Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Le domaine de la médecine régénératrice et du génie tissulaire progresse rapidement, avec des percées dans la trachée et les reins régénération deux dernières réalisations notables. Les biomatériaux développés dans l'ingénierie tissulaire sont de plus en plus accessible, avec des possibilités de transfert de ces protocoles à des laboratoires moins spécialisés. Un domaine amorcée à bénéficier en augmentant l'utilisation de biomatériaux est de diagnostic in vitro.
Des études in vitro sont une plate-forme importante pour enquêter sur les voies de signalisation intracellulaires dans types de cellules simples, et ont contribué à délimiter les mécanismes sous-jacents de nombreux pathophysiologies de la maladie. Ces études reposent généralement sur un type de cellule unique en culture en monocouche sur plastique de culture de tissus (TCP); un (2D) de surface à deux dimensions beaucoup moins rigide et élastique poreux que les cellules (3D) de l'environnement en trois dimensions sont exposés à l'intérieur d'un tissu ou un organe. Des modèles animaux ont été traditionnellement employed pour confirmer les effets constatés in vitro aussi se traduire pour les tissus ensemble, et peut également être utilisé comme plate-forme pré-cliniques pour étudier les maladies humaines. Toutefois, les différences inter-espèces minent cette dépendance sur des modèles animaux dans notre compréhension des maladies humaines -. Par exemple, beaucoup de compréhension de l'asthme de la maladie du poumon est basée sur un modèle de souris malgré les différences inhérentes entre la condition humaine et ce modèle dont peu de preuves de l'infiltration des mastocytes du bon faisceau musculaire des voies respiratoires, ou la capacité de développement de la maladie spontanée au sein de l'animal modéliser 3,4. Il ya aussi des considérations éthiques relatives à l'utilisation de modèles animaux, avec la norme «3R» de «remplacement, raffinement, et la réduction" de l'expérimentation animale est encouragé au Royaume-Uni et d'autres pays.
Une alternative intéressante serait la récapitulation de tissus humains in vitro structure de créations pour enquêter sur la nature coopérative entre les types de cellules humaines adultes dans une seule unité. Les cellules existent dans des formes multi-cellulaires dans le tissu 3D, chacun dans un micro-environnement unique. La culture de cellules sur TCP permet seulement la culture de monocouches de cellules, incapables de reproduire cet environnement ou fournir la capacité de la culture à cellules multiples. Biomatériaux avancement fournit l'occasion de développer les deux plates-formes naturelles et synthétiques 3D pour la culture cellulaire. ECM décellularisé peut être utilisé pour la culture cellulaire 3D lorsque recellularized avec d'autres types cellulaires, notamment les cellules souches 1, cependant de tels protocoles peut être complexe et prendre du temps, de la disponibilité limitée de tissu et en grande partie d'origine non humaine. Autres protocoles permettent plus de contrôle sur les environnements cellulaires créées comme par nano-impression, le dépôt de l'ECM, les technologies de la feuille de cellule ou électrofilature. Électrofilage crée tapis poreux 3D non-tissé de fibres avec des diamètres allant de nanomètres à micromètre, replicating dimensions ECM naturelles. Échafaudages électrofilées sont de plus en plus utilisées comme plates-formes 3D de culture de cellules -. Manipulation des paramètres Électrofilage permet un contrôle plus complexe caractéristiques d'échafaudage tels que la taille des pores, le diamètre des fibres, de la topographie et de l'alignement, et la chimie de surface. On a montré que des altérations de ces paramètres à affecter directement l'adhésion cellulaire et de croissance, lorsque les cellules ont été cultivées de manière isolée.
Ces avantages ont été exploitées dans la présente étude pour permettre la mise en culture de plusieurs types de cellules comme une seule construction de tissu en 3D, en utilisant la bronchiole des voies aériennes en tant que structure de tissu 3D du modèle. La paroi des bronchioles se compose de trois régions principales (Figure 1). La muqueuse est où les cellules épithéliales des voies respiratoires sont assis à l'interface air-liquide (ALI), fournissant une barrière importante à l'environnement extérieur. Ils se trouvent sur la membrane réticulaire sous-sol (RBM), un ECM étroitement compact constitué principalement de collagen IV, perlecans et laminines. La couche de sous-muqueuse se trouve directement au-dessous de la muqueuse, une région plus poreuse composée de plusieurs types de cellules, y compris les fibroblastes, les myofibroblastes et les leucocytes infiltrants dans des conditions pathologiques. Enfin faisceaux de muscle lisse des voies aériennes enveloppent de façon hélicoïdale, et sont constitués de feuilles alignées de muscle lisse des voies aériennes (EAM). Il est l'état de contraction relative du muscle lisse des voies aériennes qui contrôle le ton. L'emploi d'échafaudages électrofilées dans le système pulmonaire avait jusqu'à récemment été limitée à des fins de régénération; avec un remplacement de la trachée électrofilé transplanté avec succès. Alors que réussie, ces traitements sont limités en nombre, et se concentrent sur la trachée en raison de la nature relativement simple de la fonction du tissu. Exemples limité de modèles des voies aériennes utilisées pour le diagnostic in vitro existent, et sont principalement axées sur des mesures de contraction du muscle lisse,. Le non-toxique et aucunen-dégradable polyéthylène polymère téréphtalate (PET) a déjà été électrofilées, et a été employé dans la présente étude pour assurer échafaudages produits pourraient être stockés pendant de longues périodes sans dégrader (leur permettant d'être utilisés "off the shelf"), et également convenir pour la culture cellulaire stable sur des périodes de temps prolongées. Des études antérieures de notre groupe ont montré que l'utilisation de trois variantes d'un protocole d'électrofilage de base, trois individuels échafaudages PET électrofilées peuvent être produites pour fournir topographies optimales pour épithéliales en culture des voies respiratoires, des fibroblastes et des cellules musculaires lisses dans l'isolement 21,22 et la co-culture de voies les cellules epitheliales et fibroblastes 22. Le diamètre des fibres a été trouvé à affecter considérablement la fonctionnalité épithéliale 22, et l'alignement des fibres a permis la génération de feuilles alignées de muscle lisse 21. Ces études ont été réalisées indépendamment l'une de l'autre dans des conditions statiques. Dans la présente étude, ces différeéchafaudages nt, contenant des cellules humaines adultes complètement différenciées ont été co-cultivées pendant une semaine à l'ALI dans un bioréacteur disponible dans le commerce comme une section 3D de la paroi des voies aériennes, fournissant un physiologiquement pertinente dans le modèle in vitro pour étudier les réponses des voies aériennes inter-cellulaires. Bien que ce protocole est d'utiliser la bronchiole des voies aériennes en tant que système modèle, il pourrait être adapté en tant que plate-forme pour la co-culture 3D de la muqueuse des unités provenant d'autres organes.
La capacité de electrospin fibres polymères ayant des propriétés structurales comparables à ECM naturel a conduit à de nombreux polymères naturels ou synthétiques, ou des mélanges de polymères étant électrofilé à recréer ces environnements,. La manipulation des paramètres du processus (y compris le choix de polymère, la concentration de polymère, solvant, la distance de la pointe de l'aiguille et de la température) peuvent toutes les caractéristiques influence d'échafaudage; certains paramètres peuvent cependant avoir un plus grand impact sur les propriétés d'échafaudage que d'autres 25,. Lors de la modification diamètre des fibres PET, on a trouvé des paramètres clés de la concentration du polymère utilisé, la vitesse à laquelle la solution de polymère était électrofilé, et le diamètre de l'aiguille. Lorsque électrofilature fibres alignées les paramètres clés sont la méthode de collecte utilisé (un mandrin en rotation), et la vitesse à laquelle les de mandrin tourne. Grâce à la réduction de la vitesse de mandrin à 60 tours par minute, nous avons trouvé les échafaudages alignés au hasard produits ont montré une plus grande échafaudage uniconformité par rapport à électrofilature sur une plaque de collecteur plat.
