Abstract
Det store flertal af in vitro nanotoxicological studier har brugt udødeliggjort cellelinjer for deres funktionalitet. Imidlertid har resultaterne fra test nanopartikel toksicitet i udødeliggjort cellelinjer eller primære celler vist uoverensstemmelser, hvilket understreger behovet for at udvide anvendelsen af primære celler til in vitro-analyser. Denne protokol beskriver isoleringen af muselever makrofager, navngivne Kupffer-celler, og deres anvendelse til at studere nanopartikeltoksicitet. Kupffer-celler er de mest rigelige makrofag befolkning i kroppen og udgør en del af det retikuloendoteliale system (RES), der er ansvarlig for opsamling af cirkulerende nanopartikler. Kupffer cellerne isoleringsmetode rapporteret her, er baseret på en 2-trins perfusion metode efterfulgt af oprensning på densitetsgradient. Metoden, baseret på collagenasefordøjelse og densitet centrifugering, er tilpasset fra den oprindelige protokol udviklet af Smedsrød et al. designet til rottelever celle isolation og giver højt udbytte (op til 14 x 10 6 celler per mus) og høj renhed (> 95%) af Kupffer-celler. Denne isolation metode kræver ikke sofistikeret eller dyrt udstyr, og derfor repræsenterer en ideel kompromis mellem kompleksitet og celle udbytte. Brugen af tungere mus (35-45 g) forbedrer udbyttet af isolations- fremgangsmåden, men letter også bemærkelsesværdigt fremgangsmåden i portale vene kanyle. Toksiciteten af funktionaliserede kulstof-nanorør f -CNTs blev målt i denne model med den modificerede LDH-assay. Denne metode vurderer cellelevedygtighed ved måling af manglende strukturelle integritet af Kupffer cellemembran efter inkubering med f -CNTs. Toksicitet induceret af f -CNTs kan måles konsekvent anvendelse af dette assay, hvilket understreger, at isolerede Kupffer-celler er nyttige til test nanopartikeltoksicitet. Den overordnede forståelse af nanotoksikologi kunne drage fordel af sådanne modeller, hvilket gør udvælgelsen nanopartikel til klinisk oversættelse flere effektikelig.
Introduction
Feltet af nanotoksikologi forskning har til formål at karakterisere den biologiske effekt af nanopartikler. Toksikologiske undersøgelser er baseret på in vivo undersøgelser er fortsat de mest nøjagtige metoder. Imidlertid er deres anvendelse begrænset af deres omkostninger, arbejdskraft og tid krav 1. Som alternativer, in vitro assays er blevet anvendt på grund af deres enkelhed og muligheden for at udvikle high-throughput in vitro test platforme 2 - så at udvide antallet af testede betingelser. De fleste nanotoxicological undersøgelser udføres under anvendelse af in vitro-assays med immortaliserede cellelinier. Men der er bekymringer vedrørende ekstrapolation af disse eksperimentelle resultater til in vivo toksikologiske virkninger 3. Faktisk kan egenskaberne af immortaliserede cellelinjer være signifikant forskellig fra væv de blev afledt, f.eks genetisk transformation 4, forringelse af vigtige morfologiske træk5, tab af cellulære polaritet 6 og funktionelle ændringer såsom regulering af inflammatoriske mediatorer 7.
Kupffer-celler er de mest rigelige makrofag befolkning i kroppen og er direkte i kontakt med blod ved foring væggen af lever sinuskurver. Som en del af retikuloendoteliale system (RES), disse makrofager er ansvarlige for opsamling af cirkulerende nanopartikler, og derfor udgør en særdeles velegnet model til at studere nanopartikel toksicitet. In vivo 8 og in vitro studier af 9 inflammatoriske reaktioner associeret med Kupffer celler eksponeret for nanopartikler er blevet offentliggjort andetsteds. Kupffer-celler er også blevet involveret i patogenesen af leversygdomme såsom alkoholisk leversygdom 10, leverfibrose 11 eller viral hepatitis 12. Det blev rapporteret, at isolerede Kupffer celler giver nyttig indsigt til at beskrive cellulære mekanismer involved i lever forstyrrelser 13,14.
Er blevet rapporteret adskillige fremgangsmåder til at isolere og oprense Kupffer-celler. Celle isolation kan skyldes mekanisk eller enzymatisk dissociation 15. Collagenasefordøjelse viser den fordel at bevare den funktionelle integritet af Kupffer-celler, mens der fører til høj Kupffer-celle udbytte 16. Mange eksperimentelle metoder, der varierer i kompleksitet og omkostninger, er blevet anvendt til at adskille Kupffer-celler fra andre liver cellepopulationer. For eksempel kan Kupffer-celle renhed opnås ved immunaffinitetskromatografi 17, flow elektroforese 18, selektiv adhæsion 16 eller ved centrifugale teknikker 16, der udvælger celler ifølge deres størrelse og tæthed. En kombination af disse metoder kan vælges til at øge renheden af befolkningen 16. Der er ikke enighed om den ideelle metode til Kupffer celleisolering, da det for det meste afhænger af anvendelsen og tilgængelige equipment. I tilfælde af forsøg nanopartikeltoksicitet, enkelhed og højt udbytte af teknikken i forbindelse med den funktionelle konservering af Kupffer-celler viste sig imidlertid at være mest egnet til denne anvendelse.
Kupffer cellerne isoleringsmetode rapporteret her, er baseret på en 2-trins perfusion metode efterfulgt af oprensning på densitetsgradient. Metoden blev modificeret fra den oprindelige protokol udviklet af Smedsrød et al. 16 konstrueret til rottelever celleisolering. De fleste undersøgelser rapporteret og beskrevet isoleringen af Kupffer-celler fra rottelevere. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af Kupffer-celler fra muselever, i et højt udbytte og renhed. Anvendelsen af mus reducerer eksperimentet omkostningerne og tillader forarbejdning af flere lever at opnå store mængder af Kupffer-celler til test nanopartikeltoksicitet.
I den følgende protokol blev Kupffer-celler inkuberet med funktionaliserede kulstofnanorør (f dvs høje forhold mellem længde diameter og stor overflade, har gjort CNTs interessante kandidater som vektorer for terapi og diagnose formål. Imidlertid er der rejst spørgsmål om toksicitet CNTs 19, samt udvikling af nye in vitro-forsøg har til formål at øge forståelsen af CNT biologisk effekt. Toksicitet i Kupffer-celle er forbundet med en mangel på strukturel integritet af cellemembranen. Dette måles ved tabet af den cytoplasmatiske enzym LDH fra cellen til supernatanten. Princippet i denne metode er derfor at fjerne eventuelle frigivet LDH og måle hvad der er tilbage i cellerne 20. Dette gøres frem for måling af frigivet LDH i supernatanten fordi tilstedeværelsen af CNTs i supernatanten forstyrrer assayet 21.
Vi foreslår brug af denne enkle og omkostningseffektive Kupffer celleisolering method at isolere højt antal funktionelle Kupffer-celler. Dette tillader screening af toksiciteten af en række af nanopartikler, i en relevant primær makrofag model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev henrettet i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer. Protokollen demonstreres blev udført under vejledning og godkendelse af det britiske indenrigsministerium regulering
1. Perfusion and Cell Collection (figur 1)
Figur 1:. Liver Perfusion Efter anæstesi af musen, fordøjelseskanalen er sideværts flyttet til venstre af maven for at gøre portåren (PV) tilgængelige. PV er kanyleret under anvendelse af en langsom strømningshastighed (1-3 ml / min) af EGTA / HBSS Solution og inferior veina cava (IVC) er umiddelbart bristede at undgå overtryk i leveren. Inden for den første minut af perfusion, er strømningshastigheden gradvist til 7 ml / min. Collagenaseopløsningen derpå perfunderes ved 10 ml / min, indtil dens fulde fordøjelse er opnået.
- Prepare frisk alle reagenser, der er beskrevet i materialet tabel.
- Varm EGTA (ethylenglycol tetraeddikesyre) / HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Solution (50 ml per mus), og collagenaseopløsningen (100 ml per mus) i 30 minutter ved 40 ° C.
- Skyl pumpen fleksible slange først med 70% ethanol. Hæld 40 ml EGTA / HBSS Solution I et centrifugeglas nedsænket i vandbad og skyl pumpen fleksible slange med forvarmet EGTA / HBSS Solution.
- Udfør terminal anæstesi ved hjælp af en barbiturat til pålideligt at producere bevidstløshed før respirationsdepression og død. Injicere phenobarbiton ved 1 mg / kg, ip i en kvindelig eller mandlig CD1 mus (35-45 g). Bekræft anæstesi ved tå klemme.
- Barbere abdominale hår og sterilisere den abdominale overflade ved anvendelse af 70% ethanol-opløsning.
- Skære gennem bughulen og eksponere portåren og inferior vena cava ved at flytte tarmen lateralt til venstre for maven.
- Stjernet pumpen ved en hastighed på 1-3 ml / min med EGTA / HBSS Solution og kanyle portalen vene ved anvendelse af en 23 g sommerfugl nål (vinger skåret). Klemme den del af portalen vene kanyleret med 23 G nål og derefter vende serrefine pincet på overfladen af den åbnede musen maven. Leveren bør hurtigt bleg inden den første 30 sek af EGTA / HBSS Solution perfusion.
- Hurtigt incise den nederste del af den nedre vena cava at undgå overtryk bygning i leveren, og derefter forøge strømningshastigheden gradvist til 7 ml / min, over det første minut af perfusion. Dyret dør på grund af blødning sekundært til Vena Caval venepunktur.
- Når mindre end 5 ml EGTA / HBSS Solution er tilbage ind i centrifugerør, fylde det op med Collagenase Solution (40-50 ml). Forøge strømningshastigheden gradvist til 10 ml / min, i løbet af 30 sek.
- Gør leveren svulme ved at påføre tryk til den inferiøre vena cava, med en pincet, i 5-10 sek intervaller. This kan gøres periodisk (5-10 gange under fordøjelsen). Dette trin vil forbedre levercelle dissociation og reducere perfusion tid med collagenase.
- Når mindre end 10 ml collagenase opløsning forbliver inden centrifugeglasset, hæld 40-50 ml forvarmet Collagenase opløsningen i centrifugerør.
- Efter 10-15 min perfusion og ca. 70-80 ml collagenaseopløsning perfunderet, anvende en lille tryk på overfladen af leveren med en pincet. En udskrift af det pres viser, at leverceller dissocieres.
- Tag leveren fra bughulen som et stykke og læg den i en centrifuge rør indeholdende 20-30 ml Kupffer Cells Isolation Medium. Hold leverceller på is eller ved 4 ° C i et tidsrum på 3 timer maksimale for at undgå at påvirke levedygtigheden levercelle.
- Gentag perfusion procedure på flere dyr hvis det er nødvendigt, samtidig med at den perfunderet lever på is. Pool 1-3 lever for rensning og fortsætte med trin 3.
2. Fremstilling af densitetsgradient for centrifugering (figur 2)
Figur 2:. Forberedelse af densitetsgradient er Alle procedurer udføres under sterile tilstand. The SIP fremstilles ved at blande 15,3 ml af coated silica partikel opløsning med 1,7 ml 10 x PBS. En 5 ml SIP blandes med 15 ml PBS for at gøre 20 ml 25% SIP opløsning. 10 ml SIP blandes med 10 ml PBS for at gøre 20 ml 50% SIP opløsning. En centrifugerør indeholdende 50% SIP-opløsning (20 ml) vippes, og den 25% SIP-opløsning (20 ml) tilsættes langsomt under anvendelse af en serologisk 25 ml pipette.
- Fortsæt med følgende trin (afsnit 2., 3. & 5.) under sterile tilstand og holde celler på is eller ved 4 ° C. Forbered SIP (Opløsning af Isotonisk overtrukne silicapartikler) ved at blande 15,3 ml af belagt silica partikel opløsning med 1,7 ml 10 x PBS. At gøre 20 ml 25% SIP-opløsning, bland 5 ml SIP med 15 ml PBS. At gøre 20 ml 50% SIP opløsning, bland 10 ml SIP med 10 ml PBS.
- Fyld en centrifugerør med 20 ml af 50% SIP opløsning. Vip centrifugerør i en vinkel tæt på 90 °, og der tilsættes langsomt 25% SIP-opløsning (20 ml) på sidevæggen af røret under anvendelse af en 25 ml serologisk pipette uden at røre overfladen af 50% SIP lag. Ved tilsætning af 25% SIP opløsning, gradvis reducere vinklen af røret. Hold densitetsgradient på is indtil brug.
3. Kupffer Cell Oprensning (figur 3)
Figur 3:. Oprensning af Kupffer celler ved densitetsgradientcentrifugering og celleadhæsion er Alle procedurer udføres under sterile tilstand. (A) Efter brud på Glisson kapsel, er leverceller filtreret gennem et 100 um si. Suspensionen centrifugeres ved x 50 g til at skille hepatocytter (pellets) og indsamle de ikke-parenkyme cellefraktion (supernatant). Dette trin gentages 3 gange. Ikke-parenchymale celler tilsættes oven på en diskontinuert isotonisk gradient og centrifugeret ved 800 x g i 15 min. Kupffer celler opsamlet fra 25% SIP pude den renses yderligere ved celleadhæsion valg. (B) Celler udplades i 24-brønds plade og inkuberet ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 minutter. Ikke-adhærente celler vaskes en gang med 500 pi HBSS. Kupffer-celler vise deres vedhængende morfologi 4 timer efter udpladning, når f -CNTs kan tilsættes til cellerne. Skalaen søjle repræsenterer 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Put en perfunderet lever i en petriskål med 15 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Bryde Glisson kapsel (membran af leveren) under anvendelse af saks og frigive alle leverceller i Kupffer cellerne isolation medium. Opløsningen filtreres gennem et 100 um cellefilter der skal indsamles i et centrifugeglas. Gentag perfusion proceduren på yderligere perfunderet lever og samle cellerne i samme centrifugeglas (15 ml fra en mus, op til 45 ml fra tre mus).
- Centrifuger cellesuspensionen ved 50 x g i 2 minutter ved 4 ° C. Parenkymceller (hepatocytter) vil være i pelleten og ikke-parenchymale celler (herunder Kupffer-celler), vil være i supernatanten.
- Opsaml supernatanten i et rent centrifugerør og centrifugeres ved 50 x g i 2 minutter hver. Gentag dette trin yderligere tre gange.
- Centrifuger ved 1.350 xg i 15 minutter for at pelletere ikke-parenchymale celler. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 10 ml Kupffer Cell Isolation Medium.
- Tilsæt ikke-parenchymal celle løsning på diskontinuerlige isotonisk gradient 25/50% som beskrevet i 2.3. Centrifuge ved 850 xg i 15 min uden acceleration eller pause.
- Lokalisere den berigede Kupffer cellefraktion optræder uklar inden for 25% SIP fraktion tæt på 25/50% SIP interface (figur 3). Ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette, aspirat omkring 12 ml af den berigede Kupffer fraktionen celle. Overfør celler i et centrifugerør indeholdende 35-40 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Bland forsigtigt og centrifuger ved 1.350 xg i 15 minutter ved 4 ° C for at pelletere cellerne.
- Kassér supernatanten og resuspender cellerne i 5-10 ml forvarmet Kupffer Cell Culture Medium. Tæl celler (hæmocytometer) og måle levedygtighed under anvendelse af trypanblåt-farvning.
- Plate de oprensede ikke-parenchymale celler i 24-brønds plader ved en densitet på 5 x 10 5 celler / brønd. Inkubere cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 (figur 3). Efter 30 minutter forsigtigt fjerne mediet, vask med forvarmet Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) én gang derefter erstattedet med 500 pi frisk og forvarmet Kupffer Cell Culture Medium (per brønd).
- Efterlad Kupffer-celler i mindst 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2 før behandling med nanopartikler, at give dem mulighed for at erhverve deres vedhæftende morfologi.
4. Karakterisering
- Kupffer Cells Renhed
- Forberede frisk PBS / BSA-opløsning anvendes til at opretholde Kupffer cellelevedygtighed. Vask cellerne en gang med 500 pi PBS / BSA-opløsning. Fjern PBS / BSA-opløsning og tag Kupffer-celler i 500 pi frisk PBS / BSA-opløsning under anvendelse af forsigtig skrabning. Når celler udplades i plader med 24 brønde, forkorte yderpunkterne af skrabeblade med en saks for at gøre frigørelsen lettere at fortsætte. Overfør celler i flowcytometri rør.
- Tæl Kupffer celler under anvendelse af et hæmocytometer og centrifugeres 1 x 10 5 celler ved 1.350 x g. Resuspender Kupffer-celler i 30 pi F4 / 80-antistof (ren). Bland godt og inkuber ved stuetemperatur i 30 min. Hold ufarvede celler (ikke inkuberet med antistoffet) på is.
- Der tilsættes 2 ml PBS / BSA-opløsning i farvede celler, centrifugeres ved 1.350 g i 5 minutter og kassér den resulterende supernatant. Resuspender farvede celler i 200 pi PBS / BSA.
- Til flowcytometri analyse, gate 10.000 ufarvede Kupffer-celler efter deres størrelse (forward scatter) og granularitet (sidespredning). Analyser fluorescens af gated celler i FL-1 kanal.
- Gentag proceduren for farvede Kupffer celler holde de samme indstillinger, der bruges til flowcytometri analyse af ufarvede Kupffer celler. Udvælge og kvantificere fluorescens af farvede celler for at vurdere renheden af Kupffer-celle.
- Kupffer Cell fagocytiske aktivitet
- Erstatte medier med 0,5% (v / v) fluorescerende perler i Kupffer Cell dyrkningsmedium og inkuberes i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- For at fjerne ikke-internaliseret perler, centrifuge Kupffer celler ved 1.350 xg, discard supernatanten og resuspender cellerne i 500 pi PBS / BSA-opløsning. Gentag dette trin 2 flere gange.
- Skrabe Kupffer-celler i 500 pi PBS / BSA-opløsning og overføre celler i en flowcytometri rør.
- Centrifuge Kupffer celler ved 1.350 xg, kasseres supernatanten og resuspender cellerne i 200 ul PBS / BSA Solution.
- Til flowcytometri analyse, gate 10.000 ufarvede Kupffer-celler efter deres størrelse (forward scatter) og granularitet (sidespredning). Analyser fluorescens af gated celler i FL-2 kanal.
5. Inkubation af kemisk funktionaliserede kulstofnanorør (f -CNTs)
- Der fremstilles en dispersion af f -CNTs (1 mg / ml) i vand ved sonikering i 15 minutter før brug. F -CNTs fremstilles in-house 22.
- Forbered 2x koncentreret F- CNTs dispersion i Kupffer Cell Culture Medium. Soniker F- CNTs dispergeret i medium til2 min før du fortsætter med trin 5.3).
- For hver brønd, udskifte 250 pi gamle medier med 250 ul 2x f -CNTs dispersion. Ubehandlede brønde (250 pi konditioneret medium + 250 pi frisk Kupffer Cell Culture Medium) og brønde behandlet med 10% DMSO anvendes som negativ og positiv kontrol hhv.
- Inkuber Kupffer-celler ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 eller 72 timer.
6. Toksicitet Vurdering af f -CNTs i Kupffer celler med den modificerede Lactatdehydrogenase (LDH) Indhold
- Kassér supernatanten.
- Tilsæt 200 pi (per brønd af 24-brønds plade), i Lysis Buffer og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter-1 time.
- Efter at have foretaget kraftig pipettering, indsamle lyseret Kupffer-celler i mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 40.000 xg i 10 min for at pelletere f -CNTs, der blev taget op af celler og cellerester.
- Saml supernatanterne (ƒ-CNT gratis) imikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C eller fortsæt til trin 6.5).
- Overførsel 50 pi i en 96-brønds plade og der tilsættes samme mængde af substratet mix opløsning (LDH kit) til hver brønd. Dæk pladen og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter inden tilsætning af 50 pi af stopopløsning (LDH kit). Tilføj triplikater af datoer brønde indeholdende 50 pi lysepuffer, 50 pi substrat mix opløsning og 50 pi stopopløsning.
- Læs absorbansen ved 490 nm i en mikropladelæser og bruge følgende formel til beregning af (%) celle levedygtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antallet af ikke-oprensede parenkymceller var konsistent og varierede mellem 8 og 14 x 10 6 celler per mus (17 isolationer blev udført). Hver mus isolation var tilstrækkeligt til pladen 16 til 28 brønde. Celle levedygtighed ved trypanblåt-farvning viste cellelevedygtighed ~ 95%. Kupffer-celler viste en rund form inden for 30 min inkubation ved 37 ° C i forhold til deres ufuldstændige vedhæftende morfologi (figur 4A). På 4 timer af inkubation og bagefter blev celler spredt og celleklynger begyndte at dannes.
Kupffer-celler blev derefter karakteriseret at bekræfte deres renhed og fagocytisk aktivitet. Celler blev farvet med F4 / 80-antistof til at påvise Kupffer cellerne renhed. Flowcytometri analyse viste Kupffer-celle renhed over 95% (figur 4B). Celler blev inkuberet med 1 um fluorescerende perler, 12 timer efter udpladning, at bekræfte deres evne til at optage store partikler. Flowcytometri-analyse viste that mere end 85% af Kupffer-celler er fagocyterende, dvs. kan tage op de 1 um perler (figur 4C). Efter 72 timer af kultur, 40% af Kupffer celler fagocyterende, hvilket indikerer, at Kupffer celler delvist mistet deres fagocyterende aktivitet.
Mikroskopi billeddannelse af Kupffer-celler inkuberet med f -CNTs i 24 og 72 timer afslørede lignende cellemorfologi sammenlignet med naive celler (figur 5A). Kupffer-celler inkuberet med 10% DMSO (positiv kontrol) viste nekrotisk morfologi (figur 5A). Ifølge analysen af den modificerede LDH assay Kupffer-celler behandlet med 10% DMSO (positiv kontrol) i 24 og 72 timer viste høj toksicitet (figur 5B). Til sammenligning f -CNTs induceret let, men signifikant reduktion i cellelevedygtighed, når celler blev udsat ved 50 ug / ml i 72 timer (figur 5B).
Figur 4: Renhed og optagelse evner Kupffer-celler (A) Mikroskopiske billeder af Kupffer-celler udpladet efter 30 min eller 24 timer ved 37 ° C med en atmosfære af 5% CO2.. Skalaen bar præsenterer 50 um. (B) Flowcytometrianalyse af Kupffer-celler blev gennemført efter FSC / SSC celle gating. Kupffer-celle renhed blev bestemt ved anvendelse af F4 / 80-antistof-farvning og viste sig at være over 95%. (C) Kupffer-celler blev inkuberet i 4 timer i nærvær af 1 um fluorescerende kugler for at vurdere deres fagocytiske aktivitet. De funktionelle egenskaber af Kupffer blev opretholdt bedre i frisk isolerede celler (12 timer efter udpladning) sammenlignet med testet efter 3 dage celler.
Figur 5: Optagelse og toksicitet <em> F- CNTs i Kupffer celler. (A) Mikroskopi billeder af Kupffer celler. Billeder viser Kupffer celler behandlet med 10% DMSO og 50 ug / ml f -CNTs ved 37 ° C i 24 og 72 timer. Skalaen bar præsenterer 50 um. (B) Modificeret LDH assay. Levedygtighed lav celle blev set i 10% DMSO-behandlede celler (positive kontroller), mens f -CNTs berørt væsentligt cellelevedygtighed efter udsættelse for 50 ug / ml i 72 timer. * P <0,05 i forhold til det naive tilstand (bortset 10% DMSO betingelse) ved anvendelse af variansanalyse (envejs ANOVA) med post-hoc analyse af Tukey testen. Skalaen bar svarer til 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende trin er afgørende for at opnå et højt udbytte og høj levedygtighed Kupffer celler. Bør anvendes aseptiske forhold til at begrænse risikoen for bakteriel og svampe forurening. Alle instrumenter skal steriliseres før brug. Reagenser skal frisklavet inden udførelse af isolation procedure.
Valget af collagenase IV med lav tryptisk aktivitet, er afgørende. Forskellige partier fra samme leverandør har forskellige enzymatisk aktivitet, og de kan have behov for at blive sammenlignet i første omgang at vælge den mest hensigtsmæssige batch for Kupffer celleisolering. Dette kan bedømmes ved at vurdere celle udbytte og cellelevedygtighed. Det anbefales også at kontakte leverandøren for at give batches, der er blevet brugt til lignende anvendelser. Når besluttet partiet, der skal bruges, forbeholder den til fremtidig brug.
Den kanylering procedure kræver træning. Planlæg brug af flere dyr til at blive fortrolig med portalen venekanylering procedure. Med praksis, vil en vellykket kanylering let nås, og proceduren kan håndteres af én person. Bemærk, at brugen af tunge dyr forøger diameteren af portåren derfor fremmer proceduren. Når bagvæggen af portalen vene er perforeret, er det teknisk vanskeligt at få adgang til venen igen, især hvis du er ny med denne procedure, og derfor foretrækkes det at starte med et nyt dyr.
HBSS og Collagenase Solutions bør have deres pH justeret til 7,4, og være pre-varmet ved 40 ° C for at opnå et output temperatur fra den peristaltiske pumpe på 37 ° C. Perfusionen med EGTA / HBSS Solution (Ca 2+ og Mg 2+ fri) indeholdende EGTA er nødvendig for afbrydelsen af Ca2 + -afhængige adhæsionsmolekyler, opkaldt desmosom, svække vekselvirkningen celle-celle. Collagenase type IV anvendes til at løsne leverceller fra den ekstracellulære matrix og således føre til leverencelledissociering. Perfusionen tid for de to opløsninger bør ikke overstige 15 min for CD1 mus, men andre stammer, såsom C57BL / 6, kræve lidt længere lever fordøjelse tid.
For at opnå en vellykket isolering, er det nødvendigt at opnå et højt celleudbytte og levedygtighed. Hvis forsøgslederen har nogen erfaring i lever celleisolering, anbefales det at kombinere hepatocytter pellets fra de første 3 centrifugeringer ved 50 x g og tælle celler ved trypan blå eksklusion assay. Hepatocytsuspensionen Udbyttet bør være> 20 x 10 6 celler, og hepatocyt levedygtighed> 50%. Lave udbytter skyldes især dårlig celledissociering fører indirekte til lavere Kupffer-celle udbytte. Det bør bekræftes, at leveren er korrekt fordøjet ved slutningen af perfusion trin. Når passende hepatocyt udbytte opnås i kombination med lav hepatocyt levedygtighed, kan dette skyldes en overdreven collagenase fordøjelse, men er mere sandsynligt skyldes en uhensigtsmæssig leverenperfusion procedure eller brug af et forurenet reagens / materiale.
Efter udpladning, Kupffer-celler er følsomme og skal vaskes forsigtigt. Mindst 4 timer er nødvendige for Kupffer-celler at erhverve deres vedhæftende morfologi. Behandlingen udføres generelt 4-24 timer efter udpladning, som Kupffer celler viser deres maksimale fagocytiske aktivitet inden for 1 dag efter udpladning.
I vores protokol beskriver vi dissociationen af CD1 mus leverceller efterfulgt af oprensning af Kupffer-celler ved densitetsgradientcentrifugering og udvælgelse ved adhæsion. Karakteriseringen af Kupffer-celler, ved flowcytometri, viser, at højt udbytte og renhed af Kupffer-celler kan opnås ved hjælp af denne metode.
Dette Kupffer-celle isoleringsmetode repræsenterer et værdifuldt kompromis mellem kompleksitet og celleudbytte. Det er imidlertid beskrevet, at visse Kupffer-celle metoder kan være nemmere at udføre, såsom protokollen beskrevet afWu et al., Hvor leveren fordøjes ex vivo 23. Men den er beskrevet af Wu et al. fører til en begrænset mængde af celler og lavere celle renhed. Højere udbytte og renhed kan opnås, men kræver dyrt og / eller sofistikeret udstyr og kan være tidskrævende.
Den oprindelige protokol udviklet af Smedsrød et al. 16 anvendes en sammenlignelig protokol baseret på 2-trins perfusionsmetode (HBSS + collagenase fordøjelse) efterfulgt af centrifugering på Percoll-gradient og udvælgelse af den nedre Percoll stødpude for yderligere oprensning ved overfladeadhæsion. Ved at ændre centrifugering procedure, og opsamling af det øverste Percoll pude, vi øget berigede Kupffer fraktionen celle fra 5,25 x 10 6-8,2 x 10 6 celler pr gram leveren. Denne forbedring kan tilskrives brugen af EGTA under perfusion trin tidligt for at lette dissociering af leverceller. Mesuden anvendelse af flowcytometri analyse tillod pålidelig kvantitativ karakterisering af Kupffer-celle renhed og fagocytisk aktivitet. Med et udbytte på højst 14 x 10 6 oprensede ikke-parenkymceller pr muselever. Den foreliggende isoleringsmetode opnå højere mængde af Kupffer-celler per mus leveren til hvad der er blevet rapporteret i litteraturen 24. Denne forbedring kan forklares ved anvendelsen af tungere mus (35-45 g) i forhold til andre metoder 24. Ved siden af denne stigning i celle udbytte, anvendelse af større dyr letter bemærkelsesværdigt fremgangsmåden i portale vene kanyle.
High-throughput in vitro test kan udføres ved anvendelse af denne primære fagocytisk model, derfor efterligne in vivo toksikologiske virkninger af nanopartikler. Den overordnede forståelse af nanotoksikologi kunne drage fordel af sådanne modeller, hvilket gør nanopartikel udvælgelse til klinisk oversættelse mere effektiv. Derudover er det i overensstemmelse medgennemførelse af begrebet 3 R (reduktion, forfining og erstatning) i dyr biomedicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
