Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
再生医療や組織工学の分野は急速に気管および腎臓再生にブレークスルー2つの注目すべき最近の成果で、進んでいます。組織工学で開発された生体材料は、以下の特殊な研究室にこのようなプロトコルを転送する機会を、より身近になってきています。生体材料の使用の増加を介して利益を得るためにプライミングされた1つのフィールドは体外診断です 。
インビトロ研究は、単一の細胞型内の細胞内シグナル伝達経路を調査するための重要なプラットフォームであり、多数の疾患の病態生理のメカニズムを描写役立っています。これらの研究は、一般的に組織培養プラスチック(TCP)上の単層として培養され、単一の細胞型に依存しています。はるかに少ない弾性多孔質の三次元(3D)環境の細胞よりも、二次元(2D)の剛性面は、組織または器官内に露出しています。動物モデルは、伝統的に電子されていますまた、全体の組織に変換インビトロで見出さ効果を確認するためにmployed、またヒト疾患を研究するために、前臨床のプラットフォームとして使用することができます。しかし、種間の差は、ヒト疾患の理解に動物モデルでこの信頼を弱体化させます– 。例えば、肺疾患、喘息の多くの理解が少し気道平滑筋束の肥満細胞の浸潤の証拠、又は動物内の自発的な病気の開発のための能力を含む人間の条件とこのモデル間の固有の違いにもかかわらず、マウスモデルに基づいていますモデル3,4。動物モデルの使用に関する倫理的配慮は、英国およびその他の国で奨励されている動物実験で「交換、洗練、および削減」の "3Rに「標準でもあります。
魅力的な代替手段は、 インビトロ作成構造にヒト組織の要約になりますSは、単一のユニットで成人ヒト細胞型の間の協力的な性質を調べました。細胞は、ユニークな微小環境内の各組織内の3D多細胞構造に存在しています。 TCP上の細胞の培養は、この環境を複製することができ、細胞単層の培養を可能にする、または多細胞培養のための容量を提供します。生体材料の進歩は、細胞培養のための天然および合成3Dの両方のプラットフォームを開発する機会を提供します。脱細胞化ECMは、幹細胞1を含む他の細胞型に再細胞化するとき、しかしながら、このようなプロトコルは限られた組織との大部分は非ヒト由来の利用可能で、複雑で時間がかかる可能性が3D細胞培養のために使用することができます。他のプロトコルは、ナノインプリント、ECM沈着、細胞シート技術、またはエレクトロスピニングとして作成された細胞環境をより細かく制御を可能にします。エレクトロスピニングは、r、ナノメートルからマイクロメートルの範囲の直径を有する繊維の不織布3D多孔質マットを作成します天然ECM寸法をeplicating。エレクトロ足場はますます3D細胞培養プラットフォームとして採用されています– 。エレクトロスピニング·パラメータの操作は、このような細孔径、繊維径、地形や配置、表面の化学的性質などの足場特性上の複雑な制御を可能にします。細胞を単独で培養したときにこのようなパラメータの変化は、直接、細胞接着および増殖に影響を与えることが示されています。
これらの利点は、モデルの3次元組織構造などの細気管支気道を用いて、単一の3次元組織構築物として、複数の細胞型の培養を可能にするために、本研究で利用されています。細気管支壁は、3つの主要な領域( 図1)で構成されています。気道上皮細胞は、外部環境への重要な障壁を提供し、気液界面(ALI)で座る場所粘膜です。彼らはしっかりとコンパクトECMは主collagの構成、網状基底膜(RBM)に常駐しますアンIV、perlecans、およびラミニン。サブ粘膜層を直接粘膜、疾患状態の下で、線維芽細胞、筋線維芽細胞および浸潤性白血球を含む複数の細胞型からなる複数の多孔質領域の下に見出されます。最後に、平滑筋束が螺旋状に気道の周りをラップし、気道平滑筋(ASM)の整列したシートで構成されています。これは、気道の緊張を制御する平滑筋の相対的な収縮状態です。肺系内のエレクトロ足場の使用は最近まで回生の目的に限定されていました。エレクトロ気管の交換が正常に移植されていると。成功した一方で、そのような治療は数に制限されており、組織の機能の相対的な単純な性質のために気管に焦点を当てています。 インビトロ診断に使用される気道モデルの限定例は、存在し、主に平滑筋収縮の測定に焦点を当てています。非毒性なしn型分解性ポリマー、ポリエチレンテレフタレート(PET)は、以前に電界紡糸された、生成足場を確保するために、本研究で使用した劣化させずに長期間保存することができる(それらは「既製」を使用することを可能にする)、また、適切です長期間にわたって安定した細胞培養。我々のグループからの以前の研究は、基本的なエレクトロプロトコルの3つのバリエーションを用いて、3つの個別のPETのエレクトロ足場は分離21,22と気道の共培養中に気道上皮、線維芽細胞、および平滑筋細胞を培養するための最適なトポグラフィを提供するように製造することができることを示しました上皮細胞と線維芽細胞22。繊維径が大きく、上皮機能22に影響を与えることが見出され、繊維配向は、平滑筋21の整列したシートの生成をさせました。これらの試験は、静的条件下で、互いに独立して行われました。本研究では、これらのdiffere完全に分化した成人ヒト細胞を含むヌクレオチド骨格は、気道間の細胞応答を調査するためにインビトロモデルにおける生理学的に適切に提供する、気道壁の3D部として市販のバイオリアクター中でALIで1週間共培養されました。このプロトコルは、モデル系として細気管支気道を使用している一方、それは他の器官からの粘膜部の3次元共培養のためのプラットフォームとして適合させることができます。
天然 ECMに匹敵する構造特性を有するポリマー繊維をエレクトロスピニングする能力は、多数の天然または合成ポリマーにつながっている、またはポリマーブレンドは、これらの環境を再現するためのエレクトロスピニングされます。 (ポリマーの選択、ポリマー濃度、溶媒、針先端の距離、温度など)のプロセスパラメータができ、すべての影響足場特性の操作。しかし、いくつかのパラメータは、他の25以上の足場特性に大きな影響を与える可能性があります。 PETの繊維径を変更する場合、我々は、重要なパラメータは、使用されるポリマーの濃度は、ポリマー溶液を電界紡糸されたときの速度、および針の直径であることが判明しました。整列した繊維をエレクトロスピニングするときの重要なパラメータは、(回転マンドレル)使用収集方法、および速度でマンドレル回転です。 60回転にマンドレル速度を低下を通じて、産ランダムに整列足場は大きな足場ユニを示したが見つかりましたフラット集電板上にエレクトロスピニングに比べformity。
脱細胞化気道組織の特性は、それぞれの気道細胞型の培養のために開発された様々な足場トポグラフィためのガイダンスを提供するために分析しました。電界紡糸ナノ繊維は、細胞の移動を制限しながら、増加した代謝産物の拡散を可能にする小さい孔サイズが、高い全体的な多孔性に起因する基底膜の構造を複製するための魅力的な足場である。9エレクトロスピニング·パラメータを最適化する一方で、PETの濃度および流速の範囲を試験しました。最も細い繊維は、以前に他のグループによって使用される6% 重量/容量の PET溶液を用いて達成されました。しかし、ビーズ、および均一性の欠如の高いレベルは、一定の問題がありました。ビーズを除去するための最初の試みは、表面張力を低下させるために溶液に、カチオン性界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)を添加し、さまざまなソースをテスト含まPETの。界面活性剤の添加がなく、完全に、ビーズの量を減少させました。 TFA溶媒溶液:PETペレットの商業的供給源の数を試した後、食品用ドリンクボトルPETは、飲料ボトルを切断し、DCM中にこれらを溶解することにより、使用されました。 PET源としてこれを使用すると、繊維の均一性の増加および繊維ビーズの減少をもたらしました。 8% 重量/体積にわずかに溶液濃度を増加させ、針の直径(23Gと18G)を減少させることによって、我々は一貫して、約250nmの繊維径を有する欠陥のないナノ繊維を製造しました。エレクトロナノファイバー足場は、難しい足場の手動操作を行うことマンドレルから収集時に高静電することができます。これは、スピンし、使用前に70%IMS中に浸漬した後、アルミ箔で足場を格納することによって改善されました。これは、エレクトロスピニングプロセスの足場上に残っ残留静電荷を消散を助けるように見えました。
トップを提供するために、、ゆっくりと、ランダムに整列ナノファイバーが生成された低濃度PET溶液をエレクトロスピニングすることにより:ographies気道壁内の3つの主な気道細胞型で発生した個々の微小環境と同様に、基本的なエレクトロスピニングプロトコルは、これらの細胞型のための3つのユニークな足場を生成するように構成されましたその上に上皮細胞(RBMを模倣)に播種しました。速い速度で高濃度PET溶液をエレクトロスピニングすることにより、ランダムに整列マイクロファイバーは、(RBM直下のサブ粘膜領域を模倣する)、線維芽細胞を播種したその中に 、(より多くの多孔質足場を生成する)を作製しました。マンドレル整列ナノファイバーを回転高速に低濃度PET溶液をエレクトロスピニングすることによって細胞の位置合わせシートを製造する、平滑筋細胞は、繊維方向に配向し、その上に、作製しました。
増加した繊維直径は大きい細胞penetratioを可能に増加細孔サイズにつながりますnは足場にし、そうすることは、真の3D環境を作成するのに役立ちます。マイクロファイバー足場は、細胞が足場内の複数の面上に置かことを確実にするための研究で、線維芽細胞の培養に使用しました。 30% 重量/容量のPET濃度を増加させることによって、2.5ミクロンの平均直径を有するPET繊維を製造しました。より大きな直径の繊維(≈4μm)を35% 重量/体積 PET溶液を用いて製造したが、足場の厚さの均一性が失われ、そして個々の繊維の間の高い変動性が明らかでした。マイクロファイバー足場の細孔(それぞれ1.43ミクロン対10.45μm)でナノファイバー足場に測定したものよりも7倍以上であったが、限られた細胞透過を提供する細胞の静止静的播種。これは、動的にオービタルミキサー、以前に有効であることが示された方法を用いて細胞を播種することによって改善されました。
高度に整列ナノファイバー足場は、10%をエレクトロスピニングによって作成されました2000回転(≈440メートル·分-1)で回転するマンドレル上に重量/容量の PETソリューション。 PETの濃度は、繊維が低濃度で発揮不規則な波のような形態を防ぐために、8%から増加しました。繊維を整列させる濃度の増加にもかかわらず(ランダム対整列216ナノメートル対255ナノメートル)の平均繊維直径を減少させました。それらが乾燥する前に、繊維を引き出すマンドレルの高速は、この効果を引き起こす可能性があります。繊維の配向は、ASM細胞のアラインメントに影響を与え、また、他の場所で21特徴付けされたASM細胞における他の生理学的効果を有します。
このプロトコルの主な制限は、サンプルを犠牲にすることなく決定することは不可能長時間にわたって初期細胞付着または分化を行う足場内/上の画像生細胞にできないことです。これは、ほとんどの最適化は、培養期間後に発生する手段、 すなわち、修正しますサンプルるし、その後、細胞培養は、細胞培養中ではないの後に成功したかどうかを測定します。アラマーブルー(ピンクと青)でインキュベートした足場の色変化を観察する細胞が存在し、生存可能であることを示しますが、理想的ではありません。ゼラチンのようなエレクトロスピニングより透明ポリマーは、足場に細胞を可視化するのに役立つ可能性があります。我々のモデル内のナノファイバー足場のエレクトロスピニングは、同様に上皮細胞が置かれている高密度のナノ繊維からなる、気道RBMの複製を可能にしました。これは、以前に免疫細胞が(データは示していない)することが可能であるが、構造的な細胞は、ナノファイバー足場22を通って移動することができないことが示されています。 (例えば、上皮および内皮細胞など)は、3D表面の特定の細胞タイプの培養のために有利な一方、ナノ繊維構造を介した細胞遊走のこの防止は、他の細胞型の培養のために有害であり得ます。平滑筋は目を通って移動することができないように電子整列ナノファイバー足場は、我々は(2つの細胞型を分離整列足場に対向する面)互いに対向する平滑筋および線維芽細胞の層と三層共培養を組み立てます。これは、細胞が近い同格にすることを可能にする一方で、現在の研究では、一つの細胞型(線維芽細胞や平滑筋のいずれか)は、より長期の培養期間にわたって全層を追い越すことになるかどうかを結論付けることはできません。これらの制限にもかかわらず、気道壁の実行可能な三層モデルでは、これらの複数の細胞型の間の相互作用を研究するための別のプラットフォームを提供する開発されました。線維芽細胞は、平滑筋で私はヒドロゲル円筒状コラーゲンの中に埋め込 まれた場所同様の三層の研究は、最近公開されている腔表面17内外面と上皮細胞上に播種しました。ここで開発されたエレクトロ足場の機械的安定性は、同様の管状のコンストラクトを形成することを可能にし、現在のままであろうreseaRCHは、当社グループ内で目指しています。研究は、本研究で強調、本体共有内のいくつかの器官、この基本的な粘膜の構造単位と、テナントの修正を通して気道に焦点を当ててきた一方で、同様のプラットフォームは、血管、膀胱を含む基底膜の単位を含有する組織のために開発することができコラーゲンベースの多層モデルが採用されている角膜。
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |