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Bioengineering

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해 Published: July 31, 2015 doi: 10.3791/52986

Introduction

재생 의학 및 조직 공학의 분야는 빠르게 기관 및 신장 재생이 주목할만한 최근의 성과에 돌파구로 진행된다. 조직 공학에서 개발 된 생체 재료는 덜 전문 실험실에 이러한 프로토콜을 전송 할 수있는 기회, 더 접근되고있다. 생체 물질의 사용 증가를 통해 이익을 준비하는 하나의 필드는 체외 진단이다.

시험관 연구에서 단일 세포 유형 내에서 세포 내 신호 전달 경로를 조사하는 중요한 플랫폼이며, 수많은 질병 pathophysiologies을 기본 메커니즘의 윤곽을 도왔다. 이러한 연구는 일반적으로 조직 배양 플라스틱 (TCP)에 단층으로서 배양 한 세포 형에 의존하고; 훨씬 덜 탄성 다공성 3 차원 환경 세포보다 2 차원 강성 표면은 조직 또는 기관 내에서 노출된다. 동물 모델은 전통적 E왔다또한 전체 조직 번역 관내에서 발견 효과를 확인 mployed, 또한 인간의 질병을 조사 전임상 플랫폼으로서 사용될 수있다. 그러나, 간 종의 차이는 인간의 질병에 대한 우리의 이해에 동물 모델에이 신뢰를 훼손 -. 예를 들어, 폐 질환, 천식 훨씬 이해가 작은기도 평활근 다발의 비만 세포 침윤의 증거, 또는 동물 내에서 자발적인 질병 발전 용량을 포함한 사람의 상태와 모델 사이의 본질적인 차이에도 불구 마우스 모델에 기초 3,4 모델. 영국 및 기타 국가에서 권장되는 동물 실험에서 "교체, 정제 및 감소"의 "3RS"표준 동물 모델의 사용에 대한 윤리적 고려 사항도 있습니다.

매력적인 대안은 체외 만들기 구조에서 인체 조직의 재현부 것s는 하나의 단위로 성인의 세포 유형 간의 협력 특성을 알아보고자 하였다. 세포는 독특한 미세 환경 내에서 각 조직 내에 3D 다세포 구조에 존재한다. TCP에 세포의 배양은이 환경을 복제 또는 다중 세포 배양을위한 능력을 제공 할 수없는 세포 단층의 배양을 허용한다. 생체 재료의 발전은 세포 배양을위한 천연 및 합성 3D 플랫폼을 모두 개발할 수있는 기회를 제공한다. 줄기 세포를 포함 하나, 다른 세포 유형 recellularized 때 탈세 포화 된 ECM은 크게 조직 제한된 비 - 인간 기원의 가용성 그러나 이러한 프로토콜은 복잡하고 시간 소모적 일 수 있고, 3 차원 세포 배양에 사용될 수있다. 다른 프로토콜은 나노 임 프린팅, 전자 재료 증착, 세포 시트 기술, 또는 전기 방사 등의 생성 세포의 환경을 더 잘 제어 할 수 있습니다. 전기 방사 나노 미터에서 마이크로 미터까지 직경, R와 섬유 부직포 3D 다공성 매트를 생성자연 ECM 치수를 eplicating. 전기 방사 발판이 점점 3D 세포 배양 플랫폼으로 채택되고있다 -. 전기 방사 매개 변수의 조작은 기공 크기, 섬유 직경, 지형과 정렬 및 표면 화학 등의 골격 특성을 통해 복잡한 제어 할 수 있습니다. 세포를 분리하여 배양 한 경우와 같은 파라미터들의 변경은, 직접적으로 세포 부착 및 성장에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

이러한 장점은 3D 모델 조직 구조로서기도 세기관지를 사용하여 단일 차원 조직 구조로 여러 종류의 세포를 배양 할 수 있도록 본 연구에 이용되어왔다. 세기관지 벽은 세 가지 주요 영역 (그림 1)으로 구성되어 있습니다. 기도 상피 세포가 외부 환경에 대한 중요한 장벽을 제공하는, 공기 - 액체 경계면 (ALI)에 앉아 여기서 점막이다. 그들은 망상 기저막 (RBM)에 상주, 단단히 소형 ECM 주로 collag 구성EN IV, perlecans 및 라미닌. 서브 점막 층을 직접 점막, 섬유 아세포, 근섬유 비롯한 질병 상태 하에서 백혈구 침윤 여러 종류의 세포로 구성된 다공성 영역보다 아래에서 발견된다. 마지막으로 평활근 번들은 나선형 방식으로기도의 주위에 포장하고,기도 평활근 (ASM)의 정렬 시트로 구성된다. 그것은기도 톤을 제어하는​​ 평활근의 상대적 수축 상태입니다. 폐 시스템 내에서 전기 방사 비계의 고용은 최근까지 재생 목적으로 제한되었다; 전기 방사 기관과 교환이 성공적으로 이식된다. 성공하는 동안, 이러한 치료는 숫자에 제한되어 인해 조직의 기능의 상대적 단순한 자연 기관에 초점을 맞추고있다. 체외 진단에 사용기도 모델 한정적인 예는 존재하고, 주로 평활근 수축 측정에 초점을 맞추고있다. 무독성없고N 분해성 중합체, 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET)는 미리 전기 방사하고 있으며, 적합한 것으로 또한 (이를 "기성품"이용 될 수 있도록) 분해없이 장기간 저장 될 수 생성 발판을 보장하는 본 연구에 사용하고 있었다 오랜 기간 동안 안정적으로 세포 배양합니다. 우리 그룹의 이전의 연구는 기본적인 전기 방사 프로토콜의 세 변이를 이용하는 세 개별 PET의 전기 방사 비계가 배양기도 상피 섬유 아세포에 대한 최적의 지형 및 분리 (21, 22)에서의 평활근 세포 및기도의 공 배양을 제공하도록 제조 될 수 있다는 것을 보여 주었다 상피 세포와 섬유 아세포 (22). 섬유 직경이 크게 상피 기능 (22)에 영향을 미치는 것을 발견하고, 섬유 배향 평활근 (21)의 시트들의 정렬을 생성 하였다. 이러한 연구는 정적 조건에서 각각 독립적으로 수행 하였다. 본 연구에서는 이러한 differe완전히 분화 ​​된 성인 인간 세포를 포함하는 NT 지지체는기도 간 세포 반응을 조사하는 시험 관내 모델에서의 생리 학적 관련성을 제공하고,기도 벽의 3D 부로서 시판 생물 반응기에서 ALI에서 일주일 동안 동시 배양 하였다. 이 프로토콜은 모델 시스템과 같은기도 세기관지를 사용하는 동안, 그것은 다른 기관으로부터 점막 단위의 3 차원 공 배양을위한 플랫폼으로 구성 될 수있다.

Protocol

비 천식 개인의 기본 ASM 세포 글렌 병원 전술 한 바와 같이 (레스터, UK)에서 기관지 생검으로부터 분리 하였다. 이 연구는 레스터 셔 윤리위원회에 의해 승인 된 환자는 서면 동의서를 주었다.

1. 전기 방사 PE​​T 공사장 공중 발판 (그림 2)

  1. - 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 용액 (1) 디클로로 메탄 (DCMro) : 1의 음료 병 등급 PET의 용액 (10 ㎖)을 준비한다. 8 %, 30 % 및 10 % 중량 / 부피 (중량 / 부피)의 PET 농도는 나노, 마이크로 화이버 필요하고 비계를 각각 정렬 애완 동물이 용해에 대한 다음 솔루션 O 실온에서 / N을 자극한다.
  2. 주사기로 애완 동물 솔루션을 전송하고 주사기 (나노 섬유에 대한) 23-G 또는 18-G (마이크로 화이버 및 정렬) 바늘을 부착 전동 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다. 바늘의 포인트가 아래로 회전되어 있는지 확인합니다.
  3. 엄마의 위치를바늘을 보장 떨어진 바늘의 선단으로부터 15cm ndrel는 드럼의 중심에서 지적된다.
  4. 악어 클립 바늘 끝으로 전기 공급을 부착하고 지구 (바나나 소켓을 통해) 맨드릴을 접지. 나노 및 마이크로 비계 용 (약 13.2 m · 분 -1에 해당) 60 rpm으로 전원 맨드릴에 공급하고 설정 속도에 전환합니다. 대한 정렬 비계 (약 440m · 분 -1에 해당) 2,000 rpm으로 설정 속도.
  5. 0.5 ML의 유량 주사기 펌프를 설정 · 시간 -1 나노 섬유 랜덤 정렬 비계 또는 2.0 ml의 용 · 시간 -1 마이크로 화이버 발판합니다. 용액이 바늘에서 임의의 공기를 제거하기 위해 바늘 끝로부터 압출 될 때까지 펌프가 실행될. 그런 다음 펌프를 중지합니다.
  6. 주사기 펌프, 용액의 전량을 2 ml의 배출 펌프를 시작하도록 설정한다.
  7. 전원 SUPP에 설정 전압 14 kV의에 공급하고, 스위치LY.
  8. Electrospin 용액 2 ml의 전기 방사 될 때까지 (나노 섬유 정렬 발판 4 시간, 마이크로 화이버 발판 1 시간).
  9. 맨드릴의 폭을 따라 블레이드 비계를 잘라. 이는 (이 경우, 직사각형의 시트 22cm X 11cm) 발판의 2D 시트 맨드릴 표면적의 크기 신중 맨드릴을 박리 할 수​​ 있음) 생성한다. ) 정전기를 줄이기 위해 알루미늄 호일의 발판을 저장합니다.
    참고 : 바이 페이 비계가 순차적 마이크로 화이버 지지체에 직접 나노 섬유 지지체를 전기 방사에 의해 생성된다.

세포 배양에 사용하기 전에 비계의 2 살균

  1. 발판 시트에서 0.8 mm 직경의 생검 펜을 사용 이상성 또는 정렬 비계의 디스크를 펀치와 비 독성 수족관 접착제를 사용하여 개스킷 스틱.
  2. (20)에 침지하기 전에 지지체의 각 측면에 30 분 동안 자외선을 조사하여 멸균 비계% 부피 / 부피 안티 곰팡이 / 항생제 용액 (2 × 5 개 ml의 -1 페니실린 G, 2,000 mg의 ml의 -1 스트렙토 마이신 황산염과 500 μg의 ml의 -1 암포 테리 신 B) O / 4 ℃에서 N.
  3. 사용할 때까지 4 ° C에서 PBS로 PBS에서의 TCP 웰 플레이트에 3 번 한 다음 저장 발판을 발판을 씻으십시오.

3. 세포 배양 미디어 성분

  1. DMEM-F12 배지에서 배양 CALU3 상피 세포 (10 % 부피 / 권 소 태아 혈청 (FCS), 2 nM의 L- 글루타민 용액, 1 % 부피 / 부피 항생제 / 항진균제 용액 1 만대 ml의 -1 페니실린 G를, 100 mg의 보충 ml의 -1 스트렙토 마이신 황산염 25 μg의 ml의 -1 암포 테리 신 B).
  2. DMEM 배지에서 배양 MRC5 섬유 아세포와 ASM 세포 (10 % 부피 / 권 소 태아 혈청 (FCS), 2 nM의 L- 글루타민 용액, 1 % 부피 / 부피 항생제 / 항진균제 용액 1 만대 ml의 -1 페니실린 G, 1 보충00 mg을 ml의 -1 스트렙토 마이신 황산염 25 μg의 ml의 -1 암포 테리 신 B).
  3. 문화 상피 - 섬유 아세포 - ASM 세포의 공동 문화 70:30 DMEM-F12에 : DMEM 미디어 혼합물.

바이 페이 비계 위에 섬유 아세포와 상피 세포의 4. 시드

  1. 조직 배양 접시에, DMEM-보충 미디어의 발판을 흡수 세포 파종 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
  2. , DMEM-보충 용지를 제거 치근단 발판의 마이크로 화이버 단계를 배치하고 DMEM-보충 미디어의 30 μL에 1.5 X10 4 MRC5 섬유 아세포 씨앗. 공기 O / N 37 ° C 5 % CO 2 인큐베이터에서 떠나기 전에, 2 시간 동안 궤도 통에 판을 선동.
  3. 그래서 발판의 나노 단계가 치근단면을 통해 지지체의 나노 단계에 DMEM-F12-보충 미디어의 30 μL에서, 종자 3.0 X10 4 CALU3 상피 세포를 지지체를 켜고 fo를 품다R 70:30 DMEM-F12에 발판을 잠수 전에 공기를 37 ℃에서 2 시간, 5 % CO 2 : DMEM-보충 미디어 O / N 전에 생물 반응기를 전송합니다.

정렬 발판 위에 ASM 세포의 5. 시드

  1. 조직 배양 접시에, DMEM-보충 미디어의 발판을 흡수하고 2 시간 (37 ℃, 5 % CO에 대한 DMEM-보충 미디어의 30 μL에 2.5 X10 4 셀 시드 및 배양하기 전에 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 2 공기). 인큐베이터와 O를 떠나 DMEM-보충 미디어 대가로 발판을 잠수함 / N 생물 반응기에서 트라이 문화를 설정하기 전에.

6. 설정 업 생물 반응기 시스템을 사용하여 트라이 문화 (그림 7)

  1. 상피 단계는 챔버로 위를 향하게 한 챔버 내 홈에 이상성 발판 가스켓을 놓습니다.
  2. 이상성 발판 아래에 정렬 된 지지체를 배치 (그래서 MI 인접crofiber 이상성 비계의 상)과 함께 생물 반응기의 두 개의 챔버를 잠급니다.
  3. (DMEM-F12 / DMEM 함유 기초 저장 미디어 혀끝의 저수지에 DMEM-F12-보충 미디어)이 회로 주위 펌프 미디어가 약 0.1 ml / 분 연동 펌프를 사용하여 두 매체 저수지에 연결된 두 개의 관류 흐름 회로를 조립 (40 ml의 미디어는 각 회로를 통해 재활용). 하우스 37 ℃, 공기 중 5 % CO 2 인큐베이터 내에서 시스템의 모든 부품.
  4. 일주 후, 분석 한 후 적어도 일주일 동안 알리의 상피 세포를 혀끝 챔버에서 용지를 제거하고, 문화.

Representative Results

탈세 포화기도 조직 또는 우리가 전기 방사의 발판 지형에 소개하고 싶다고기도 ECM의 바람직한 특성을 식별기도 조직 검사에서 면역 조직 이미지의 주사 전자 현미경 이미지 : 기본 RBM 행렬은 약 30.6 nm의 ± nm의 153 (N 평균 ± SD = 50 측정 섬유로 구성 )의 직경 (도 3a 및도 5a), RBM 주변 매트릭스 동안 자연 (도 3c)에서 더 많은 다공성이었다. 평활근 번들을 통해 면역 조직 섹션 셀 (21) (그림 3E)의 정렬 시트로 ASM 선물을 보여줍니다. 이 정보는 전기 방사 골격에 도입 특성을 안내하는 데 사용되었다. 회전 맨드릴 안정적으로 고속으로 회전 할 수 있었다 (> 2,000 RPM / 440m · 분 -1) 정렬 섬유와 발판을 생산합니다. 저속 회전 맨드릴 (60 RPM이 13.2 m · 분 -1) 섬유 배향에 영향을 미치지 않았다하지만, 고정 플레이트 상에 전기 방사 할 때보다 더욱 균일 한 두께를 갖는 지지체를 제작. 전기 방사 파라미터 (PET 농도 및 용액 유량)를 변경함으로써, (전기 방사 파라미터를 표 1에 명시되어있다) 수 마이크로 미터 또는 수백 나노 미터의 직경을 갖는 섬유 지지체를 만드는 것이 가능했다.

그러나 이러한 낮은 PET 농도에서 천연 RBM 섬유 (150 ㎚) 6 % PET 용액을 사용하여 제조 된, 상당 섬유 직경 전기 방사 섬유, 섬유의 비딩 (도 4a)에 발생 하였다. 이것은 2.4 nm의 ± 내지 255의 평균 직경을 갖는 균일 한 나노 섬유를 제조 8 %로 PET 용액의 농도를 증가시켜 제거 하였다 (SEM 평균 ±)와 1.43 μm의 ± 0.02 ㎛의 (도 4B,도 5A 및 B)의 평균 기공 크기. 나노 섬유 electrospin로 느린 유속을 허용, 23 G 18 G에서 바늘의 크기를 감소시킬 필요가 있었다 whils높은 유속을 유지하고 바늘 막힘, 큰 바늘 반복 문제를 감소 t. 때문에 높은 용액 점도로 마이크로 니들 팁에서 여러 방해 외에 섬유 직경 (도 4F)에서 균일 부족> 30 % PET 리드선 PET 용액을 전기 방사 할 때 증가. μm의 ± 0.02 ㎛의 2.50의 평균 섬유 직경을 갖는 균일 한 마이크로 섬유 매트를 2 ㎖ / h의 유속으로 30 % 중량 / 부피 PET 용액을 전기 방사 할 때 생성하고, 10.45 ㎛의 ± 0.13 ㎛, 평균 기공 크기 (± SEM을 의미) -1 (그림 4 층, 5A & B). 마이크로 화이버 지지체 (여전히 맨드릴에 부착)에 직접 나노 섬유 지지체의 연속 전기 방사는 이상성 발판 (그림 3D)를 만들었습니다. 평균 섬유 직경은 각각 나노 섬유와 마이크로 섬유 단계 20 nm 내지 2.30 μm의 ± 0.06 ㎛, ± 280 nm의이었다개별 나노 및 마이크로 비계의 크기 비교. 또한 이상성 지지체의 두께는 개별 나노 섬유와 마이크로 섬유 지지체 (도 5C)의 합과 유사 하였다. 맨드릴을 통해 속도를 증가 (2,000 RPM / 440m · 분 -1), 고도로 정렬 된 나노 또는 마이크로 섬유 지지체를 제조 하였다. 8 % 중량 / 부피의 PET 솔루션은 물결 모양의 형태 (그림 3 층)를 가진 정렬 된 나노 섬유 및 생산 섬유를 제조하기위한 최적의 아니었다. 10 % 애완 동물에 대한 증가는이 효과를 무효,하지만 여전히 감소 섬유 직경에 무작위로 정렬 된 나노 섬유 지지체에 비해 (2.2 nm의 (SEM ± 평균) ± 내지 216) 결과. 섬유 배향은 평균 섬유 각도에서 각각의 섬유의 각도의 어긋남을 측정함으로써 계산되었다. 정렬 된 나노 섬유의 골격에서 79 % 무작위 정렬 나노 scaff에서 섬유의 10.2 %에 비해 (± 10 °, 평균 섬유 각도)으로 정렬했다어린이 (그림 5D).

8 % 나노 섬유 지지체는 상피 세포가 상주하는 RBM 요점을 되풀이하는 데 사용하고, CALU3 세포의 배양 (기도 상피 세포 라인)을 지원하기 위해 사용되었다. 자연에서 더욱 다공성 인 30 % 중량 / 부피 마이크로 섬유 지지체는, 서브 점막 영역을 모방하는 데 및 MRC5 세포 (기도 섬유 아세포 세포주)와 함께 배양 하였다. 위상 참조 제공하는 10 % 중량 / 부피의 정렬 된 나노 섬유 지지체는 ASM 셀 정렬을 보장하기 위해 때 지지체에 배양 하였다. 2 주 기간 (도 6A) 위에 개별 지지체에 배양하고,이 이주 배양 기간 (도 6B, 6C, 6D) 후 세포 형 특정 단백질을 발현 할 때 세 세포 유형 생존의 증가를 보였다. 개별 세포 골격 상호 작용의 또 다른 특성은, 다른 곳 (21)이보고되었다. 나노 섬유 지지체의 연속 전기 방사마이크로 섬유 지지체는 각각 나노 섬유와 마이크로 섬유 상 상 CALU3 상피 세포와 섬유 모세포 MRC5 세포의 공 배양 용 지지체를 제조 이상성 상. 함께 정적 조건 하에서 두 세포 배양은 22 곳에보고되었다. 정적 조건 하에서 이주 넘어 이상성 배양 시간을 다른 세포 층을 추가하거나 확장하는 시도 또한 워크 (데이타 미기재) 실패 입증했다. 배양 장기간에 걸쳐 3 중층 모델, 우리는 관류 생물 반응기를 이용했다. CALU3 및 MRC5 세포 이상성 지지체 상에 시딩하고, ASM 세포 시딩 정렬 지지체 상에, 모두 2 일간 배양 하였다 별도로 하였다. 두 발판은 생물 반응기 내의기도 벽의 삼중 레이어 모델을 (도 7)을 형성하도록 함께 구입 하였다. 두 챔버는 혀끝 상피 챔버가 미디어를 제거했다 전에 7 일간 미디어를 관류하고, 상피 세포에서 배양 하였다또 7 일간 알리. 비계는 고정하거나 절단 및 염색, 또는 전체 골격은 세포 특이 마커에 대한 면역 염색했다되었다. 트라이 층 문화를 통해 섹션은 공 배양 (그림 8B)의 세 가지 레이어를 통해 배포 세포 핵을 보였다. 세포가 세포 특이 마커에 대한 면역 염색했을 때, 상피 세포가 합류 세포 층으로 혀끝의 나노 섬유의 위상을 채워과 cytokeratin에 양성 염색 (그림 8C), 마이크로 화이버 상에, 섬유 아세포는 S100A4 (그림 8D)에 대한 긍정적 인 염색과에 기도 벽의 3D 모델 내의 각각의 세포 유형의 우수한 생존율을 나타내는 SM22α (도 8E) 양성 염색 정렬 10 % 골격 ASM 세포.

그림 1
그림 1.기도 세기관지. 중증의 기관지 생검간엽 세포로 채워 기본 점막하 영역과 망상 기저막 (RBM)의 상피를 도시 천식성기도, 평활근의 α- 액틴 (브라운) 스테인드 평활근 세포로 채워 주변 평활근 번들. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 전기 방사 장치의 개략도. (첨부 바늘) 중합체 / 용매 용액을 함유하는 주사기 맨드릴 대향 주사기 펌프 상에 배치된다. 전위 니들 맨드릴 일으키는 섬유 바늘 끝로부터 토출하고, 회전 맨드릴 상에 증착되는 사이에 확립된다. 섬유는 대기를 통과 할 때,맨드릴에 고분자 섬유의 침착을 일으키는 원인이되는 용매 증발한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
기본기도 ECM에 전기 방사 비계의 그림 3. 비교. 탈세 포화 된 기저막 (A) 단면 (C) 및기도 평활근 번들의 조직 학적 섹션 세기관지 탈세 포화 된기도의 주사 전자 현미경 이미지 (헤 마톡 실린 및 에오신, 규모로 염색 바 40 μm의) 나노 섬유 (B에 비해 (E)) 이상성 (D) 및 정렬 (F) 애완 동물 골격. 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.

표 1 매개 변수 극세사, 전기 방사 나노 섬유를 사용하고 개별적 이상성 발판위한 발판을 정렬.

그림 4
PET 농도도 4 변질 섬유 특성. 6 %, 8 %, 10 % (AC), 25 %, 30 % 및 35 % (EG) (중량 / 부피) PET 용액으로부터 방사 된 전기 방사 비계의 주사 전자 현미경 이미지에 영향을 미치는 . 또한 정렬 발판이 8 % (D) 30 %에서 생산되는 (H) 중량 / 부피 애완 동물 솔루션을 표시. 광고는 1000 배의 배율로 이미지화 EH, 5000 배의 배율로 몇 군데. 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.

그림 5
전기 방사 애완 동물 골격의 그림 5. 속성. 망상 기저막 세포 외 기질 (RBM ECM), 무작위로 정렬 된 나노 및 마이크로 섬유 지지체 및 정렬 된 나노 섬유 지지체의 섬유 직경 분포를 나타내는 () 분포 곡선. (B)의 히스토그램은 나노와 마이크로 섬유 지지체의 상대적인 기공 크기 분포를 도시. (C) 나노, 마이크로, 이상성 정렬 비계의 평균 두께 (평균 ± 표준 편차 N = 6). (D) 비계 섬유 ImageJ에 분석 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다 랜덤 또는 정렬 ​​된 나노 섬유 지지체의 평균 섬유 배향으로부터의 편차를 나타내는 히스토그램 플롯. P임대이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
도 6 개인 비계에 개별 종류의 세포 배양. (A) 정렬 비계에 ASM 전지용 알라 마르 블루 세포 생존력 분석 결과, CALU3 나노 섬유 지지체에 세포 및 극세사 비계에 MRC5 세포 (SEM 평균 ± N = 3 20). 나노 섬유, 마이크로 섬유의 주사 전자 현미경 사진과 정렬 섬유 지지체 (B, CD 각각)과 SM22α 스테인드 vinculin (적색) 및 ASM 세포 스테인드 E-cadherin의 (적색)에 대해 염색 CALU3 세포 MRC5 세포의 면역 형광 이미지 (각각 E, FG) 모든 전문 발판에 (빨간색). 훽스트는 핵 (파란색)를 착색하는 데 사용되었다 눈금 막대가 표시 40# 181;. M 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
트라이 층기도 벽 모델에 대한 그림 7. 관류 시스템. 연동 펌프와 2 배의 미디어 저장소에 연결된 생물 반응기 용기 (A) 사진. 3 중층 비계의 (B) 도식. (C) 도식은기도의 모델은 공기 - 액체 계면에서 개최되는 두 생물 반응기 회로로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8. 완료 3D기도 벽 모델입니다. (A) 빨간색으로 강조 점막층과기도 벽의 기관지 생검, 점막하 지역은 녹색으로 강조하고, 평활근 번들 금 강조했다. 상피 세포, 섬유 아세포, 2 주 공 배양 한 후 고정 평활근 세포로 채워 이상성 정렬 발판으로 구성된 3 중층기도 벽을 통해 (B) 섹션을 참조하십시오. 세포 핵는 동시에 몇 군데 발판 반사율 (회색)와 DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 비계 또한 cytokeratin (녹색)에 대한 염색 CALU3 셀 (C), S100A4 (녹색) (D), 및 SM22α (적색)에 대해 염색 평활근 세포 염색 MRC5 세포 (함께 고정 2 주 후에 세포 특이 마커 면역 염색 하였다 E). 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


표 1.

Discussion

자연 ECM에 비해 구조적 특성을 가진 고분자 섬유를 electrospin하는 기능은, 이러한 환경을 재현하기 위해 전기 방사되는 수많은 천연 또는 합성 폴리머, 또는 폴리머 블렌드하게되었다. 가능한 모든 영향 골격 특성 (중합체의 선택, 중합체 농도, 용매, 바늘 끝의 거리와 온도 포함) 공정 변수의 조작; 그러나 일부 매개 변수는 다른 25보다 비계의 특성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. PET 섬유 직경을 수정하는 경우, 우리가 사용하는 중합체의 농도, 중합체 용액을 전기 방사되었을 때의 속도와 직경의 바늘로 주요 파라미터를 발견했다. 정렬 된 섬유를 전기 방사 할 때 키 파라미터 (회전 맨드릴) 사용 수집 방법 및 속도로 맨드릴 회전한다. 60 rpm으로 맨드릴 속도를 감소 통해, 우리는 생성 된 무작위로 정렬 된 비계 큰 발판 UNI을 보였다 발견의 적합성은 평평한 집 전판에 전기 방사에 비해.