Les caractéristiques des tissus des voies respiratoires décellularisée ont été analysés pour donner des conseils pour les différentes topographies d'échafaudage développés pour la culture de chaque type de cellule des voies aériennes. nanofibres de électrofilées sont un échafaudage attrayante à reproduire les structures de la membrane basale en raison de la petite taille des pores, mais porosité globale élevée qui permet une diffusion accrue de métabolite tout en restreignant le mouvement cellulaire. 9 tout en optimisant les paramètres de électrofilage, une gamme de concentrations en PET et les débits ont été testés. Les fibres les plus minces ont été obtenus en utilisant une solution en poids / volume de PET de 6%, déjà utilisée par d'autres groupes. Cependant, les niveaux élevés de perles, et un manque d'uniformité des problèmes constants. Les tentatives initiales pour enlever le bourrelet comprenaient l'addition d'un tensioactif cationique, le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), à la solution pour abaisser la tension de surface, et de tester diverses sourcesde PET. L'ajout de tensioactif réduit la quantité de perles, mais pas entièrement. Après avoir essayé un certain nombre de sources commerciales de granulés de PET, boisson de qualité alimentaire bouteille PET a été utilisé, en découpant des bouteilles de boisson et la dissolution de ceux-ci dans le DCM: solution de solvant TFA. L'utilisation de ce que la source PET a donné lieu à une augmentation de l'uniformité de la fibre et une réduction des perles de fibres. En augmentant la concentration de la solution légèrement à 8% en poids / volume et en réduisant le diamètre de l'aiguille (18G à 23G), nous avons produit constamment des nanofibres sans défaut avec un diamètre de fibre d'environ 250 nm. Échafaudages de nanofibres électrofilées peuvent être très électrostatique lors de la collecte du mandrin faisant la manutention manuelle des échafaudages difficiles. Cela a été améliorée par le stockage des échafaudages dans une feuille d'aluminium après le filage et le trempage dans 70% IMS avant utilisation. Cela semble pour aider à dissiper la charge électrostatique résiduelle sur l'échafaud du processus d'électrofilage.
Pour fournir topographies similaire aux micro-environnements particuliers rencontrés par les trois principaux types de cellules des voies respiratoires au sein de la paroi des voies aériennes, un protocole d'électrofilage de base a été conçu pour produire trois échafaudages uniques pour ces types de cellules: par électrofilage une solution à faible concentration en PET lentement, nanofibres alignées au hasard ont été générées, sur lequel les cellules épithéliales ont été ensemencées (mimant la GAR). Par électrofilage d'une solution de concentration plus élevé PET à un rythme plus rapide, des microfibres alignées au hasard ont été générées (production d'un échafaudage poreux plus), dans lequel des fibroblastes ont été ensemencés (mimant immédiatement la zone de sous-muqueuse sous la GAR). Par électrofilage d'une solution à faible concentration de PET sur un mandrin en rotation à grande vitesse des nanofibres alignées ont été produites, sur laquelle les cellules musculaires lisses orientées dans la direction des fibres, la production de feuilles de cellules alignées.
L'augmentation des diamètres des fibres conduisent à une augmentation de la taille des pores, ce qui permet une plus grande penetratio cellulairen en échafaudages et ainsi aider à créer un véritable environnement 3D,. échafaudages en microfibres ont été utilisées pour la culture de fibroblastes dans l'étude pour s'assurer que les cellules résidaient sur plusieurs plans au sein de l'échafaudage. En augmentant la concentration de PET à 30% en poids / volume, de fibres de PET ayant un diamètre moyen de 2,5 um ont été produites. Fibres de plus de diamètre (≈ 4 pm) ont été produites en utilisant une solution à 35% de PET en poids / vol, mais l'épaisseur de l'uniformité échafaudage a été perdu, et une plus grande variabilité entre les fibres individuelles était apparente. Pores à l'échafaud en microfibre étaient plus de 7 fois supérieures à celles mesurées dans les échafaudages de nanofibres (10,45 vs 1,43 um um respectivement), mais toujours statique ensemencement des cellules fournies pénétration cellulaire limitée. Cela a été amélioré de façon dynamique en ensemençant les cellules en utilisant un agitateur orbital, un procédé révélé efficace précédemment.
Échafaudages de nanofibres hautement alignées ont été créés par électrofilage 10%poids / solution de PET de vol sur le mandrin tournant à 2000 rpm (≈ 440 m · min -1). La concentration PET a augmenté de 8% pour éviter une morphologie en forme d'onde irrégulière que les fibres exposées à des concentrations inférieures. Malgré l'augmentation de la concentration, en alignant les fibres réduit le diamètre moyen de la fibre (216 nm contre 255 nm, aligné contre aléatoire). La grande vitesse de l'étirage des fibres avant qu'elles ont séché mandrin est susceptible de provoquer cet effet. L'alignement des fibres influencé l'alignement des cellules ASM, et a aussi d'autres effets physiologiques sur les cellules de l'ASM qui ont été caractérisées ailleurs 21.
La principale limitation de ce protocole est l'incapacité de cellules vivantes d'image sur / dans les échafaudages faisant adhérence cellulaire ou la différenciation initiale sur une période de temps prolongée impossible de déterminer sans sacrifier échantillons. Cela signifie plus d'optimisation survient après la période de culture, à savoir, fixertion des échantillons et en mesurant ensuite si la culture cellulaire a été un succès après pas au cours de la culture cellulaire. L'observation d'un changement de couleur dans les échafaudages incubés dans alamarBlue (bleu à rose) indique cellules sont présentes et viable, mais est pas idéal. Électrofilage plusieurs polymères transparents, tels que la gélatine pourraient aider à visualiser les cellules sur les échafaudages. L'électrofilage d'un échafaudage à l'intérieur de nanofibrous notre modèle a permis à la réplication de la GAR des voies respiratoires, de manière similaire constituée de nanofibres denses sur lequel résident les cellules épithéliales. Il a été montré précédemment que les cellules de structure ne peut pas migrer à travers l'échafaudage de nanofibres 22, bien que des cellules immunes sont capables de (données non présentées). Bien avantageux pour la culture de types de cellules spécifiques sur une surface 3D (tels que cellules epitheliales et endotheliales), cette prévention de la migration des cellules de structure à travers les nanofibres peuvent être nuisibles pour la culture d'autres types de cellules. Comme le muscle lisse est incapable de migrer à travers ee nanofibres alignées échafaud on assemble la coculture de trois couches avec le muscle lisse et des couches de fibroblastes face de l'autre (par opposition à l'échafaud alignés séparant les deux types de cellules). Bien que cela permet aux cellules d'être en apposition proche, l'étude actuelle ne peut pas déterminer si un type de cellule (que ce soit le muscle lisse ou de fibroblastes) dépasserait la totalité de la couche au cours d'une période de culture plus longue. En dépit de ces limitations, un modèle tri-couche viable de la paroi des voies aériennes a été développé qui fournit une plate-forme alternative pour étudier les interactions entre ces multiples types cellulaires. Une étude à trois couches similaire a récemment été publiée où les fibroblastes ont été incorporées dans un hydrogel de collagène I cylindrique avec muscle lisse ensemencées sur la surface externe et les cellules epitheliales à l'intérieur de la surface luminale 17. La stabilité mécanique des échafaudages électrofilées développés ici permettrait tubulaire semblable construit à former, et reste un courant recrch but au sein de notre groupe. Alors que l'étude a porté sur les voies respiratoires, plusieurs organes au sein de la part du corps cette unité structurelle de la muqueuse de base, et en modifiant les locataires mis en évidence dans cette étude, les plates-formes similaires pourraient être développés pour les tissus contenant une unité de la membrane basale, y compris les vaisseaux sanguins, la vessie et la cornée, où collagène modèles multi-couches à base ont été employées.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |