Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Området regenerativ medicin och tissue engineering snabbt framåt, med genombrott i luftrör och njure regenere två anmärkningsvärda nya landvinningar. De biomaterial utvecklas i vävnadsteknik blir mer tillgängliga, med möjlighet att överföra sådana protokoll till mindre specialiserade laboratorier. Ett område trimmade för att dra nytta genom att öka användningen av biomaterial är in vitro-diagnostik.
In vitro-studier är en viktig plattform för att undersöka intracellulära signalvägar inom enskilda celltyper, och har hjälpt beskriva mekanismerna bakom många pathophysiologies sjukdoms. Dessa studier bygger i allmänhet på en enda celltypen som odlas som ett monoskikt på vävnadsodlingsplast (TCP); en tvådimensionell (2D) stel yta betydligt mindre elastisk och porös än de tredimensionella (3D) miljö celler exponeras för inom en vävnad eller ett organ. Djurmodeller har traditionellt varit employed att bekräfta effekter som iakttas in vitro också översätta till hel vävnad, och kan även användas som prekliniska plattformar för att undersöka humana sjukdomar. Skillnaderna mellan arter gräva denna beroende av djurmodeller i vår förståelse av sjukdomar hos människan -. Till exempel, är mycket förståelse av lungsjukdom astma baserad på en musmodell trots inneboende skillnader mellan människans villkor och denna modell inklusive få tecken på mastcellinfiltration av luftvägarnas glatta muskulatur bunt, eller förmåga till spontan sjukdomsutveckling inom djuret modell 3,4. Det finns också etiska överväganden när det gäller användning av djurmodeller, med "3R" standard "ersättning, förfining och minskning" i djurförsök uppmuntras i Storbritannien och andra länder.
Ett attraktivt alternativ skulle vara rekapitulation av mänsklig vävnad in vitro skapa strukturs för att undersöka den kooperativa natur mellan vuxna typer humana cell i en enda enhet. Celler existerar i 3D flercelliga strukturer inom mjukpapper, var och en inom en unik mikromiljö. Odlingen av celler på TCP endast tillåter odling av cellmonoskikt, oförmögen att replikera denna miljö, eller ge kapacitet för multi-cellodling. Biomaterials avancemang ger möjlighet att utveckla både naturliga och syntetiska 3D plattformar för cellodling. Decellulariserade ECM kan användas för 3D cellodling när recellularized med andra celltyper inklusive stamceller 1, men sådana protokoll kan vara komplicerat och tidskrävande, med tillgång till vävnaden begränsad och till stor del av icke-mänskligt ursprung. Andra protokoll tillåter större kontroll över de cellulära miljöer skapade såsom nanoimprinting, ECM nedfall, teknik cell ark eller elektrospinning. Electro skapar non-woven porösa 3D mattor av fibrer med diametrar som sträcker sig från nanometer till mikrometer, replicating naturliga ECM dimensioner. Electrospun byggnadsställningar alltmer används som 3D cellodlings plattformar -. Manipulering av elektrospinning parametrar tillåter intrikata kontroll över ställnings egenskaper såsom porstorlek, fiberdiameter, topografi och justering och ytkemi. Förändringar i sådana parametrar har visat sig direkt påverka cellvidhäftning och tillväxt, när celler odlades i isolering.
Dessa fördelar har utnyttjats i föreliggande studie för att tillåta odling av flera celltyper som en enda 3D vävnadskonstrukt, med hjälp av luftvägs bronkiol som modell 3D vävnadsstruktur. Den bronchiole väggen består av tre huvudområden (Figur 1). Slemhinnan är där luftvägarna epitelceller sitta vid luft-vätskegränssnittet (ALI), vilket ger ett stort hinder för den yttre miljön. De bor på retikulära basalmembranet (RBM), en tätt kompakt ECM består huvudsakligen av collagsv IV perlecans och lamininer. Under slemhinneskiktet hittas direkt under slemhinnan, en mer porös region består av flera celltyper inklusive fibroblaster, myofibroblaster och infiltrerande leukocyter enligt sjukdomstillstånd. Slutligen glatt muskulatur buntar lindas runt luftvägarna i en spiralform, och består av inriktade ark av luftvägarnas glatta muskulatur (ASM). Det är den glatta muskulaturen relativa sammandragningstillstånd som styr luftvägstonus. Användningen av elektrospunna ställningar inom lungsystemet hade tills nyligen varit begränsad till regenerativa ändamål; med en electrospun trakeal Ersättning framgångsrikt transplanterade. Även framgångsrika, sådana behandlingar är begränsade i antal, och är inriktade på luftstrupen på grund av den relativa enkla karaktären av vävnadens funktion. Begränsade exempel på luftvägs modeller som används för in vitro-diagnostik finns, och är främst inriktade på släta mätningar muskelkontraktion,. Den icke-toxiska och ingenn-nedbrytbar polymer av polyetentereftalat (PET) har tidigare Electrospun, och användes i föreliggande studie för att säkerställa byggnadsställningar producerade kunde lagras under långa perioder utan att försämra (så att de kan användas "från hyllan"), och även vara lämpliga för stabil cellodling under längre tidsperioder. Tidigare studier från vår grupp har visat att användning av tre varianter av en grundläggande elektrospinning protokollet kan tre individuella PET elektrospunna byggnadsställningar ställas för att tillhandahålla optimala topografier för odling epitelceller i luftvägarna, fibroblast och glatta muskelceller i isolering 21,22 och samodling av luftvägarna epitelceller och fibroblastceller 22. Fiber diameter befanns kraftigt påverka epitel funktionalitet 22 och fiberinriktning tillät genereringen av inriktade ark av glatt muskulatur 21. Dessa studier utfördes oberoende av varandra under statiska förhållanden. I den föreliggande studien, dessa different ställningar, innehållande fullt differentierade vuxna humana celler har samodlades under en vecka vid ALI i en kommersiellt tillgänglig bioreaktor som en 3D-sektion av luftvägsväggen, vilket ger en fysiologiskt relevant in vitro-modell för att undersöka luftvägsinter cellulära svar. Även detta protokoll använder luftvägs bronchiole som ett modellsystem, skulle det kunna anpassas som en plattform för 3D samodling av slemhinnor enheter från andra organ.
Förmågan att electrospin polymerfibrer med strukturella egenskaper som är jämförbara med naturliga ECM har lett till ett stort antal naturliga eller syntetiska polymerer, eller polymerblandningar vara electrospun att återskapa dessa miljöer,. Manipulering av processparametrarna (inklusive polymer val, polymerkoncentration, lösningsmedel, nålspets avstånd och temperatur) kan alla påverka ställnings egenskaper; men vissa parametrar kan ha större inverkan på ställnings egenskaper än andra 25,. När modifiera PET-fiberdiameter, fann vi de nyckelparametrar vara koncentrationen av den använda polymeren, den hastighet med vilken polymerlösningen var electrospun, och nålens diameter. När elektrospinning inriktade fibrer de viktigaste parametrarna är insamlingsmetod som används (en roterande kärna), och den hastighet med vilken spindel roterar. Genom att reducera spindelhastigheten till 60 rpm, fann vi slumpmässigt inriktade byggnadsställningar producerade visade större byggnadsställning unistämmelse jämfört med elektrospinning på en plan samlingsplattan.
Egenskaperna hos decellulariserade luftvägsvävnad analyserades för att ge vägledning för de olika ställningskretsmönster som utvecklats för odling av varje luftvägs celltyp. Elektrospunna nanofibrer är ett attraktivt byggnadsställning för att replikera basalmembranstrukturer på grund av den lilla porstorleken men hög total porositet som medger ökad metabolit diffusion samtidigt begränsa cellulär rörelse. 9 Medan optimera elektrospinning parametrar, var ett intervall av PET-koncentrationer och flödeshastigheter testas. De tunnaste fibrerna uppnås med hjälp av en 6% vikt / vol PET lösning, som tidigare använts av andra grupper. Höga nivåer av beading, och brist på enhetlighet var ständiga problem. Initiala försök att avlägsna beading ingår tillsats av ett katjoniskt ytaktivt medel, cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB), till lösningen för att sänka ytspänningen och testa olika källorPET. Tillsatsen av tensid minskade mängden beading, men inte helt. Efter att ha provat ett antal kommersiella källor av PET-pellets, var livsmedelskvalitet dryck flaska PET används, genom att skära upp drycker flaskor och upplösning dessa i DCM: TFA lösningsmedelslösning. Med detta som PET källa resulterade i en ökning av fiber enhetlighet och en minskning av fiber beading. Genom att öka lösningens koncentration något till 8% vikt / volym och minska nåldiametern (18G till 23G) vi konsekvent producerat felfria Nanofiber med en fiberdiameter på ca 250 nm. Electrospun nanofiber ställningar kan vara mycket elektro i samband med hämtning från kärnan gör manuell hantering av byggnadsställningar svåra. Detta förbättrades genom att lagra ställningar i aluminiumfolie efter spinning och blötläggning i 70% IMS före användning. Detta visade sig bidra till att skingra den återstående elektrostatisk laddning kvar på schavotten från electroprocessen.
Att ge toppenographies liknar de enskilda mikromiljöer möter de tre huvudvägarna celltyper inom luftvägsväggen, var en grundläggande elektrospinning protokoll anpassad för att producera tre unika ställningar för dessa celltyper: genom elektrospinning en låg koncentration PET lösningen långsamt, randomiserades inriktade Nanofiber genereras, på vilken epitelceller såddes (härma RBM). Genom elektro en högre koncentration PET lösning i en snabbare takt, valdes slumpmässigt inriktade mikrofibrer alstras (som producerar en mer porös byggnadsställning), in i vilken fibroblaster ympades (mimicking omedelbart sub-mukosala området under RBM). Genom elektro en låg koncentration PET-lösningen på en hög hastighet roterande dorn inriktade nanofibrer producerades, på vilken glatta muskelceller orienterade i fiberriktn, producerar inriktade ark av celler.
Ökade fiberdiametrar leda till ökad porstorlek, vilket gör att större cell penetration till byggnadsställningar och så bidra till att skapa en verklig 3D-miljö,. Mikrofiber ställningar användes för odlingen av fibroblaster i studien för att säkerställa att cellerna bosatt på flera plan inom ställningen. Genom att öka PET-koncentrationen till 30% vikt / volym, var PET-fibrer med en genomsnittlig diameter av 2,5 | j, m produceras. Fibrer större diameter (≈ 4 um) framställdes med hjälp av en 35% vikt / vol PET lösning, men ställningen tjocklek enhetlighet förlorades, och högre variabilitet mellan enskilda fibrer var uppenbar. Porer i mikrofiber schavotten var över 7 gånger högre än de som uppmätts i nanofiber ställningar (10.45 pm vs 1,43 respektive pm), men fortfarande statisk sådd av celler under förutsättning begränsad cellulär penetration. Detta förbättrades genom att dynamiskt ympning av cellerna med användning av en orbital-blandare, en metod visat sig vara effektiv tidigare.
Mycket inriktade nanofiber ställningar skapades genom elektrospinning en 10%vikt / volym PET-lösningen på dornen roterande med 2000 varv per minut (≈ 440 m • min -1). Den PET-koncentrationen ökades från 8% för att förhindra en oregelbunden våg-liknande morfologi som fibrer uppvisade vid lägre koncentrationer. Trots den ökade koncentrationen och rikta in fibrerna minskade den genomsnittliga fiberdiametern (216 nm jämfört med 255 nm, i linje kontra slumpmässiga). Den höga hastigheten hos dornen dra fibrerna innan de har torkat är sannolikt att orsaka denna effekt. Anpassningen av fibrerna påverkade anpassningen av ASM celler, och har även andra fysiologiska effekter på ASM celler som har präglats på annat håll 21.
Den största begränsningen av detta protokoll är oförmågan att avbilda levande celler på / i ställningar gör ursprungliga cellfäst eller differentiering över en längre tidsperiod omöjligt att avgöra utan att göra avkall prover. Detta innebär att de flesta optimering inträffar efter odlingsperioden, det vill säga, fixaing prover och sedan mäta huruvida cellkultur lyckades efter inte under cellodling. Observation en färgförändring i byggnadsställningar inkuberade i alamarBlue (blå till rosa) visar celler är närvarande och livskraftiga, men är inte idealisk. Electro mer transparenta polymerer såsom gelatin kan hjälpa till att visualisera celler på byggnadsställningar. Den elektrospinning av en nanofibrous byggnadsställning inom vår modell tillät replikationen av luftvägs RBM, på liknande sätt består av täta nanofibrer där epitelcellerna bor. Det har tidigare visats att strukturella celler inte kan migrera genom nanofiber byggnadsställning 22, även om immunceller kan (data ej visade). Medan fördelaktig för odling av specifika celltyper på en 3D-yta (såsom epitel- och endotelceller), kan detta förebygga strukturell cellmigration genom Nanofiber vara skadligt för odling av andra celltyper. Som glatt muskulatur inte kan migrera genom the inriktade nanofiber schavotten vi samlat tri-lager coculture med den glatta muskulaturen och fibroblast skikt mot varandra (till skillnad från den linje schavotten som skiljer de två celltyper). Även om detta gör det möjligt för cellerna att stå i nära beröring, kan den aktuella studien inte dra slutsatsen huruvida en celltyp (antingen fibroblast eller glatt muskel) skulle gå om hela skiktet över en mer förlängd odlingsperiod. Trots dessa begränsningar, har en livskraftig treskikt modell av luftvägsväggen har utvecklats som ger en alternativ plattform för att undersöka samspelet mellan dessa olika celltyper. Ett liknande tre-skiktad studien har nyligen publicerats där fibroblaster var inbäddade i en cylindrisk kollagen I hydrogelen med glatt muskulatur ympas på den yttre ytan och epitelceller inom den luminala ytan 17. Den mekaniska stabiliteten hos de elektrospunna byggnadsställningar utvecklats här skulle tillåta liknande rörformade konstruktioner som skall bildas, och förblir en ström reseaRCH syftar inom vår grupp. Även om studien har fokuserat på luftvägarna, flera organ i kroppen dela denna grundläggande slemhinna konstruktionsenhet och genom att modifiera hyresgästerna lyfts fram i denna studie skulle liknande plattformar utvecklas för vävnader som innehåller en källare membranenhet inklusive blodkärl, urinblåsan och hornhinnan, där kollagenbaserade flerskiktade modeller har använts.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |