Abstract
De grote meerderheid van in vitro studies hebben nanotoxicological geïmmortaliseerde cellijnen gebruikt voor hun bruikbaarheid. Echter, de resultaten van nanodeeltjes toxiciteit in geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen toonden verschillen, benadrukt de noodzaak om het gebruik van primaire cellen verlengen in vitro assays. Dit protocol beschrijft de isolatie van muizenlever macrofagen, genaamd Kupffer cellen en hun toepassing toxiciteit nanodeeltjes bestuderen. Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag bevolking in het lichaam en vormt een deel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die verantwoordelijk is voor de vangst van circulerende nanodeeltjes. De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De werkwijze, gebaseerd op collagenase digestie en dichtheid centrifugatie wordt aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. ontworpen voor rat levercellen isolation en levert hoge opbrengst (tot 14 x 10 6 cellen per muis) en een hoge zuiverheid (> 95%) van Kupffer cellen. Deze isolatie methode vereist geen geavanceerde of dure apparatuur en vormt daarom een ideale compromis tussen complexiteit en cel opbrengst. Het gebruik van zwaardere muizen (35-45 g) verbetert de opbrengst van de isolatiemethode en maakt daarnaast opmerkelijk de procedure van poortader canule. De toxiciteit van gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes f -CNTs gemeten in dit model de gemodificeerde LDH assay. Deze methode beoordeelt cellevensvatbaarheid door meting van het gebrek aan structurele integriteit van Kupffer celmembraan na incubatie met F -CNTs. Toxiciteit veroorzaakt door f -CNTs kunnen consequent worden gemeten met behulp van deze test, benadrukken dat geïsoleerde Kupffer cellen zijn nuttig voor de toxiciteit van nanodeeltjes testen. Het algemene begrip van nanotoxicologie kunnen profiteren van dergelijke modellen, waardoor de nanodeeltjes selectie voor klinische vertaling efficiënt.
Introduction
Het gebied van nanotoxicologie onderzoek richt zich op het biologisch effect van nanodeeltjes te karakteriseren. Toxicologische studies op basis van in vivo onderzoek blijven de meest accurate methoden. Echter, is het gebruik beperkt door de kosten, arbeid en tijd eisen 1. Als alternatief zijn in vitro assays werden gebruikt vanwege hun eenvoud en de mogelijkheid van het ontwikkelen high-throughput in vitro testplatformen 2 - zodat uitbreiding van het aantal geteste omstandigheden. De meeste nanotoxicological studies worden uitgevoerd met behulp van in vitro testen met onsterfelijk gemaakte cellijnen. Er zijn echter zorgen over de extrapolatie van deze experimentele bevindingen in vivo toxicologische effecten 3. Inderdaad kan de eigenschappen van geïmmortaliseerde cellijnen significant van weefsels ze zijn ontleend, bijvoorbeeld genetische transformatie 4, verslechtering van de belangrijkste morfologische kenmerken te5, het verlies van cellulaire polariteit 6 en functionele veranderingen, zoals de regulering van ontstekingsmediatoren 7.
Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag populatie in het lichaam en die direct in contact met bloed door langs de wand van de lever sinusoïden. Als onderdeel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die macrofagen verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes en vormen derhalve een zeer geschikt model de toxiciteit van nanodeeltjes te bestuderen. In vivo 8 en in vitro studies 9 van inflammatoire responsen geassocieerd met Kupffer cellen blootgesteld aan nanodeeltjes elders gepubliceerd. Kupffer cellen zijn ook betrokken bij de pathogenese van leverziekten zoals alcoholische leverziekte 10, leverfibrose 11 of virale hepatitis 12. Er werd gemeld dat geïsoleerde Kupffer cellen nuttig inzicht om cellulaire mechanismen inv beschrijvenolved in de lever verstoring 13,14.
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren en zuiveren Kupffer cellen. Celisolatie kan ontstaan door mechanische of enzymatische dissociatie 15. Collagenase spijsvertering toont het voordeel van het behoud van de functionele integriteit van Kupffer cellen, terwijl leidt tot hoge Kupffer celopbrengst 16. Vele experimentele benaderingen, variërend in complexiteit en kosten, zijn gebruikt om Kupffercellen scheiden van andere levercel populaties. Zo kunnen Kupffer cellen zuiverheid worden bereikt door immunoaffiniteit 17, stroom 18 elektroforese, selectieve adhesie 16 of centrifugale technieken 16 die cellen te selecteren op basis van hun grootte en dichtheid. Een combinatie van deze methoden kunnen worden gekozen om de zuiverheid van de bevolking 16 verhogen. Er is geen consensus over de ideale methode voor Kupffer cel isolatie, want het is meestal afhankelijk van de toepassing en de beschikbare uitrustingt. In het geval van toxiciteit nanodeeltjes testen, de eenvoud en hoge opbrengst van de techniek in verband met functionele behoud van Kupffer cellen bleken het meest geschikt voor deze toepassing zijn.
De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De methode werd aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. 16 ontworpen voor rattenlever celisolatie. De meeste studies gerapporteerd en beschreven de isolatie van Kupffer cellen uit levers rat. Hierin beschrijven we een werkwijze voor Kupffercellen isoleren uit muizenlever, met een hoge opbrengst en zuiverheid. Het gebruik van muizen reduceert het experiment kosten en maakt de behandeling van verscheidene lever grote hoeveelheden Kupffercellen toxiciteit nanodeeltjes testen te verkrijgen.
In het volgende protocol werden Kupffer cellen geïncubeerd met gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f zoals bij hoge lengte tot diameter groot oppervlak hebben CNTs interessante kandidaten die als vectoren voor therapie en diagnose doeleinden. Echter, zijn bezorgdheid geuit over de toxiciteit van CNT 19, en de ontwikkeling van nieuwe in vitro testen is gericht op het vergroten van het inzicht in de CNT biologisch effect. Toxiciteit in Kupffer-cel is geassocieerd met een gebrek aan structurele integriteit van de celmembraan. Dit wordt gemeten door het verlies van de cytoplasmatische enzym LDH uit de cel in de supernatant. Het principe van deze methode is daarom om vrijgekomen LDH te verwijderen en meten wat overblijft in de cellen 20. Dit gebeurt in plaats van het meten van de vrijgekomen LDH in de supernatant omdat de aanwezigheid van CNTs in het supernatant interfereert met de test 21.
Wij stellen voor het gebruik van deze eenvoudige en kosteneffectieve Kupffer celisolatie method hoge aantal functionele Kupffer cellen te isoleren. Hierdoor kan de screening van toxiciteit van verschillende nanodeeltjes, in een relevante primaire macrofaag model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, voorschriften en regelgevende instanties. Het protocol gedemonstreerd werd uitgevoerd onder de leiding en de goedkeuring van de Britse Home office regelgeving
1. Perfusie and Cell Collection (figuur 1)
Figuur 1:. Leverperfusie Na verdoving van de muis, het spijsverteringskanaal lateraal naar links van de buik om de poortader (PV) toegankelijk te maken. De PV canule een trage stroomsnelheid (1-3 ml / min) van EGTA / HBSS oplossing en de onderste veina cava (IVC) onmiddellijk gescheurd om overtollige druk in de lever te voorkomen. In de eerste minuut van perfusie, wordt het debiet geleidelijk verhoogd tot 7 ml / min. De collagenase wordt vervolgens geperfuseerd bij 10 ml / min totdat de volledige digestie wordt verkregen.
- Prepaopnieuw vers alle reagentia in het materiaal tabel beschreven.
- Warm de EGTA (ethyleenglycol Tetra-azijnzuur) / HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) oplossing (50 ml per muis) en collagenase-oplossing (100 ml per muis) gedurende 30 minuten bij 40 ° C.
- Eerst spoelen met 70% ethanol de pomp flexibele slang. Giet 40 ml van EGTA / HBSS oplossing in een centrifugebuis ondergedompeld in het waterbad en spoel de pomp flexibele buis met voorverwarmde EGTA / HBSS oplossing.
- Voer terminal verdoving met een barbituraat om op betrouwbare wijze te produceren bewusteloosheid voor respiratoire depressie en de dood. Injecteer fenobarbital bij 1 mg / kg, ip een vrouwelijke of mannelijke CD1-muizen (35-45 g). Bevestig de narcose door teen knijpen.
- Scheren buik haren en steriliseer de buik oppervlak met 70% ethanol-oplossing.
- Knip de buikholte en de poortader en inferior vena cava bloot door het bewegen van de darm lateraal links van de buik.
- Stert de pomp met een snelheid van 1-3 ml / min met EGTA / HBSS oplossing canule en de poortader met een 23 g vlindernaald (wings gesneden). Klem het deel van de poortader gecanuleerde met de 23-G naald en vervolgens draai de serrefine tang aan het oppervlak van de geopende muis buik. De lever moet snel bleek binnen de eerste 30 seconden van EGTA / HBSS oplossing perfusie.
- Snel insnijden het onderste gedeelte van de inferior vena cava overdruk gebouw in de lever voorkomen, en vervolgens krachtiger debiet geleidelijk 7 ml / min, in de eerste minuut van perfusie. Het dier sterft als gevolg van bloeden secundair aan caval venapunctie Vena.
- Bij minder dan 5 ml van EGTA / HBSS oplossing is overgebleven in de centrifugebuis, vul het met Collagenase Solution (40-50 ml). Verhoog het debiet geleidelijk 10 ml / min gedurende 30 sec.
- Maak de lever deining door druk op de onderste vena cava, met een pincet voor 5-10 sec intervallen. This kan periodiek worden uitgevoerd (5-10 keer tijdens de spijsvertering). Deze stap zal de lever cel dissociatie te verbeteren en vermindering van de perfusie tijd met collagenase.
- Bij minder dan 10 ml collagenase oplossing achterblijft in de centrifugebuis, giet 40-50 ml voorverwarmde Collagenase oplossing in de centrifugebuis.
- Na 10-15 min perfusie en ongeveer 70-80 ml collagenase oplossing geperfuseerd met een klein druk op het oppervlak van de lever met een pincet. Een afdruk van de druk geeft aan dat de lever cellen worden gescheiden.
- Haal de lever uit de buikholte als een stuk en plaats het in een centrifuge buisje met 20-30 ml Kupffercellen Isolation Medium. Blijf levercellen op ijs of bij 4 ° C gedurende 3 uur maximum ter voorkoming van hinder levensvatbaarheid levercel.
- Herhaal de perfusie over verscheidene dieren indien nodig, terwijl de geperfuseerde lever op ijs. Pool 1-3 levers voor zuivering en ga verder met fase 3.
2. Bereiding van de dichtheidsgradiënt te centrifugeren (figuur 2)
Figuur 2:. Voorbereiding van de dichtheidsgradiënt Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele toestand worden uitgevoerd. De SIP wordt bereid door 15,3 ml van gecoate silica deeltje oplossing 1,7 ml 10 x PBS. Een 5 ml SIP worden gemengd met 15 ml PBS tot 20 ml 25% SIP oplossing. 10 ml van SIP worden gemengd met 10 ml PBS tot 20 ml 50% SIP oplossing. Een centrifugebuis bevattende 50% SIP-oplossing (20 ml) wordt gekanteld en 25% SIP-oplossing (20 ml) wordt langzaam toegevoegd met behulp van een serologische pipet 25 ml.
- Ga verder met de volgende stappen (hoofdstuk 2., 3. en 5.) onder steriele conditie en houden cellen op ijs of bij 4 ° C. Bereid de SIP (oplossing isotoon beklede silicadeeltjes) door mengen van 15,3 ml van gecoate silica deeltje oplossing met 1,7 ml 10 x PBS. Aan 20 ml van 25% SIP oplossing te maken, meng 5 ml van SIP met 15 ml PBS. Aan 20 ml van 50% SIP oplossing te maken, meng 10 ml van SIP met 10 ml PBS.
- Vul een centrifugebuis van 20 ml van de 50% oplossing SIP. Kantel de centrifugebuis een hoek dicht bij 90 ° en voeg langzaam 25% de SIP-oplossing (20 ml) aan de zijwand van de buis met behulp van een 25 ml serologische pipet, zonder het oppervlak van de 50% SIP laag raken. Bij het toevoegen van de 25% SIP oplossing geleidelijk verminderen van de hoek van de buis. Houd de dichtheidsgradiënt op ijs tot gebruik.
3. Kupffer Cell Purification (figuur 3)
Figuur 3:. Zuivering van Kupffer cellen door dichtheidsgradiënt centrifugeren en celadhesie Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele toestand worden uitgevoerd. (A) na breuk van de Glisson de capsule worden levercellen gefiltreerd door een 100 micrometer zeef. De suspensie wordt bij 50 x g gecentrifugeerd om hepatocyten (pellets) gooi en het verzamelen van de niet-parenchymcel fractie (supernatant). Deze stap wordt 3 maal herhaald. Non-parenchymale cellen worden toegevoegd op een discontinue gradiënt isotone en gecentrifugeerd bij 800 x g gedurende 15 min. Kupffer cellen vanuit het 25% SIP kussen worden verder gezuiverd door celadhesie selectie. (B) Cellen worden uitgeplaat in 24-well plaat en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 min. Niet-hechtende cellen worden eenmaal gewassen met 500 pi HBSS. Kupffercellen tonen hun hechtende morfologie 4 uur na plateren, wanneer f -CNTs kunnen worden toegevoegd aan de cellen. De schaal bar vertegenwoordigt 25 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Zet een doorbloed lever in een petrischaal met 15 ml Kupffer Cell Isolation Medium. Scheuren van de Glisson's capsule (membraan van de lever) met een schaar en laat alle levercellen in de Kupffer-cel isolatiemedium. Filtreer de oplossing hoewel een 100 urn zeef cel te halen in een centrifugebuis. Herhaal de perfusie procedure aanvullende levers geperfuseerd en bundelen de cellen in dezelfde centrifugebuis (15 ml van een muis, tot 45 ml van drie muizen).
- Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g gedurende 2 min bij 4 ° C. Parenchymale cellen (hepatocyten) zal in de pellet en niet-parenchymale cellen (inclusief Kupffercellen) zal in het supernatant.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone centrifugebuis en centrifugeer bij 50 xg gedurende 2 minuten elk. Herhaal deze stap drie keer.
- Centrifugeer bij 1350 xg gedurende 15 min aan niet-parenchymale cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml van Kupffer Cell isolatiemedium.
- Voeg de niet-parenchymcellen-oplossing isotoon de discontinue gradiënt 25/50%, zoals beschreven in 2.3. Centrifuge bij 850 xg gedurende 15 min zonder versnelling of breken.
- Lokaliseer de Kupffer verrijkte celfractie troebele verschijning in de 25% fractie SIP nabij de 25/50% SIP interface (Figuur 3). Met behulp van een 10 ml serologische pipet, zuig ongeveer 12 ml van de verrijkte Kupffer celfractie. Transfer cellen in een centrifugebuis die 35-40 ml Kupffer Cell isolatiemedium. Meng voorzichtig en centrifugeer bij 1350 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 5-10 ml voorverwarmde Kupffer celkweekmedium. Tellen cellen (hemocytometer) en meet de levensvatbaarheid met trypanblauw vlekken.
- Plate het gezuiverde niet-parenchymale cellen in 24-wells platen met een dichtheid van 5 x 10 5 cellen / putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 (figuur 3). Na 30 min, verwijder voorzichtig het medium, wassen met voorverwarmd Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) keer dan vervangenmet 500 pl vers en voorverwarmde Kupffer Cell Culture Medium (per putje).
- Laat Kupffer cellen ten minste 4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 vóór de behandeling met nanodeeltjes, zodat zij hun hechtende morfologie verwerven.
4. Karakterisering
- Kupffercellen Zuiverheid
- Bereid verse PBS / BSA-oplossing gebruikt om Kupffer levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Was de cellen eenmaal met 500 ui PBS / BSA oplossing. Verwijder de PBS / BSA-oplossing en los Kupffer cellen in 500 ul van verse PBS / BSA-oplossing met zachte schrapen. Wanneer cellen worden uitgeplaat in 24-puts platen inkorten uiteinden van schraapbladen met een schaar de onthechting gemakkelijker gaan maken. Overdracht cellen in flowcytometrie tubes.
- Tellen Kupffer cellen met een hemocytometer en centrifuge 1 x 10 5 cellen bij 1350 x g. Resuspendeer Kupffer cellen in 30 ui F4 / 80 antilichaam (puur). Goed mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Houd de ongekleurde cellen (niet geïncubeerd met het antilichaam) op ijs.
- Voeg 2 ml PBS / BSA oplossing in gekleurde cellen, centrifuge op 1350 g gedurende 5 minuten en gooi de resulterende supernatant. Resuspendeer gekleurde cellen in 200 ul PBS / BSA.
- Voor flowcytometrieanalyse, poort 10000 unstained Kupffer cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing) en de granulariteit (zijwaartse verstrooiing). Analyseer fluorescentie van gated cellen in FL-1 kanaal.
- Herhaal deze procedure Gekleurde Kupffer cellen behoud van dezelfde instellingen voor de flowcytometrie analyse van ongekleurde Kupffer cellen. Selecteren en kwantificeren van de fluorescentie van gekleurde cellen om de zuiverheid van Kupffer cellen te beoordelen.
- Kupffer Cell fagocytoseactiviteit
- Vervang medium met 0,5% (v / v) fluorescerende beads in Kupffer celkweekmedium en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Om niet-geïnternaliseerde kralen, centrifuge Kupffercellen op 1350 xg, di verwijderenscard het supernatant en resuspendeer cellen in 500 ul PBS / BSA oplossing. Herhaal deze stap nog 2 keer.
- Schraap Kupffer cellen in 500 ul PBS / BSA oplossing en overdracht cellen in een flow-cytometrie buis.
- Centrifuge Kupffercellen op 1350 xg, gooi het supernatant en resuspendeer cellen in 200 ul PBS / BSA Solution.
- Voor flowcytometrieanalyse, poort 10000 unstained Kupffer cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing) en de granulariteit (zijwaartse verstrooiing). Analyseer fluorescentie van gated cellen in FL-2-kanaal.
5. Incubatie van Chemisch gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f -CNTs)
- Bereid een dispersie van f -CNTs (1 mg / ml) in water door sonicatie gedurende 15 min vóór gebruik. F -CNTs bereid in-house 22.
- Bereid 2x geconcentreerd f- CNTs dispersie in Kupffer celkweekmedium. Sonificeer f- CNTs verspreid in medium voor2 min voordat u doorgaat met stap 5.3).
- Voor elke goed, vervang 250 ul van oude media met 250 pi van 2x f -CNTs dispersie. Onbehandelde putten (250 ui geconditioneerd medium + 250 ul vers Kupffer Cell Culture Medium) en putjes behandeld met 10% DMSO worden als negatieve en positieve controles, respectievelijk.
- Incubeer Kupffer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 of 72 uur.
6. toxiciteit Evaluatie van f -CNTs in Kupffer cellen door de Modified lactaatdehydrogenase (LDH) Assay
- Verwijder het supernatant.
- Voeg 200 ul (per putje van 24-putjes plaat) lysisbuffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten 1 uur.
- Na het uitvoeren van krachtig pipetteren, verzamel gelyseerde Kupffer cellen in microcentrifuge buizen en centrifugeer bij 40.000 xg gedurende 10 min f -CNTs die door cellen en celafval werden pelleteren.
- Verzamel de bovenstaande vloeistoffen (ƒ-CNT gratis) inmicrocentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C of ga verder met stap 6.5).
- Transfer 50 pi in een 96-well plaat en een gelijk volume van het substraatmengsel oplossing (LDH kit) aan elk putje. Bedek de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor het toevoegen van 50 pi van de stopoplossing (LDH kit). Drievoud blanco putjes die 50 pl lysisbuffer, 50 ui substraatmengsel-oplossing en 50 gl stopoplossing toevoegen.
- Lees de absorptie bij 490 nm in een microplaat reader en gebruik de volgende formule om de (%) cellevensvatbaarheid te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het aantal niet-gezuiverde parenchymcellen consistent was en varieerde tussen 8 en 14 x 10 6 cellen per muis (17 isolaties werden uitgevoerd). Elke muis contrast was voldoende om 16 tot 28 wells plaat. Cel levensvatbaarheid door trypan blauw kleuring toonden cellevensvatbaarheid ~ 95%. Kupffer cellen vertoonden een ronde vorm in 30 min incubatie bij 37 ° C, in verband met hun onvolledige hechtende morfologie (figuur 4A). Bij 4 uur incuberen en vervolgens werden de cellen uitgespreid en celclusters begon te vormen.
Kupffer cellen werden vervolgens gekarakteriseerd om hun zuiverheid en fagocytose bevestigen. Cellen werden gekleurd met F4 / 80 antilichaam aan de Kupffer-cel zuiverheid tonen. Flow cytometrie analyse toonde Kupffer cellen zuiverheid boven 95% (figuur 4B). De cellen werden geïncubeerd met 1 urn fluorescerende beads, 12 uur na plateren, om hun vermogen tot het nemen van grote deeltjes te bevestigen. Flowcytometrie analyse toonde that meer dan 85% van fagocytische Kupffer-cellen zijn, dat wil zeggen kan nemen van de 1 urn korrels (Figuur 4C). Na 72 uur van de cultuur, 40% van de Kupffer cellen fagocyterende, wat aangeeft dat Kupffer cellen gedeeltelijk verloren hun fagocytische activiteit.
Microscopie beeldvorming van Kupffer cellen geïncubeerd met f -CNTs voor 24 en 72 uur onthuld vergelijkbaar celmorfologie in vergelijking met naïeve cellen (Figuur 5A). Kupffer cellen geïncubeerd met 10% DMSO (positieve controle) weergegeven necrotische morfologie (figuur 5A). Na analyse van het gemodificeerde LDH assay, Kupffer cellen behandeld met 10% DMSO (positieve controle) gedurende 24 en 72 uur vertoonden hoge toxiciteit (Figuur 5B). Ter vergelijking, f -CNTs induceerde geringe maar significante daling van levensvatbaarheid van de cellen wanneer de cellen werden blootgesteld aan 50 pg / ml voor 72 uur (Figuur 5B).
Figuur 4: Zuiverheid en Opname Mogelijkheden van Kupffer-cellen (A) Microscopische beelden van Kupffer cellen uitgeplaat na 30 minuten of 24 uur bij 37 ° C met een atmosfeer van 5% CO 2.. De schaal bar presenteert 50 micrometer. (B) Flowcytometrieanalyse van Kupffer cellen werd uitgevoerd volgens FSC / SSC cel gating. Kupffer cellen zuiverheid werd bepaald met F4 / 80 antilichaamkleuring en bleek boven 95%. (C) Kupffer-cellen werden gedurende 4 uur bij aanwezigheid van 1 urn fluorescerende beads hun fagocytische activiteit uitoefent. De functionele eigenschappen van Kupffer zijn beter in vers geïsoleerde cellen (12 uur na uitplaten) vergeleken met cellen getest na 3 dagen gehandhaafd.
Figuur 5: De opname en toxiciteit van <em> f- CNTs in Kupffer cellen. (A) Microscopie beelden van Kupffer cellen. Beelden tonen Kupffer cellen behandeld met 10% DMSO en 50 ug / ml van f -CNTs bij 37 ° C gedurende 24 en 72 uur. De schaal bar presenteert 50 micrometer. (B) Gewijzigd LDH test. Low cellevensvatbaarheid werd waargenomen bij 10% DMSO behandelde cellen (positieve controles) terwijl f -CNTs cellevensvatbaarheid significant beïnvloed na blootstelling aan 50 ug / ml gedurende 72 uur. * P <0,05 ten opzichte van de naïeve voorwaarde (met uitzondering van 10% DMSO conditie) met behulp van variantieanalyse (one-way ANOVA) met post-hoc analyse door de Tukey-test. De schaal balk komt overeen met 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De volgende stappen zijn cruciaal voor hoge opbrengst en hoge levensvatbaarheid van Kupffercellen bereiken. Aseptische omstandigheden moeten worden gebruikt om de kans op bacteriële en fungale contaminatie. Alle instrumenten moeten worden gesteriliseerd voor gebruik. Reagentia moeten vers worden bereid voor het uitvoeren van de isolatie procedure.
De keuze van de collagenase IV, met een lage tryptisch activiteit, is cruciaal. Verschillende partijen van dezelfde leverancier verschillende enzymatische activiteit en zij moeten eerst worden vergeleken met de meest geschikte partij in Kupffer celisolatie selecteren. Dit kan worden beoordeeld door het bepalen celopbrengst en cellevensvatbaarheid. Het wordt ook aanbevolen om contact leverancier batches die zijn gebruikt voor soortgelijke toepassingen. Eenmaal besloten de partij te gebruiken, behouden voor toekomstig gebruik.
De canulatie procedure vereist training. Plan het gebruik van verschillende dieren om te vertrouwen met de poortader gewordencanulatie procedure. Met de praktijk, zal succesvolle canulatie gemakkelijk worden bereikt en de procedure kan door één persoon worden behandeld. Merk op dat het gebruik van zware dieren vergroot de diameter van de poortader en als zodanig de procedure. Wanneer de achterwand van de poortader is geperforeerd, is het technisch moeilijk opnieuw toegang de ader, zeker als je nieuw met deze procedure en derhalve verdient het de voorkeur om te beginnen met een nieuw dier.
De HBSS en collagenase oplossingen moeten hun pH ingesteld op 7,4 en voorverwarmd bij 40 ° C tot een uitgangstemperatuur bereiken van de peristaltische pomp van 37 ° C. De perfusie met EGTA / HBSS oplossing (Ca2 + en Mg2 + vrij) met EGTA is nodig voor de verstoring van Ca2 + afhankelijke adhesie moleculen, genaamd desmosome verzwakt de cel-cel interactie. Collagenase type IV wordt gebruikt voor levercellen los te maken van de extracellulaire matrix en zo leiden tot de levercel dissociatie. De perfusie tijd voor de twee oplossingen mag niet meer dan 15 minuten voor CD1-muizen, maar andere stammen zoals C57BL / 6, vereisen iets langere lever ontsluitingstijd.
Een succesvolle isolatie te bereiken, is het noodzakelijk om een hoge opbrengst en levensvatbaarheid van de cel te verkrijgen. Als de onderzoeker heeft geen ervaring in levercel isolement, is het aangeraden om levercellen pellets cellen combineren van de eerste 3 centrifugaties bij 50 xg en te tellen door trypan blauw uitsluiting test. De hepatocyt opbrengst moet> 20 x 10 6 cellen en hepatocyten levensvatbaarheid> 50%. Lage opbrengsten zijn voornamelijk het gevolg van een slechte cel dissociatie leidt indirect aan Kupffer cel opbrengst verlagen. Er wordt bevestigd dat de lever goed verteerd aan het einde van de perfusie stap. Als geschikte hepatocyte opbrengst wordt bereikt in combinatie met een lage hepatocyte levensvatbaarheid, kan dit het gevolg zijn van een overmatige collagenase spijsvertering, maar is waarschijnlijk te verklaren door een ongepaste leverperfusie procedure of het gebruik van een verontreinigde reagens / materiaal.
Na plateren, Kupffer cellen gevoelig en moet voorzichtig worden gewassen. Tenminste 4 uur nodig om Kupffercellen hun hechtende morfologie verwerven. De behandeling wordt in het algemeen 4-24 uur uitgevoerd na plateren, zoals Kupffer cellen hun maximale fagocytische activiteit vertonen binnen 1 dag na uitplaten.
In ons protocol beschrijven we de dissociatie van CD1 muizen levercellen gevolgd door de zuivering van Kupffer cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie en selectie door adhesie. De karakterisering van Kupffer cellen door flowcytometrie, toont aan dat een hoge opbrengst en zuiverheid van Kupffer-cellen kan worden bereikt met deze methode.
Dit Kupffer celisolatie methode een waardevolle compromis tussen complexiteit en cel opbrengst. Er wordt beschreven dat bepaalde Kupffer cellen methoden kan worden gemakkelijker uit te voeren, zoals beschreven protocolWu et al., Waarbij de lever wordt verteerd ex vivo 23. De beschreven door Wu et al methode. leidt tot een beperkte hoeveelheid cellen en onderste cel zuiverheid. Hogere opbrengst en zuiverheid kunnen worden verkregen, maar vereisen dure en / of geavanceerde apparatuur en kan tijdrovend zijn.
De oorspronkelijke protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. 16 gebruikt een vergelijkbaar protocol gebaseerd op 2-staps werkwijze perfusie (HBSS + collagenase digestie), gevolgd door centrifugatie over Percoll gradiënt en selectie van de onderste Percoll kussen voor verdere zuivering met oppervlaktehechting. Door het centrifugeren procedure wijzigen en het verzamelen van de bovenste Percoll kussen, we de verrijkte Kupffer cel fractie verhoogd van 5,25 x 10 6-8,2 x 10 6 cellen per gram van de lever. Deze verbetering kan worden toegeschreven aan het gebruik van EGTA tijdens de vroege perfusie stap om de dissociatie van levercellen vergemakkelijken. Moreover, het gebruik van flowcytometrie analyse leidde betrouwbare kwantitatieve karakterisering van Kupffer cellen zuiverheid en fagocytose. Met een maximale opbrengst van 14 x 10 6 gezuiverde niet-parenchymale cellen per muizenlever. De onderhavige isolatiemethode bereiken grotere hoeveelheid Kupffer cellen per muizenlever hetgeen is beschreven in de literatuur 24. Deze verbetering kan worden verklaard door het gebruik van zwaardere muizen (35-45 g) in vergelijking met andere methoden 24. Hiernaast toename celopbrengst, het gebruik van grotere dieren vergemakkelijkt opmerkelijk de procedure van poortader canule.
High-throughput in vitro tests kunnen worden uitgevoerd met deze eerste fagocytische model derhalve nabootsen van de in vivo toxicologische effecten van nanodeeltjes. Het algemene begrip van nanotoxicologie kunnen profiteren van dergelijke modellen, waardoor de nanodeeltjes selectie voor klinische vertaling efficiënter. Bovendien is het in overeenstemming mettoepassing van het concept van 3 R (vermindering, verfijning en vervanging) in dierlijke biomedisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
