병을 조사 전임상 플랫폼으로서 사용될 수있다. 그러나, 간 종의 차이는 인간의 질병에 대한 우리의 이해에 동물 모델에이 신뢰를 훼손 -. 예를 들어, 폐 질환, 천식 훨씬 이해가 작은기도 평활근 다발의 비만 세포 침윤의 증거, 또는 동물 내에서 자발적인 질병 발전 용량을 포함한 사람의 상태와 모델 사이의 본질적인 차이에도 불구 마우스 모델에 기초 3,4 모델. 영국 및 기타 국가에서 권장되는 동물 실험에서 "교체, 정제 및 감소"의 "3RS"표준 동물 모델의 사용에 대한 윤리적 고려 사항도 있습니다.
매력적인 대안은 체외 만들기 구조에서 인체 조직의 재현부 것s는 하나의 단위로 성인의 세포 유형 간의 협력 특성을 알아보고자 하였다. 세포는 독특한 미세 환경 내에서 각 조직 내에 3D 다세포 구조에 존재한다. TCP에 세포의 배양은이 환경을 복제 또는 다중 세포 배양을위한 능력을 제공 할 수없는 세포 단층의 배양을 허용한다. 생체 재료의 발전은 세포 배양을위한 천연 및 합성 3D 플랫폼을 모두 개발할 수있는 기회를 제공한다. 줄기 세포를 포함 하나, 다른 세포 유형 recellularized 때 탈세 포화 된 ECM은 크게 조직 제한된 비 – 인간 기원의 가용성 그러나 이러한 프로토콜은 복잡하고 시간 소모적 일 수 있고, 3 차원 세포 배양에 사용될 수있다. 다른 프로토콜은 나노 임 프린팅, 전자 재료 증착, 세포 시트 기술, 또는 전기 방사 등의 생성 세포의 환경을 더 잘 제어 할 수 있습니다. 전기 방사 나노 미터에서 마이크로 미터까지 직경, R와 섬유 부직포 3D 다공성 매트를 생성자연 ECM 치수를 eplicating. 전기 방사 발판이 점점 3D 세포 배양 플랫폼으로 채택되고있다 -. 전기 방사 매개 변수의 조작은 기공 크기, 섬유 직경, 지형과 정렬 및 표면 화학 등의 골격 특성을 통해 복잡한 제어 할 수 있습니다. 세포를 분리하여 배양 한 경우와 같은 파라미터들의 변경은, 직접적으로 세포 부착 및 성장에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
이러한 장점은 3D 모델 조직 구조로서기도 세기관지를 사용하여 단일 차원 조직 구조로 여러 종류의 세포를 배양 할 수 있도록 본 연구에 이용되어왔다. 세기관지 벽은 세 가지 주요 영역 (그림 1)으로 구성되어 있습니다. 기도 상피 세포가 외부 환경에 대한 중요한 장벽을 제공하는, 공기 – 액체 경계면 (ALI)에 앉아 여기서 점막이다. 그들은 망상 기저막 (RBM)에 상주, 단단히 소형 ECM 주로 collag 구성EN IV, perlecans 및 라미닌. 서브 점막 층을 직접 점막, 섬유 아세포, 근섬유 비롯한 질병 상태 하에서 백혈구 침윤 여러 종류의 세포로 구성된 다공성 영역보다 아래에서 발견된다. 마지막으로 평활근 번들은 나선형 방식으로기도의 주위에 포장하고,기도 평활근 (ASM)의 정렬 시트로 구성된다. 그것은기도 톤을 제어하는 평활근의 상대적 수축 상태입니다. 폐 시스템 내에서 전기 방사 비계의 고용은 최근까지 재생 목적으로 제한되었다; 전기 방사 기관과 교환이 성공적으로 이식된다. 성공하는 동안, 이러한 치료는 숫자에 제한되어 인해 조직의 기능의 상대적 단순한 자연 기관에 초점을 맞추고있다. 체외 진단에 사용기도 모델 한정적인 예는 존재하고, 주로 평활근 수축 측정에 초점을 맞추고있다. 무독성없고N 분해성 중합체, 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET)는 미리 전기 방사하고 있으며, 적합한 것으로 또한 (이를 "기성품"이용 될 수 있도록) 분해없이 장기간 저장 될 수 생성 발판을 보장하는 본 연구에 사용하고 있었다 오랜 기간 동안 안정적으로 세포 배양합니다. 우리 그룹의 이전의 연구는 기본적인 전기 방사 프로토콜의 세 변이를 이용하는 세 개별 PET의 전기 방사 비계가 배양기도 상피 섬유 아세포에 대한 최적의 지형 및 분리 (21, 22)에서의 평활근 세포 및기도의 공 배양을 제공하도록 제조 될 수 있다는 것을 보여 주었다 상피 세포와 섬유 아세포 (22). 섬유 직경이 크게 상피 기능 (22)에 영향을 미치는 것을 발견하고, 섬유 배향 평활근 (21)의 시트들의 정렬을 생성 하였다. 이러한 연구는 정적 조건에서 각각 독립적으로 수행 하였다. 본 연구에서는 이러한 differe완전히 분화 된 성인 인간 세포를 포함하는 NT 지지체는기도 간 세포 반응을 조사하는 시험 관내 모델에서의 생리 학적 관련성을 제공하고,기도 벽의 3D 부로서 시판 생물 반응기에서 ALI에서 일주일 동안 동시 배양 하였다. 이 프로토콜은 모델 시스템과 같은기도 세기관지를 사용하는 동안, 그것은 다른 기관으로부터 점막 단위의 3 차원 공 배양을위한 플랫폼으로 구성 될 수있다.