탈세 포화 된기도 조직의 특성은 각각의기도 세포 유형의 배양을 위해 개발 된 다양한 골격 지형에 대한 지침을 제공하기 위해 분석 하였다. 전기 방사 나노 섬유는 세포 이동을 규제하는 동안 증가 된 대사 물질의 확산을 가능하게 작은 기공 크기하지만 전반적으로 높은 기공률로 인해 기저막 구조를 복제하는 매력적인 골격이다. 9 전기 방사에 매개 변수를 최적화하는 동안, PET 농도와 유량의 범위는 시험 하였다. 얇은 섬유는 다른 그룹에 의해 이전에 사용 된 6 % 중량 / 부피 PET 용액을 사용하여 달성 하였다. 그러나, 높은 수준의 비딩 및 균일 성의 결여는 일정한 문제였다. 비딩을 제거하는 초기 시도는 다양한 소스를 표면 장력을 낮추기 위해 용액에, 양이온 성 계면 활성제, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (CTAB)를 첨가하고, 테스트 포함애완 동물의. 계면 활성제의 첨가는 완전히는 아니지만, 비딩의 양을 감소시켰다. TFA 용매 용액 : 애완 동물 펠릿의 상업적 출처를 시도 후, 식품 등급 음료 병, PET 음료 병을 절단하고 DCM 이러한 용해하여 사용 하였다. PET 섬유 소스 균일 성 증가와 섬유 비딩의 감소의 결과로서이 사용. 중량 / 부피 8 %로 약간 용액 농도를 증가시키고 (23G에 18G) 바늘 직경을 감소시킴으로써 우리는 지속적으로 약 250 nm의 섬유 직경으로 결함이없는 나노 파이버를 만들었다. 전기 방사 나노 섬유 지지체는 어려운 비계의 수동 취급을 맨드릴에서 수집에 크게 정전이 될 수 있습니다. 이 회전하고 사용하기 전에 70 % IMS에 몸을 담근 후 알루미늄 호일의 발판을 저장하여 개선되었다. 이것은 전기 방사 과정에서 발판에 남은 잔여 정전 하를 방산하기 위해 나타났다.

최고를 제공하기 위해천천히, 무작위 정렬 나노 파이버가 생성 저농도 PET 용액을 전기 방사하여 : ographies기도 벽 내에 세 가지기도 세포 유형에 의해 발생한 각각의 미세 환경과 유사하게, 기본 전기 방사 프로토콜이 이러한 유형의 세포에 대한 세 가지 고유 골격을 생산하도록 채택 된 있는에 상피 세포 (RBM을 흉내 낸) 시드했다. 더 빠른 속도로 더 높은 농도 PET 용액을 전기 방사하여, 무작위 정렬 마이크로 섬유 (더 다공성 지지체의 제조)이되는 섬유 아세포 (RBM 바로 아래 서브 점막 영역을 흉내) 시딩 하였다 생성 하였다. 맨드릴 정렬 나노 파이버를 고속 회전에 저농도 PET 용액을 전기 방사하여, 섬유 배향 방향의 평활근 세포의 세포 시트를 제조하는 정렬 상으로 제작했다.

증가 된 섬유 직경이 큰 셀 penetratio있게 증가 기공 크기로 이어질N 발판으로 그렇게하는 것은, 진정한 3D 환경을 만드는 데 도움이. 마이크로 화이버 지지체는 세포가 지지체 내에서 여러면에 존재하는지 확인하기 위해 연구에서 섬유 아세포의 배양에 사용 하였다. 30 % 중량 / 부피에 PET의 농도를 증가시켜, 2.5 ㎛의 평균 직경을 가진 PET 섬유를 제조 하였다. 대경 섬유 (≈ 4 μm의)은 35 % 중량 / 부피 PET 용액을 사용하여 제조하였으나, 지지체 두께 균일 성이 손실되고, 개개의 섬유 사이에 높은 가변성이 명백했다. 마이크로 섬유 지지체의 기공 (각각 1.43 μm의 대 10.45 μm의) 나노 섬유 지지체로 측정보다 7 배 더 있었지만, 세포의 여전히 정적 시드 제한 세포 침투를 제공했다. 이는 동적 혼합기 궤도 이전 효과적인 것으로 방법을 사용하여 세포를 시딩함으로써 개선되었다.

매우 정렬 된 나노 섬유 지지체는 10 %를 전기 방사하여 만든중량 / 맨드릴 상 부피 애완 동물 솔루션은 2,000 rpm으로 회전 (≈ 440m · 분 -1). PET 섬유 농도가 낮은 농도에서 전시 불규칙한 물결 모양의 형태를 막기 위해 8 %로 증가 하였다. 섬유 배향 농도의 증가에도 불구하고, (랜덤 배향 대 216 내지 255 nm의 대) 평균 섬유 직경을 감소시켰다. 그들은 한 건조 전에 섬유 드로잉 맨드릴의 고속이 효과가 발생할 가능성이있다. 섬유의 배향 ASM 세포의 배향에 영향을, 또한 다른 21 특성화되었다 ASM 세포에 다른 생리 효과를 갖는다.

이 프로토콜의 주요 한계는 샘플을 희생하지 않고 결정하는 것은 불가능 장기간에 걸쳐 초기 세포 부착 또는 분화를 만들기 비계의 ON / 화상 생균에 없다는 것이다. 즉, 수정, 이것은 대부분의 최적화 배양 기간 이후에 발생하는 것을 의미샘플을 보내고 다음 세포 배양은 세포 배양시하지 후 성공 여부를 측정. (분홍색 파란색) 알라 마르 블루 배양 지지체의 색 변화를 관찰하면 세포가 존재하고 실행 가능한 있습니다 나타내지 만 적합하지 않습니다. 젤라틴과 같은 전기 방사 더 투명 고분자 지지체에 세포를 시각화에 도움을 수 있습니다. 우리의 모델 내에서 나노 섬유 지지체의 전기 방사 마찬가지로 상피 세포가 상주하는 고밀도 나노 섬유로 구성된기도 RBM의 복제를 허용했다. 이것은 이전에 면역 세포 (데이터 미도시) 할 수 있지만, 구조가 세포, 나노 섬유 지지체 (22)를 통해 이전 할 수있는 것으로 나타났다. 3 차원 표면에 특정 세포 유형의 배양하는데 유리하다 니 (상피 및 내피 세포와 같은)을 통해 나노 파이버 구조 세포 이동의 방지는 다른 종류의 세포 배양 해로울 수있다. 평활근은 일을 통해 마이그레이션 할 수 없습니다로E 정렬 나노 지지체 우리는 (두 종류의 세포를 분리 정렬 지지체 대향) 서로 마주 평활근 및 섬유 아세포 층과 3 중층 공 배양을 조립. 이 세포가 가까운 동격에있을 수 있습니다 반면, 본 연구는 하나의 셀 타입 (섬유 아세포 또는 평활근 하나) 더 장기간의 배양 기간 동안 전체 층을 따라 잡을 것이라는 결론을 내릴 수 없습니다. 이러한 제한에도 불구하고,기도 벽 가능한 트라이 레이어 모델이 여러 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하기 위해 다른 플랫폼을 제공하는 개발되었다. 섬유 아세포는 내가 내강면 (17) 내에서 외부 표면과 상피 세포에 접종 평활근과 하이드로 겔 원통형 콜라겐에 포함 된 경우와 유사한 3 중층 연구는 최근에 출판되었습니다. 유사한 관상을 허용 여기 개발 전기 방사 비계의 기계적 안정성이 형성되도록 구축하고, 현재 resea의 유지RCH는 우리 그룹 내에서 목표로하고 있습니다. 연구이 연구에서 강조 바디 주 내의 여러 장기 기본적인 점막 구조 단위 및 세입자 수정을 통해기도에 집중했다 반면, 유사한 플랫폼은 혈관, 방광 포함 기저막 유닛을 함유하는 조직을 위해 개발 될 수있다 콜라겐 기반 다중 레이어 모델을 채용 한 각막.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene terephthalate (PET) Lucozade (GSK) bottles N/A Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary
Dichloromethane (DCM) Solvent for PET
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Solvent for PET
Rotating Mandrel Built in house Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented
Syringe Pump Harvard apparatus used in the electrospinning process
DMEM-F12 Gibco Culture medium for CALU3 cells
DMEM Gibco Culture medium for HASM cells
MEM Gibco Culture medium for MRC5 cells
Antibiotic/ antimycotic solution Gibco Media supplement
FCS Gibco Media supplement
Orbital mixer (Orbital shake 503) Stuart Scientific For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds
Peristaltic Pump  Watson Marlow For providing media flow through bioreactor
3DKube Kiyatec Bioreactor for 3D cell culture

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References

  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372, (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19, (5), 646-651 (2013).
  3. Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174, (11), 1171-1173 (2006).
  4. Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37, (7), 973-988 (2007).
  5. Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297, (3), L401-L410 (2009).
  6. Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27, (8), 1251-1258 (2006).
  7. Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109, (10), 2630-2641 (2012).
  8. Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21, (21), 2161-2164 (2009).
  9. Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26, (28), 5624-5631 (2005).
  10. Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45, (14), 215-227 (2006).
  11. Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301, (1-2), 241-249 (2007).
  12. Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
  13. Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97, (5), 1318-1328 (2007).
  14. Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197, (3), 351-360 (2012).
  15. Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, (10 pt 2), S28-S38 (2001).
  16. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378, (9808), 1997-2004 (2011).
  17. Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
  18. West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, (1), L4-L16 (2013).
  19. Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. (2014).
  20. Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4, (3), 340-351 (2011).
  21. Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, (1), L38-L47 (1999).
  22. Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6, (3), 035014 (2014).
  23. Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2, (4), 522-553 (2010).
  24. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96, (2), 557-569 (2005).
  25. Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1, (2), 171 (2013).
  26. Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38, (12), 1231-1243 (2001).
  27. Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
  28. Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1, (1), 10-25 (2012).
  29. Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. 460 (2008).
  30. Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15, (2), 437-444 (2009).
  31. Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6, (1), 16-25 (2012).
  32. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14, (4), 319-331 (2008).
  33. Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7, (4), 3106-3135 (2014).
  34. Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15, (9), (2009).
  35. Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31, (5), 341-346 (2003).
  36. Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170, (4), 251-257 (2002).
  37. Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88, (4), 560-565 (2004).
전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델
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Bridge, J. C., Aylott, J. W., Brightling, C. E., Ghaemmaghami, A. M., Knox, A. J., Lewis, M. P., Rose, F. R. A. J., Morris, G. E. Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall. J. Vis. Exp. (101), e52986, doi:10.3791/52986 (2015).More

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