Abstract
La grande majorité des études in vitro de nanotoxicological ont utilisé des lignées cellulaires immortalisées pour leur praticité. Cependant, les résultats des tests de toxicité des nanoparticules dans des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires ont montré des anomalies, en soulignant la nécessité d'étendre l'utilisation de cellules primaires pour les essais in vitro. Ce protocole décrit l'isolement de macrophages hépatiques de souris, les cellules de Kupffer Nom de famille, ainsi que leur utilisation pour étudier la toxicité des nanoparticules. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et constituent une partie du système réticulo-endothélial (RES), responsable de la capture des nanoparticules de circulation. La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. La méthode, basée sur la digestion de collagénase et une centrifugation de densité, est une adaptation du protocole d'origine développé par Smedsrød et al. conçu pour les cellules du foie de rat isolation et fournit un rendement élevé (jusqu'à 14 x 10 6 cellules par souris) et de haute pureté (> 95%) des cellules de Kupffer. Cette méthode d'isolement ne nécessite pas d'équipements sophistiqués et coûteux ou représente donc un compromis idéal entre la complexité et le rendement de la cellule. L'utilisation de souris plus lourds (35 à 45 g) permet d'améliorer le rendement du procédé d'isolation, mais aussi facilite remarquablement le mode opératoire de canulation de la veine porte. La toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés f -CNTs a été mesuré dans ce modèle par le dosage de la LDH modifié. Cette méthode évalue la viabilité des cellules en mesurant le manque d'intégrité structurelle de la membrane des cellules de Kupffer après incubation avec -CNTs f. Toxicité induite par -CNTs f peut être mesurée en utilisant systématiquement ce test, soulignant que les cellules de Kupffer isolées sont utiles pour les tests de toxicité des nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace.
Introduction
Le domaine de la recherche de la nanotoxicologie vise à caractériser l'effet biologique des nanoparticules. Les études toxicologiques basées sur des investigations in vivo restent les méthodes les plus précises. Toutefois, leur utilisation est limitée par leur coût, travail et temps exigences 1. Comme essais alternatives, in vitro ont été utilisées en raison de leur simplicité et de la possibilité de développer à haut débit dans les plateformes de test in vitro 2 - étendant ainsi le nombre de conditions testées. La plupart des études sont effectuées en utilisant nanotoxicological dans des essais in vitro sur des lignées de cellules immortalisées. Cependant, il ya des préoccupations concernant l'extrapolation de ces résultats expérimentaux à des effets toxicologiques in vivo 3. En effet, les propriétés des lignées cellulaires immortalisées peuvent être significativement différents de tissus ils ont été dérivés à partir, par exemple, la transformation génétique 4, la détérioration des caractéristiques morphologiques clés5, la perte de la polarité cellulaire 6 et altérations fonctionnelles telles que la réglementation des médiateurs inflammatoires 7.
Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et sont directement en contact avec le sang en alignant la paroi de sinusoïdes hépatiques. Dans le cadre du système réticulo-endothélial (RES), les macrophages sont responsables de la capture des nanoparticules de circulation et, par conséquent, constituent un modèle très approprié pour étudier la toxicité des nanoparticules. In vivo 8 et in vitro 9 études de réponses inflammatoires associées à des cellules de Kupffer exposés à des nanoparticules ont été publiés ailleurs. Les cellules de Kupffer ont également été impliqués dans la pathogenèse des maladies du foie telles que la maladie alcoolique du foie 10, la fibrose hépatique ou hépatite virale 11 12. Il a été rapporté que les cellules de Kupffer isolés donnent un aperçu utile de décrire les mécanismes cellulaires involved dans la perturbation du foie 13,14.
Plusieurs procédés ont été rapportés pour isoler et purifier des cellules de Kupffer. l'isolement cellulaire peut causer de la dissociation mécanique ou enzymatique 15. Digestion collagénase montre l'intérêt de la conservation de l'intégrité fonctionnelle des cellules de Kupffer, tout en conduisant à haute Kupffer rendement de la cellule 16. De nombreuses approches expérimentales différentes, la complexité et les coûts, ont été utilisées pour séparer les cellules de Kupffer les autres populations de cellules du foie. Par exemple, des cellules de Kupffer pureté peut être obtenue par immunoaffinite 17, le flux 18 électrophorèse, l'adhérence sélective 16 ou par des techniques d'épandage 16, qui sélectionnent les cellules selon leur taille et leur densité. Une combinaison de ces méthodes peut être choisie pour augmenter la pureté de la population 16. Il n'y a pas de consensus sur la méthode idéale pour l'isolation des cellules de Kupffer, car elle dépend principalement sur les applications disponibles et équipemt. Toutefois, dans le cas des essais de toxicité de nanoparticules, la simplicité et un rendement élevé de la technique associée à la conservation fonctionnelle des cellules de Kupffer ont semblé être plus approprié pour cette application.
La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. Le procédé a été modifié par rapport au protocole initial développé par Smedsrød et al. 16 conçus pour l'isolement des cellules de foie de rat. La plupart des études ont rapporté et décrit l'isolement de cellules de Kupffer du foie de rat. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules de Kupffer du foie de la souris, avec un rendement élevé et de pureté. L'utilisation de souris réduit le coût de l'expérimentation et permet le traitement de plusieurs foies d'obtenir de grandes quantités de cellules de Kupffer pour les tests de toxicité des nanoparticules.
Dans le protocole suivant, les cellules de Kupffer ont été incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés (f c.-à-haute rapport de longueur à diamètre et grande surface, ont fait NTC candidats intéressants comme vecteurs pour des fins de thérapie et de diagnostic. Toutefois, des préoccupations ont été soulevées concernant la toxicité des nanotubes de carbone 19, et le développement de nouveaux tests in vitro vise à accroître la compréhension des effets biologiques CNT. Toxicité chez les cellules de Kupffer est associé à un manque d'intégrité structurelle de la membrane cellulaire. Elle est mesurée par la perte de l'enzyme LDH cytoplasmique de la cellule dans le surnageant. Le principe de cette méthode est donc de supprimer tout LDH libérée et de mesurer ce qui reste dans les cellules 20. Ceci est réalisé de préférence à la mesure de la LDH libérée dans le surnageant parce que la présence de nanotubes de carbone dans le surnageant interfère avec l'essai 21.
Nous vous proposons l'utilisation de ce métho d'isolement des cellules de Kupffer efficace simple et économiqued pour isoler nombre élevé de cellules fonctionnelles Kupffer. Ceci permet le criblage de la toxicité d'une gamme de nanoparticules, dans un modèle de macrophage primaire pertinente.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole en démonstration a été réalisée sous la direction et l'approbation de la réglementation de bureau au Royaume-Uni Accueil
1. Perfusion et Cell Collection (Figure 1)
Figure 1:. Foie Perfusion Après l'anesthésie de la souris, le tube digestif est déplacé latéralement vers la gauche de l'abdomen afin de rendre la veine porte (PV) accessible. Le PV est pourvue d'une canule en utilisant une faible vitesse d'écoulement (3.1 ml / min) de la solution d'EGTA / HBSS et la Veina cave inférieure (VCI) est rompue immédiatement pour éviter toute surpression à l'intérieur du foie. Au sein de la première minute de la perfusion, le débit est progressivement augmentée à 7 ml / min. La solution la collagénase est ensuite perfusé à 10 ml / min jusqu'à ce que sa digestion complète est obtenue.
- Prepare fraîchement tous les réactifs décrits dans la table des matières.
- Réchauffez la EGTA (Ethylene Glycol Tetra-acétique) / HBSS (solution saline équilibrée de Hank) Solution (50 ml par souris) et la solution la collagénase (100 ml par souris) pendant 30 min à 40 ° C.
- Rincer le tube flexible de la pompe d'abord avec 70% d'éthanol. Verser 40 ml d'EGTA / HBSS Solution dans un tube de centrifugeuse immergé dans le bain d'eau et rincer le tube flexible de la pompe avec / HBSS Solution EGTA préchauffé.
- Effectuer anesthésie terminale en utilisant un barbiturique à produire de manière fiable l'inconscience avant la dépression respiratoire et la mort. Injecter phénobarbital à 1 mg / kg, ip dans une souris CD1 femelle ou mâle (35-45 g). Confirmez l'anesthésie par pincement orteil.
- Raser les poils abdominaux et stériliser la surface abdominale en utilisant une solution d'éthanol à 70%.
- Couper à travers la cavité abdominale et exposer la veine porte et la veine cave inférieure en déplaçant latéralement l'intestin à la gauche de l'abdomen.
- Étoilet la pompe à une vitesse de 1-3 ml / min avec la solution EGTA / HBSS et cathétériser la veine porte en utilisant une aiguille 23 g de papillon (ailes coupées). Fixer la section de la veine porte canule avec l'aiguille de 23 G et puis retournez les forceps serrefine à la surface de l'abdomen de la souris ouvert. Le foie devrait rapidement pâle dans le 30 premières secondes de la perfusion EGTA / HBSS Solution.
- Inciser rapidement la partie inférieure de la veine cave inférieure pour éviter la construction de surpression dans le foie, et ensuite augmenter le débit progressivement à 7 ml / min, au cours de la première minute de la perfusion. L'animal meurt en raison de saignements secondaire à la veine cave ponction veineuse.
- Lorsque moins de 5 ml de EGTA / HBSS Solution restante dans le tube de la centrifugeuse, le remplir avec Solution collagénase (40-50 ml). Augmenter le débit progressivement à 10 ml / min, 30 sec.
- Faire la houle du foie en appliquant une pression à la veine cave inférieure, en utilisant des pinces, pour les 5-10 secondes d'intervalle. This peut être fait périodiquement (5-10 fois au cours de la digestion). Cette étape permettra d'améliorer la dissociation des cellules du foie et de réduire le temps de perfusion de collagénase.
- Lorsque moins de 10 ml de solution de collagénase reste dans le tube de centrifugation, verser 40 à 50 ml de solution de collagénase préchauffé dans le tube de centrifugeuse.
- Après 10-15 minutes de la perfusion et environ 70-80 ml de collagénase Solution perfusés, appliquer une petite pression sur la surface du foie avec une pince. Une copie de la pression indique que les cellules du foie sont dissociés.
- Retirer le foie de la cavité abdominale d'une seule pièce et le placer dans un tube de centrifugeuse contenant 20 à 30 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Gardez les cellules du foie sur la glace ou à 4 ° C pendant une période maximale de 3 heures pour éviter d'affecter la viabilité des cellules du foie.
- Répétez la procédure de perfusion sur plusieurs animaux en cas de besoin, tout en gardant le foie perfusé sur la glace. Piscine de une à trois foies pour la purification et de procéder à l'étape 3.
2. Préparation du gradient de densité de centrifugation (figure 2)
Figure 2:. Préparation du gradient de densité Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. Le protocole SIP est préparée en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice revêtu avec 1,7 ml de 10 x PBS. A 5 ml de SIP sont mélangés avec 15 ml de PBS pour faire SIP solution 20 ml de 25%. 10 ml de SIP sont mélangés avec 10 ml de PBS pour faire une solution de 20 ml de SIP à 50%. Un tube de centrifugation contenant la solution à 50% de SIP (20 ml) est inclinée et la solution SIP à 25% (20 ml) est lentement ajouté en utilisant une pipette sérologique de 25 ml.
- Suivez les étapes suivantes (section 2., 3. et 5.) dans des conditions stériles et garder les cellules sur la glace ou à 4 ° C. Préparer le SIP (solution de particules de silice revêtues isotonique) en mélangeant 15,3 ml de solution de particules de silice enrobée avec 1,7 ml de 10 x PBS. Pour faire 20 ml de solution SIP 25%, mélanger 5 ml de SIP avec 15 ml de PBS. Pour 20 ml de solution de SIP à 50%, mélanger 10 ml de SIP avec 10 ml de PBS.
- Remplir un tube à centrifuger de 20 ml de la solution de SIP à 50%. Incliner le tube de centrifugeuse à un angle proche de 90 ° et ajouter lentement la solution de SIP à 25% (20 ml) sur la paroi latérale du tube en utilisant une 25 ml pipette sérologique, sans toucher la surface de la couche de protocole SIP à 50%. Lors de l'ajout de la solution SIP de 25%, réduire progressivement l'angle du tube. Gardez le gradient de densité sur la glace jusqu'à utilisation.
3. cellules de Kupffer Purification (Figure 3)
Figure 3:. Purification des cellules de Kupffer par gradient de densité centrifugation et l'adhésion cellulaire Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles. (A) Après rupture de la capsule de Glisson la, les cellules du foie sont filtrés à travers un 100 um crépine. La suspension est centrifugée à 50 x g à jeter hépatocytes (pellets) et recueillir la fraction de cellules non parenchymateuses (surnageant). Cette étape est répétée trois fois. Les cellules non-parenchymales sont ajoutés au-dessus d'un gradient discontinu isotonique et centrifugées à 800 xg pendant 15 min. Les cellules de Kupffer recueillies à partir du SIP coussin de 25% sont purifiés en outre par la sélection de l'adhésion cellulaire. (B) Les cellules sont étalées dans une plaque à 24 puits et incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 minutes. Les cellules non adhérentes sont lavées une fois avec 500 ul de HBSS. Les cellules de Kupffer afficher leur adhérente morphologie 4 heures après l'étalement, lorsque -CNTs f peuvent être ajoutés aux cellules. La barre d'échelle représente 25 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Mettez un foie perfusé dans une boîte de Petri avec 15 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. La rupture de la capsule de Glisson la (membrane du foie) en utilisant des ciseaux et libérer toutes les cellules du foie dans le milieu d'isolement des cellules de Kupffer. Filtrer la solution à une cellule si tamis 100 um pour être recueilli dans un tube de centrifugation. Répétez la procédure de perfusion sur foies perfusés supplémentaires et mettre en commun les cellules dans le même tube de centrifugeuse (15 ml à partir d'une souris, jusqu'à 45 ml de trois souris).
- Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 2 min à 4 ° C. Les cellules parenchymateuses (hépatocytes) seront dans le culot et les cellules non-parenchymales (y compris les cellules de Kupffer) seront dans le surnageant.
- Récupérer le surnageant dans un tube à centrifuger propre et centrifuger à 50 x g pendant 2 min chacun. Répétez cette étape trois fois de plus.
- Centrifuger à 1350 xg pendant 15 min pour sédimenter les cellules non parenchymateuses. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne.
- Ajouter la solution de cellules non parenchymateuses du gradient isotonique discontinue 25/50% comme décrit dans 2.3. Centrifuge à 850 g pendant 15 min sans accélération ni pause.
- Localiser la fraction des cellules de Kupffer enrichi trouble apparaissant à l'intérieur de la fraction SIP à 25% près de l'interface SIP 25/50% de (Figure 3). En utilisant une pipette 10 ml sérologique, aspirer environ 12 ml de la fraction enrichie en cellules de Kupffer. Transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse contenant 35-40 ml de cellules de Kupffer Isolation moyenne. Mélanger doucement et centrifuger à 1350 g pendant 15 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules.
- Jeter les cellules surnageant et remettre en 5-10 ml de pré-chauffé cellules Kupffer milieu de culture. Compter les cellules (Hémocytomètre) et de mesurer la viabilité en utilisant une coloration au bleu trypan.
- Plaque les cellules parenchymateuses non purifiés dans des plaques à 24 puits à une densité de 5 x 10 5 cellules / puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 (Figure 3). Après 30 min, retirez délicatement le milieu, laver avec préchauffé solution saline équilibrée de Hank (HBSS) une fois puis remplacezavec 500 pi de frais et préchauffé cellules Kupffer milieu de culture (par puits).
- Donner des cellules de Kupffer pendant au moins 4 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 avant le traitement avec des nanoparticules, à leur permettre d'acquérir leur morphologie adhérente.
4. Caractérisation
- Kupffer cellules Pureté
- Préparer une solution fraîche PBS / BSA utilisé pour maintenir la viabilité des cellules de Kupffer. Laver les cellules une fois avec 500 ul de solution PBS / BSA. Retirer la solution de PBS / BSA et détacher les cellules de Kupffer dans 500 pi de solution fraîche PBS / BSA en utilisant grattant délicatement. Lorsque les cellules sont étalées dans des plaques à 24 puits, de raccourcir les extrémités des lames de raclage avec des ciseaux pour faire le détachement facile de procéder. Transfert cellules dans des tubes de cytométrie en flux.
- Compter les cellules de Kupffer utilisant un hémocytomètre et centrifuger 1 x 10 5 cellules à 1350 x g. Remettre en suspension les cellules de Kupffer dans 30 ul de F4 / 80 anticorps (sans solvant). Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Gardez les cellules non colorées (non incubées avec l'anticorps) sur de la glace.
- Ajouter 2 ml de solution de PBS / BSA dans les cellules colorées, centrifuger à 1350 g pendant 5 minutes et jeter le surnageant résultant. Remettre en suspension les cellules colorées dans 200 ul de PBS / BSA.
- Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l'avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-1 canal.
- Répétez la procédure pour les cellules de Kupffer colorées en gardant les mêmes paramètres utilisés pour la cytométrie de flux des cellules de Kupffer non colorées. Sélectionner et quantifier la fluorescence des cellules colorées pour évaluer la pureté des cellules de Kupffer.
- Kupffer cellules phagocytaires activité
- Remplacez le support avec 0,5% (v / v) des billes fluorescentes dans Kupffer milieu de culture cellulaire et incuber pendant 4 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Afin d'éliminer les billes non intériorisées, les cellules de Kupffer de centrifugeuses à 1350 xg, diSCard les cellules surnageant et remettre en suspension dans 500 pi de PBS / BSA Solution. Répétez cette étape deux fois plus.
- Grattez les cellules de Kupffer dans 500 pi de cellules de solutions et de transfert PBS / BSA dans un tube de cytométrie en flux.
- Centrifugeuse cellules Kupffer à 1350 xg, jeter les cellules surnageant et remettre dans 200 pi de PBS / BSA Solution.
- Pour cytométrie de flux, portail 10.000 pas souillé cellules de Kupffer selon leur taille (de diffusion vers l'avant) et la granularité (diffusion latérale). Analyser la fluorescence des cellules gated dans FL-2 canaux.
5. Incubation chimiquement fonctionnalisés nanotubes de carbone (f -CNTs)
- Préparer une dispersion de -CNTs f (1 mg / ml) dans de l'eau par traitement aux ultrasons pendant 15 minutes avant utilisation. -CNTs F sont préparés en interne 22.
- Préparer 2x NTC f- concentrés dispersion dans Kupffer milieu de culture cellulaire. NTC f- Soniquer dispersées dans le milieu pour2 min avant de passer à l'étape 5.3).
- Pour chaque puits, 250 pi de remplacer les anciens médias avec 250 ul de 2x -CNTs f dispersion. Puits non traités (250 pi de milieu conditionné + 250 pl de cellules fraîches Kupffer milieu de culture) et des puits traités avec 10% de DMSO sont utilisées comme contrôle négatif et positif, respectivement.
- Incuber les cellules de Kupffer à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 ou 72 heures.
6. Évaluation de la toxicité des -CNTs f dans les cellules de Kupffer par la lactate déshydrogénase (LDH) Dosage modification
- Jeter le surnageant.
- Ajouter 200 pi (par puits de plaque de 24 puits) de tampon de lyse et incuber à 37 ° C pendant 30 min-1 heure.
- Après avoir procédé à un pipetage vigoureux, collecter lysé les cellules de Kupffer dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 40 000 xg pendant 10 min pour former un culot -CNTs f qui ont été prises par les cellules et les débris cellulaires.
- Recueillir les surnageants (gratuit ƒ-CNT) dansmicrotubes et conserver à -20 ° C ou passez à l'étape 6.5).
- Transférer 50 ul dans une plaque de 96 puits et ajouter un volume égal de la solution substrat de mélange (kit LDH) à chaque puits. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 min avant d'ajouter 50 ul de la solution d'arrêt (kit LDH). Ajouter triple de puits à blanc contenant 50 ul de tampon de lyse, 50 pi de solution substrat de mélange et 50 ul de solution d'arrêt.
- Lire l'absorbance à 490 nm dans un lecteur de microplaques et utiliser la formule suivante pour calculer la (%) viabilité cellulaire.
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Representative Results
Le nombre de cellules parenchymateuses non purifiées était conforme et a varié entre 8 et 14 x 10 6 cellules par souris (17 isolements ont été réalisées). Chaque isolement de la souris était suffisante à la plaque 16 à 28 puits. La viabilité des cellules par coloration au bleu trypan a montré la viabilité des cellules ~ 95%. Les cellules de Kupffer ont montré une forme ronde dans les 30 minutes d'incubation à 37 ° C, liée à leur morphologie adhérente incomplètes (figure 4A). À 4 h d'incubation et après, cellules ont été étalées et des amas de cellules ont commencé à se former.
Les cellules de Kupffer ont été ensuite caractérisés pour confirmer leur pureté et leur activité phagocytaire. Les cellules ont été colorées avec F4 / 80 anticorps pour démontrer la pureté des cellules de Kupffer. Analyse de cytométrie en flux a révélé une pureté des cellules de Kupffer dessus de 95% (figure 4B). Les cellules ont été incubées avec 1 um billes fluorescentes, 12 heures après l'étalement, pour confirmer leur capacité à prendre de grandes particules. La cytométrie en flux analyse a montré that plus de 85% des cellules de Kupffer sont phagocytaire, soit peut prendre jusqu'à 1 um les perles (figure 4C). Après 72 h de culture, 40% des cellules de Kupffer étaient phagocytaire, indiquant que les cellules de Kupffer partiellement perdu leur activité phagocytaire.
imagerie microscopique des cellules de Kupffer incubées avec -CNTs f pour 24 et 72 h révélé morphologie cellulaire similaire en comparaison de cellules naïves (figure 5A). Les cellules de Kupffer incubées avec 10% de DMSO (contrôle positif) ont une morphologie nécrotique (figure 5A). Suite à l'analyse de l'essai de la LDH modifiée, cellules de Kupffer traitées avec 10% de DMSO (témoin positif) pour 24 et 72 heures ont montré une toxicité élevée (figure 5B). En comparaison, -CNTs f induit une réduction légère mais significative de la viabilité cellulaire uniquement lorsque les cellules ont été exposées à 50 ug / ml pendant 72 heures (figure 5B).
Figure 4: pureté et l'absorption Capacités de cellules de Kupffer (A) des images microscopiques des cellules de Kupffer plaqués après 30 min ou 24 h à 37 ° C avec une atmosphère de 5% de CO 2.. La barre d'échelle présente 50 um. (B) Analyse par cytométrie en flux des cellules de Kupffer a été effectuée suivant FSC / SSC déclenchement de la cellule. Pureté des cellules de Kupffer est déterminée en utilisant F4 / 80 et l'anticorps a montré une coloration au-dessus de 95%. Cellules (C) Kupffer ont été incubées pendant 4 h en présence de 1 um billes fluorescentes afin d'évaluer leur activité phagocytaire. Les propriétés fonctionnelles de Kupffer ont été maintenus dans une meilleure cellules fraîchement isolées (12 h après étalement) par rapport aux cellules testées après 3 jours.
Figure 5: L'absorption et la toxicité des <em> NTC f- dans les cellules de Kupffer. (A) des images de microscopie de cellules de Kupffer. Les images montrent des cellules de Kupffer traitées avec 10% de DMSO et 50 pg / ml de -CNTs f à 37 ° C pendant 24 et 72 heures. La barre d'échelle présente 50 um. (B) Modifié dosage de la LDH. La viabilité des cellules à faible a été observée dans des cellules traitées avec DMSO de 10% (témoins positifs), tandis que f -CNTs affectés de façon significative la viabilité des cellules après une exposition de seulement 50 ug / ml pendant 72 heures. * P <0,05 par rapport à l'état naïf (hors 10% condition de DMSO) en utilisant une analyse de variance (ANOVA à sens unique) avec l'analyse post hoc par le test de Tukey. La barre d'échelle correspond à 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes suivantes sont essentielles pour atteindre un rendement élevé et une haute viabilité des cellules de Kupffer. Des conditions d'asepsie doivent être utilisés pour limiter le risque de contamination bactérienne et fongique. Tous les instruments doivent être stérilisés avant utilisation. Les réactifs doivent être fraîchement préparées avant d'effectuer la procédure d'isolement.
Le choix de la collagénase IV, avec une faible activité tryptique, est crucial. Différents lots provenant du même fournisseur ont une activité enzymatique différente et ils peuvent avoir besoin d'être comparé d'abord pour sélectionner le lot le plus approprié pour l'isolement des cellules de Kupffer. Cela peut être jugé en évaluant le rendement de la cellule et la viabilité des cellules. Il est également recommandé de contacter le fournisseur pour fournir des lots qui ont été utilisés pour des applications similaires. Une fois décidé sur le lot doit être utilisé, le réserver pour une utilisation future.
La procédure de cathétérisme nécessite une formation. Planifier l'utilisation de plusieurs animaux à devenir à l'aise avec la veine porteprocédure de cathétérisme. Avec la pratique, canulation succès sera facilement atteint et la procédure peut être manipulé par une seule personne. A noter que l'utilisation d'animaux lourds augmente le diamètre de la veine porte et donc facilite la procédure. Lorsque le mur arrière de la veine porte est perforé, il est techniquement difficile d'accéder à nouveau la veine, surtout si vous êtes nouveau à cette procédure et donc, il est préférable de commencer avec un nouvel animal.
Les solutions de collagénase HBSS et doivent avoir leur pH a été ajusté à 7,4 et est pré-chauffé à 40 ° C pour atteindre une température de sortie de la pompe péristaltique de 37 ° C. La perfusion avec EGTA / HBSS Solution (Ca 2+ et Mg 2+ libre) contenant de l'EGTA est nécessaire pour la rupture de Ca 2+ molécules d'adhésion dépendantes, nommé desmosomes, ce qui affaiblit l'interaction cellule-cellule. Type de collagénase IV est utilisé pour détacher les cellules du foie à partir de la matrice extracellulaire et ainsi conduire à foiedissociation cellulaire. Le temps de perfusion pour les deux solutions ne doit pas dépasser 15 min pour souris CD1, mais d'autres souches, telles que des souris C57BL / 6, exiger un peu plus long temps de digestion du foie.
Pour obtenir une isolation efficace, il est nécessaire d'obtenir un rendement élevé de cellules et la viabilité. Si l'expérimentateur n'a aucune expérience dans l'isolement des cellules du foie, il est conseillé de combiner des pastilles de hépatocytes des 3 premières centrifugations à 50 xg et compter les cellules par dosage d'exclusion au bleu trypan. Le rendement des hépatocytes devrait être> 20 x 10 6 cellules et l'hépatocyte viabilité> 50%. Les faibles rendements résultent essentiellement des pauvres dissociation cellulaire conduisant indirectement à abaisser le rendement des cellules de Kupffer. Il doit être confirmé que le foie est bien digéré à la fin de l'étape de perfusion. Lorsque le rendement des hépatocytes approprié est réalisé en combinaison avec une faible viabilité des hépatocytes, ce qui peut résulter d'une digestion de collagénase excessive mais est plus probable expliqué par un foie inappropriéprocédure de perfusion ou l'utilisation d'un réactif / matériaux contaminés.
Après le placage, les cellules de Kupffer sont sensibles et doivent être lavés doucement. Au moins 4 heures sont nécessaires pour les cellules de Kupffer d'acquérir leur morphologie adhérente. Le traitement est généralement effectué 4-24 h après l'étalement, les cellules de Kupffer montrent leur activité phagocytaire maximale en 1 jour après l'étalement.
Dans notre protocole, nous décrivons la dissociation de CD1 cellules hépatiques de souris, suivie par la purification de cellules de Kupffer par centrifugation en gradient de densité et de sélection par adhérence. La caractérisation des cellules de Kupffer, par cytométrie de flux, montre que la pureté avec un rendement élevé et des cellules de Kupffer peuvent être obtenues en utilisant cette méthode.
Cette méthode d'isolement des cellules de Kupffer représente un compromis entre la complexité de valeur et le rendement de la cellule. Cependant, il est rapporté que certaines méthodes de cellules de Kupffer peuvent être plus faciles à effectuer, tel que le protocole décrit parWu et al., Où le foie est digéré 23 ex vivo. Cependant, le procédé décrit par Wu et al. conduit à un nombre limité de cellules et de la pureté de la cellule inférieure. Rendement plus élevé et la pureté peuvent être obtenus, mais nécessitent un équipement coûteux et / ou sophistiqué et peuvent prendre beaucoup de temps.
Le protocole initial développé par Smedsrød et al. 16 a utilisé un protocole comparable basé sur la méthode de perfusion 2-étape (HBSS + digestion à la collagénase) suivie d'une centrifugation sur gradient de Percoll et la sélection de la plus faible coussin de Percoll pour une purification supplémentaire par adhérence de surface. En modifiant le mode opératoire de centrifugation et recueillir le coussin supérieur Percoll, nous avons augmenté la fraction enrichie en cellules de Kupffer de 5,25 x 10 6 à 8,2 x 10 6 cellules par gramme de foie. Cette amélioration peut être attribuée à l'utilisation de l'EGTA pendant l'étape de début de la perfusion afin de faciliter la dissociation des cellules du foie. Mn outre, l'utilisation de l'analyse de cytométrie en flux a permis la caractérisation quantitative fiable de la pureté des cellules de Kupffer et l'activité phagocytaire. Avec un rendement maximum de 14 x 10 6 cellules non parenchymateuses purifiés par le foie de la souris. Procédé d'isolement présente réaliser montant plus élevé par des cellules de Kupffer du foie de la souris à ce qui a été rapporté dans la littérature 24. Cette amélioration peut être expliqué par l'utilisation de souris plus lourd (35 à 45 g) par rapport à d'autres méthodes 24. A côté de cette augmentation du rendement de la cellule, l'utilisation de plus gros animaux facilite remarquablement la procédure de cathétérisme veine.
À haut débit dans des tests in vitro peut être effectuée en utilisant ce modèle phagocytaire primaire, imitant ainsi l'impact toxicologique in vivo de nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace. En outre, il est en ligne avecla mise en œuvre du concept de 3 R (réduction, raffinement et remplacement) dans la recherche biomédicale animal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
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