자연 ECM에 비해 구조적 특성을 가진 고분자 섬유를 electrospin하는 기능은, 이러한 환경을 재현하기 위해 전기 방사되는 수많은 천연 또는 합성 폴리머, 또는 폴리머 블렌드하게되었다. 가능한 모든 영향 골격 특성 (중합체의 선택, 중합체 농도, 용매, 바늘 끝의 거리와 온도 포함) 공정 변수의 조작; 그러나 일부 매개 변수는 다른 25보다 비계의 특성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. PET 섬유 직경을 수정하는 경우, 우리가 사용하는 중합체의 농도, 중합체 용액을 전기 방사되었을 때의 속도와 직경의 바늘로 주요 파라미터를 발견했다. 정렬 된 섬유를 전기 방사 할 때 키 파라미터 (회전 맨드릴) 사용 수집 방법 및 속도로 맨드릴 회전한다. 60 rpm으로 맨드릴 속도를 감소 통해, 우리는 생성 된 무작위로 정렬 된 비계 큰 발판 UNI을 보였다 발견의 적합성은 평평한 집 전판에 전기 방사에 비해.
탈세 포화 된기도 조직의 특성은 각각의기도 세포 유형의 배양을 위해 개발 된 다양한 골격 지형에 대한 지침을 제공하기 위해 분석 하였다. 전기 방사 나노 섬유는 세포 이동을 규제하는 동안 증가 된 대사 물질의 확산을 가능하게 작은 기공 크기하지만 전반적으로 높은 기공률로 인해 기저막 구조를 복제하는 매력적인 골격이다. 9 전기 방사에 매개 변수를 최적화하는 동안, PET 농도와 유량의 범위는 시험 하였다. 얇은 섬유는 다른 그룹에 의해 이전에 사용 된 6 % 중량 / 부피 PET 용액을 사용하여 달성 하였다. 그러나, 높은 수준의 비딩 및 균일 성의 결여는 일정한 문제였다. 비딩을 제거하는 초기 시도는 다양한 소스를 표면 장력을 낮추기 위해 용액에, 양이온 성 계면 활성제, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (CTAB)를 첨가하고, 테스트 포함애완 동물의. 계면 활성제의 첨가는 완전히는 아니지만, 비딩의 양을 감소시켰다. TFA 용매 용액 : 애완 동물 펠릿의 상업적 출처를 시도 후, 식품 등급 음료 병, PET 음료 병을 절단하고 DCM 이러한 용해하여 사용 하였다. PET 섬유 소스 균일 성 증가와 섬유 비딩의 감소의 결과로서이 사용. 중량 / 부피 8 %로 약간 용액 농도를 증가시키고 (23G에 18G) 바늘 직경을 감소시킴으로써 우리는 지속적으로 약 250 nm의 섬유 직경으로 결함이없는 나노 파이버를 만들었다. 전기 방사 나노 섬유 지지체는 어려운 비계의 수동 취급을 맨드릴에서 수집에 크게 정전이 될 수 있습니다. 이 회전하고 사용하기 전에 70 % IMS에 몸을 담근 후 알루미늄 호일의 발판을 저장하여 개선되었다. 이것은 전기 방사 과정에서 발판에 남은 잔여 정전 하를 방산하기 위해 나타났다.
최고를 제공하기 위해천천히, 무작위 정렬 나노 파이버가 생성 저농도 PET 용액을 전기 방사하여 : ographies기도 벽 내에 세 가지기도 세포 유형에 의해 발생한 각각의 미세 환경과 유사하게, 기본 전기 방사 프로토콜이 이러한 유형의 세포에 대한 세 가지 고유 골격을 생산하도록 채택 된 있는에 상피 세포 (RBM을 흉내 낸) 시드했다. 더 빠른 속도로 더 높은 농도 PET 용액을 전기 방사하여, 무작위 정렬 마이크로 섬유 (더 다공성 지지체의 제조)이되는 섬유 아세포 (RBM 바로 아래 서브 점막 영역을 흉내) 시딩 하였다 생성 하였다. 맨드릴 정렬 나노 파이버를 고속 회전에 저농도 PET 용액을 전기 방사하여, 섬유 배향 방향의 평활근 세포의 세포 시트를 제조하는 정렬 상으로 제작했다.
증가 된 섬유 직경이 큰 셀 penetratio있게 증가 기공 크기로 이어질N 발판으로 그렇게하는 것은, 진정한 3D 환경을 만드는 데 도움이. 마이크로 화이버 지지체는 세포가 지지체 내에서 여러면에 존재하는지 확인하기 위해 연구에서 섬유 아세포의 배양에 사용 하였다. 30 % 중량 / 부피에 PET의 농도를 증가시켜, 2.5 ㎛의 평균 직경을 가진 PET 섬유를 제조 하였다. 대경 섬유 (≈ 4 μm의)은 35 % 중량 / 부피 PET 용액을 사용하여 제조하였으나, 지지체 두께 균일 성이 손실되고, 개개의 섬유 사이에 높은 가변성이 명백했다. 마이크로 섬유 지지체의 기공 (각각 1.43 μm의 대 10.45 μm의) 나노 섬유 지지체로 측정보다 7 배 더 있었지만, 세포의 여전히 정적 시드 제한 세포 침투를 제공했다. 이는 동적 혼합기 궤도 이전 효과적인 것으로 방법을 사용하여 세포를 시딩함으로써 개선되었다.
매우 정렬 된 나노 섬유 지지체는 10 %를 전기 방사하여 만든중량 / 맨드릴 상 부피 애완 동물 솔루션은 2,000 rpm으로 회전 (≈ 440m · 분 -1). PET 섬유 농도가 낮은 농도에서 전시 불규칙한 물결 모양의 형태를 막기 위해 8 %로 증가 하였다. 섬유 배향 농도의 증가에도 불구하고, (랜덤 배향 대 216 내지 255 nm의 대) 평균 섬유 직경을 감소시켰다. 그들은 한 건조 전에 섬유 드로잉 맨드릴의 고속이 효과가 발생할 가능성이있다. 섬유의 배향 ASM 세포의 배향에 영향을, 또한 다른 21 특성화되었다 ASM 세포에 다른 생리 효과를 갖는다.
이 프로토콜의 주요 한계는 샘플을 희생하지 않고 결정하는 것은 불가능 장기간에 걸쳐 초기 세포 부착 또는 분화를 만들기 비계의 ON / 화상 생균에 없다는 것이다. 즉, 수정, 이것은 대부분의 최적화 배양 기간 이후에 발생하는 것을 의미샘플을 보내고 다음 세포 배양은 세포 배양시하지 후 성공 여부를 측정. (분홍색 파란색) 알라 마르 블루 배양 지지체의 색 변화를 관찰하면 세포가 존재하고 실행 가능한 있습니다 나타내지 만 적합하지 않습니다. 젤라틴과 같은 전기 방사 더 투명 고분자 지지체에 세포를 시각화에 도움을 수 있습니다. 우리의 모델 내에서 나노 섬유 지지체의 전기 방사 마찬가지로 상피 세포가 상주하는 고밀도 나노 섬유로 구성된기도 RBM의 복제를 허용했다. 이것은 이전에 면역 세포 (데이터 미도시) 할 수 있지만, 구조가 세포, 나노 섬유 지지체 (22)를 통해 이전 할 수있는 것으로 나타났다. 3 차원 표면에 특정 세포 유형의 배양하는데 유리하다 니 (상피 및 내피 세포와 같은)을 통해 나노 파이버 구조 세포 이동의 방지는 다른 종류의 세포 배양 해로울 수있다. 평활근은 일을 통해 마이그레이션 할 수 없습니다로E 정렬 나노 지지체 우리는 (두 종류의 세포를 분리 정렬 지지체 대향) 서로 마주 평활근 및 섬유 아세포 층과 3 중층 공 배양을 조립. 이 세포가 가까운 동격에있을 수 있습니다 반면, 본 연구는 하나의 셀 타입 (섬유 아세포 또는 평활근 하나) 더 장기간의 배양 기간 동안 전체 층을 따라 잡을 것이라는 결론을 내릴 수 없습니다. 이러한 제한에도 불구하고,기도 벽 가능한 트라이 레이어 모델이 여러 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하기 위해 다른 플랫폼을 제공하는 개발되었다. 섬유 아세포는 내가 내강면 (17) 내에서 외부 표면과 상피 세포에 접종 평활근과 하이드로 겔 원통형 콜라겐에 포함 된 경우와 유사한 3 중층 연구는 최근에 출판되었습니다. 유사한 관상을 허용 여기 개발 전기 방사 비계의 기계적 안정성이 형성되도록 구축하고, 현재 resea의 유지RCH는 우리 그룹 내에서 목표로하고 있습니다. 연구이 연구에서 강조 바디 주 내의 여러 장기 기본적인 점막 구조 단위 및 세입자 수정을 통해기도에 집중했다 반면, 유사한 플랫폼은 혈관, 방광 포함 기저막 유닛을 함유하는 조직을 위해 개발 될 수있다 콜라겐 기반 다중 레이어 모델을 채용 한 각막.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |