Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
El campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos está avanzando rápidamente, con los avances en la tráquea y el riñón regeneración dos logros recientes notables. Los biomateriales desarrollados en la ingeniería de tejidos son cada vez más accesibles, con oportunidades para la transferencia de dichos protocolos a los laboratorios menos especializados. Un campo de cebada para beneficiarse a través de aumentar el uso de biomateriales es el diagnóstico in vitro.
Los estudios in vitro son una importante plataforma para investigar vías de señalización intracelulares en tipos de células individuales, y han ayudado a delinear mecanismos subyacentes numerosos fisiopatologías enfermedad. Estos estudios se basan generalmente en un solo tipo de células que se cultiva como una monocapa sobre plástico de cultivo de tejidos (TCP); un (2D) superficie rígida de dos dimensiones mucho menos elástica y porosa que las células (3D) entorno tridimensional están expuestos a dentro de un tejido u órgano. Los modelos animales han sido tradicionalmente correomployed para confirmar los efectos encontrados in vitro también traducir a todo el tejido, y también se puede utilizar como plataformas pre-clínicos para investigar enfermedades humanas. Sin embargo, entre las especies diferencias socavan esta confianza en los modelos animales en nuestra comprensión de las enfermedades humanas -. Por ejemplo, gran comprensión de la enfermedad pulmonar del asma se basa en un modelo de ratón pesar de las diferencias inherentes entre la condición humana y este modelo incluyendo poca evidencia de la infiltración de mastocitos del haz de músculo liso de las vías respiratorias, o la capacidad de desarrollo espontáneo de la enfermedad en el animal modelar 3,4. También hay consideraciones éticas relacionadas con el uso de modelos animales, con la norma "3Rs" de "reemplazo, refinamiento y reducción" en la experimentación animal que está siendo alentado en el Reino Unido y otros países.
Una alternativa atractiva sería la recapitulación de los tejidos humanos en la estructura de creación vitros para investigar la naturaleza de cooperación entre los tipos de células humanas adultas en una sola unidad. Existen células en estructuras multicelulares 3D dentro del tejido, cada uno dentro de un micro-entorno único. El cultivo de las células en TCP sólo permite la cultura de monocapas de células, incapaces de replicar este entorno, o proporcionar la capacidad para la cultura de varias celdas. Biomateriales avance ofrece la oportunidad de desarrollar ambas plataformas 3D naturales y sintéticos para el cultivo celular. ECM descelularizado se puede utilizar para el cultivo celular 3D cuando recelularizado con otros tipos de células, incluyendo células madre 1, sin embargo, tales protocolos pueden ser complejo y consume mucho tiempo, con la disponibilidad de tejido limitada y en gran parte de origen no humano. Otros protocolos permiten un mayor control sobre los entornos celulares creados como nanoimpresión, la deposición de ECM, las tecnologías de la hoja de la célula, o electrospinning. Electrohilado crea esteras porosas no tejidas 3D de fibras con diámetros que van desde nanómetros a micrómetros, replicating dimensiones ECM naturales. Andamios electrospun se están empleando cada vez más como plataformas de cultivo de células en 3D -. La manipulación de los parámetros de electrospinning permite el control intrincada sobre características de andamio, tales como tamaño de poro, diámetro de la fibra, la topografía y la alineación, y la química de superficie. Alteraciones de tales parámetros han sido demostrado que afectan directamente la adhesión celular y el crecimiento, cuando las células se cultivaron en el aislamiento.
Estas ventajas han sido explotados en el presente estudio para permitir el cultivo de múltiples tipos de células como una sola construcción de tejido 3D, utilizando el bronquiolo de las vías respiratorias como una estructura de tejido 3D modelo. La pared bronquiolo consta de tres regiones principales (Figura 1). La mucosa es donde las células epiteliales de las vías respiratorias se sientan en la interfase aire-líquido (ALI), proporcionando una barrera importante para el medio ambiente externo. Ellos residen en la membrana basal reticular (RBM), una ECM bien compacta compone principalmente de collagen IV, perlecans, y lamininas. La capa de sub-mucosa se encuentra directamente debajo de la mucosa, una región más porosa compuesta de múltiples tipos de células, incluyendo fibroblastos, miofibroblastos y la infiltración de leucocitos en condiciones de enfermedad. Finalmente haces musculares lisas envuelven alrededor de la vía aérea en una forma helicoidal, y se componen de hojas alineadas de músculo liso de las vías respiratorias (ASM). Es estado contráctil relativa del músculo liso que controla el tono de las vías respiratorias. El empleo de andamios electrospun dentro del sistema pulmonar había hasta hace poco ha limitado a fines regenerativos; con una sustitución traqueal electrospun siendo trasplantado con éxito. Mientras éxito, tales tratamientos son limitados en número, y se centran en la tráquea debido a la naturaleza relativamente simple de la función del tejido. Existen ejemplos limitadas de los modelos de la vía aérea se utilizan para diagnóstico in vitro, y se centran principalmente en las mediciones de contracción del músculo liso,. El no tóxico y non-degradable tereftalato de polietileno polímero (PET) ha sido previamente electrospun, y fue empleada en el presente estudio para asegurar andamios producidos podrían ser almacenados por largos períodos sin degradar (lo que les permite ser utilizados "off the shelf"), y también pueden ser adecuados para el cultivo celular estable durante períodos de tiempo prolongados. Los estudios previos de nuestro grupo han demostrado que el empleo de tres variaciones de un protocolo básico de electrospinning, tres andamios electrospun PET individuales pueden ser producidos para proporcionar topografías óptimas para el cultivo de las vías respiratorias epiteliales, fibroblastos y células del músculo liso en el aislamiento 21,22 y el cocultivo de las vías respiratorias células epiteliales y fibroblastos 22. Diámetro de fibra se encontró que afectará en gran medida la funcionalidad del epitelio 22, y la alineación de la fibra permite la generación de hojas alineadas de músculo liso 21. Estos estudios se realizaron de forma independiente el uno del otro en condiciones estáticas. En el presente estudio, estos difereandamios NT, que contienen células humanas adultas completamente diferenciada han sido cocultivadas durante una semana a la ALI en un biorreactor disponible comercialmente como una sección 3D de la pared de las vías respiratorias, proporcionando un fisiológicamente relevantes modelo in vitro para investigar las vías respiratorias respuestas inter-celulares. Mientras que este protocolo está utilizando el bronquiolo de las vías respiratorias como un sistema modelo, podría ser adaptado como una plataforma para el cocultivo 3D de unidades de la mucosa de otros órganos.
La capacidad de electrospin fibras poliméricas con propiedades estructurales comparables a ECM natural ha llevado a numerosos polímeros naturales o sintéticos, o mezclas de polímero que se está electrospun para recrear estos ambientes,. La manipulación de los parámetros del proceso (incluyendo la elección del polímero, la concentración de polímero,, distancia punta de la aguja disolvente y temperatura) ¿pueden todas las características de la influencia de andamios; sin embargo, algunos parámetros pueden tener un mayor impacto en las propiedades de andamios que otros 25,. Cuando la modificación de PET diámetro de la fibra, encontramos los parámetros clave a ser la concentración del polímero utilizado, la velocidad a la que la solución de polímero era electrospun, y el diámetro de la aguja. Cuando electrospinning fibras alineadas los parámetros clave son el método de recogida utilizado (un mandril giratorio), y la velocidad a la que gira el mandril. A través de la reducción de la velocidad del mandril a 60 rpm, encontramos los andamios alineados al azar producidos mostraron mayor uni andamiola conformidad en comparación con electrospinning sobre una placa de colector plano.
Se analizaron las características de los tejidos de las vías respiratorias descelularizado proporcionar orientación para las distintas topografías de andamios desarrollados por la cultura de cada uno de las vías respiratorias de tipo celular. Nanofibras electrohiladas son un andamio atractivo para replicar estructuras de la membrana basal debido al tamaño de poro pequeño pero de alta porosidad global que permite una mayor difusión metabolito mientras restringir el movimiento celular. 9 Mientras que la optimización de los parámetros de electrospinning, un intervalo de concentraciones de PET y las tasas de flujo fueron probados. Las fibras más finas se lograron utilizando una solución peso / vol PET 6%, utilizado anteriormente por otros grupos. Sin embargo, los altos niveles de abalorios, y una falta de uniformidad eran constantes problemas. Los intentos iniciales para eliminar el rebordear incluyeron la adición de un tensioactivo catiónico, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), a la solución para disminuir la tensión superficial, y prueba de varias fuentesde PET. La adición de tensioactivo redujo la cantidad de gotear, pero no completamente. Después de probar un número de fuentes comerciales de gránulos de PET, se utilizó botella de bebida de calidad alimentaria PET, cortando botellas de bebidas y disolviendo estos en el DCM: TFA solución de disolvente. Usando esto como la fuente de PET resultó en un aumento en la uniformidad de fibra y una reducción en fibra rebordear. Al aumentar la concentración de la solución ligeramente a 8% en peso / vol y reduciendo el diámetro de la aguja (18G a 23G) hemos producido consistentemente nanofibras defecto libres con un diámetro de fibra de aproximadamente 250 nm. Andamios nanofibras electrohiladas pueden ser altamente electrostática a la recogida del mandril haciendo la manipulación manual de los andamios difíciles. Esto fue mejorado mediante el almacenamiento de los andamios en papel de aluminio después de girar y sumergirse en un 70% IMS antes de su uso. Este apareció para ayudar a disipar la carga electrostática residual que queda en el patíbulo del proceso de electrospinning.
Para proporcionar la parte superiorographies similar a los microambientes individuales encontradas por los tres tipos de células de las vías respiratorias principales dentro de la pared de la vía aérea, un protocolo básico electrospinning se adaptó para producir tres andamios únicos para estos tipos de células: por electrospinning una solución de bajo PET concentración lentamente, se generaron nanofibras alineados al azar, en el que las células epiteliales se sembraron (imitando el RBM). Por electrospinning una solución PET concentración más alta a una velocidad mayor, se generaron microfibras alineadas al azar (produciendo un andamio más porosa), en las que se sembraron fibroblastos (imitando la zona sub-mucosa inmediatamente debajo de la RBM). Por electrospinning una solución de baja concentración de PET en una gran velocidad de rotación del mandril alineado nanofibras se produjeron, en el cual las células musculares lisas orientadas en la dirección de la fibra, produciendo capas de células alineadas.
Diámetros de las fibras sin mayor problema al aumento del tamaño de los poros, lo que permite una mayor penetratio celularn en los andamios y así ayudar a crear un verdadero entorno 3D,. Se emplearon los andamios de microfibra para el cultivo de fibroblastos en el estudio para asegurar que las células residían en múltiples planos dentro del andamio. Al aumentar la concentración de PET a 30% en peso / vol, se produjeron fibras de PET con un diámetro medio de 2,5 micras. Fibras de mayor diámetro (≈ 4 micras) se produjeron utilizando una solución de PET peso / volumen 35%, pero la uniformidad de espesor andamio se perdió, y la mayor variabilidad entre las fibras individuales era evidente. Los poros en el andamio de microfibra eran más de 7 veces mayor que los medidos en las nanofibras andamios (10.45 micras vs 1,43 micras, respectivamente), pero todavía estática siembra de las células proporcionan la penetración celular limitada. Esto se ha mejorado mediante la siembra de las células dinámicamente usando un mezclador orbital, un método demostrado ser eficaz previamente.
Andamios nanofibras altamente alineados fueron creados por electrospinning un 10%p / solución PET vol sobre el mandril que gira a 2000 rpm (≈ 440 m · min -1). La concentración de PET se aumentó de 8% para evitar una morfología similar a una onda irregular que las fibras expuestas a concentraciones más bajas. A pesar del aumento en la concentración, la alineación de las fibras reducido el diámetro promedio de la fibra (216 nm vs. 255 nm, alineado vs. aleatorio). La alta velocidad del mandril dibujo las fibras fuera antes de que se hayan secado es probable que cause este efecto. La alineación de las fibras influido en la alineación de las células ASM, y también tiene otros efectos fisiológicos en las células ASM que se han caracterizado en otra parte 21.
La principal limitación de este protocolo es la incapacidad de las células vivas imagen sobre / en los andamios que hacen las células apego o la diferenciación inicial durante un periodo de tiempo prolongado imposible determinar sin sacrificar muestras. Esto significa que la mayoría de optimización se produce después de que el período de cultivo, es decir, fijaring muestras y luego medir si el cultivo celular fue exitosa después de no durante el cultivo celular. La observación de un cambio de color en los andamios incubadas en alamarBlue (azul a rosa) indica células están presentes y viable, pero no es lo ideal. Electrospinning polímeros más transparentes tales como gelatina podrían ayudar en la visualización de las células en los andamios. El electrospinning de un andamio de nanofibras dentro de nuestro modelo permitió la replicación del RBM de las vías respiratorias, de manera similar compuesta de nanofibras densos en la que residen las células epiteliales. Previamente se ha demostrado que las células estructurales no puede migrar a través del andamio de nanofibras 22, aunque las células inmunes son capaces de (datos no mostrados). Mientras ventajoso para el cultivo de tipos de células específicas en una superficie 3D (tales como células epiteliales y endoteliales), esta prevención de la migración celular estructural a través de las nanofibras pueden ser perjudiciales para el cultivo de otros tipos celulares. Como el músculo liso no es capaz de migrar a través de THe alineados de nanofibras andamio que monta el tri-capas cocultivo con el músculo liso y capas de fibroblastos uno frente al otro (en oposición a la andamio alineados que separa los dos tipos de células). Mientras que esto permite que las células estén en estrecha aposición, el estudio actual no puede concluir si un tipo de célula (ya sea el fibroblasto o músculo liso) superaría toda la capa durante un período de cultivo más prolongado. A pesar de estas limitaciones, un modelo tri-capa viable de la pared de las vías respiratorias ha sido desarrollado que proporciona una plataforma alternativa para investigar las interacciones entre estos múltiples tipos de células. Un estudio tri-capas similar se ha publicado recientemente, donde los fibroblastos fueron incorporados dentro de un colágeno cilíndrica I hidrogel con músculo liso sembradas en la superficie exterior y células epiteliales dentro de la superficie luminal 17. La estabilidad mecánica de los andamios electrospun desarrollados aquí permitiría tubular similares construye a formar, y sigue siendo un resea actualrch objetivo dentro de nuestro grupo. Mientras que el estudio se ha centrado en la vía aérea, varios órganos dentro del cuerpo de la cuota de esta unidad estructural básica de la mucosa, y por medio de la modificación de los inquilinos de relieve en este estudio, plataformas similares podrían ser desarrollados para tejidos que contienen una unidad de membrana basal, incluyendo los vasos sanguíneos, la vejiga y la córnea, donde se han empleado modelos basados en múltiples capas de colágeno.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |