Abstract
רוב הגדול של מחקרי nanotoxicological במבחנה השתמשו שורות תאים הונצחו למעשיות שלהם. עם זאת, תוצאות מבדיקת רעילות ננו-חלקיקים בשורות תאים הונצחו או תאים ראשוניים הראו פערים, המדגישות את הצורך להרחיב את השימוש בתאים ראשוניים למבחנים במבחנה. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של מקרופאגים כבד עכבר, תאי Kupffer בשם, ושימוש בם כדי ללמוד רעילות ננו-חלקיקים. תאי Kupffer הם אוכלוסיית מקרופאג הנפוצה ביותר בגוף ומהווים חלק ממערכת reticulo-אנדותל (RES), אחראית ללכידתו של מחזור חלקיקים. שיטת בידוד תא Kupffer דיווחה כאן מבוססת על שיטת זלוף 2-צעד אחריו טיהור על שיפוע צפיפות. השיטה, המבוססת על מערכת עיכול collagenase וצנטריפוגה צפיפות, מותאמת הפרוטוקול המקורי שפותח על ידי אל Smedsrød et. מיועד לisolatio תא כבד החולדהn ומספק תשואה גבוהה (עד 14 x 10 6 תאים לכל עכבר) וטוהר גבוה (> 95%) של תאי Kupffer. שיטת בידוד זה אינה דורשת ציוד מתוחכם או יקר ולכן מייצגת פשרה אידיאלית בין מורכבות ותשואת תא. השימוש בעכברים כבדים יותר (35-45 גר ') משפר את התשואה של שיטת הבידוד אלא גם מקל להפליא ההליך של cannulation וריד שער. הרעילות של צינורות פחמן פונקציונליות ו -CNTs נמדדה במודל זה על ידי assay LDH שונה. שיטה זו מעריכה כדאיות תא על ידי מדידת חוסר השלמות המבנית של קרום תא Kupffer לאחר דגירה עם -CNTs F. רעילות הנגרמת על ידי -CNTs F ניתן למדוד באופן עקבי באמצעות assay זה, מדגיש כי תאי Kupffer מבודדים שימושיים לבדיקת רעילות ננו-חלקיקים. ההבנה הכוללת של nanotoxicology יכולה להפיק תועלת ממודלים כאלה, מה שהופכת את בחירת ננו-חלקיקים ליותר אפי תרגום קלינימספיק.
Introduction
תחום מחקר nanotoxicology מטרה לאפיין את ההשפעה הביולוגית של חלקיקים. מחקרים רעילים המבוססים על חקירות בvivo להישאר השיטות מדויקות ביותר. עם זאת, השימוש בם מוגבל על ידי דרישות עלות, העבודה וזמנם 1. כחלופות, במבחנה מבחני היו בשימוש בגלל פשטותם ואת האפשרות של פיתוח תפוקה גבוהה בפלטפורמות בדיקת מבחנה 2 - כך מאריכים את מספר התנאים שנבדקו. רוב מחקרי nanotoxicological מבוצעים באמצעות במבחני מבחנה עם שורות תאים הונצחו. עם זאת, קיימים חששות לגבי הניפוח של ממצאי ניסויים אלה להשפעות רעילות in vivo 3. ואכן, את המאפיינים של שורות תאים הנציחו יכולים להיות שונים באופן משמעותי מרקמות שנלקחו מ, למשל שינוי גנטי 4, הידרדרות של תכונות מורפולוגיות מפתח5, אובדן הקוטביות סלולרית 6 ושינויים פונקציונליים כגון הרגולציה של מתווכים דלקתיים 7.
תאי Kupffer הם אוכלוסיית מקרופאג הנפוצה ביותר בגוף והם ישירות במגע עם דם על ידי המצפה את הקיר של sinusoids כבד. כחלק ממערכת reticulo-אנדותל (RES), מקרופאגים אלה הם אחראים ללכידתו של מחזור חלקיקים ולכן, מהווה מודל מתאים ביותר ללמוד רעילות ננו-חלקיקים. בvivo 8 ובמבחנה 9 מחקרים של תגובות דלקתיות הקשורים בתאי Kupffer נחשפו לחלקיקים כבר פורסם במקומות אחרים. תאי Kupffer גם היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות כבד כגון מחלת כבד אלכוהול 10, סיסטיק הכבד 11 או צהבת נגיפית 12. נמסר כי תאי Kupffer מבודדים לספק תובנה שימושי לתאר inv מנגנונים התאיolved בהפרעת כבד 13,14.
כמה שיטות כבר דיווחו לבודד ולטהר תאי Kupffer. בידוד תא יכול לנבוע מניתוק מכאני או אנזימטי 15. עיכול collagenase מראה את היתרון של שמירה על השלמות התפקודית של תאי Kupffer, בעוד שהוביל לתשואת תא הגבוה Kupffer 16. גישות ניסיוניות רבות, שונות במורכבות ועלויות, כבר משמשת להפרדה בין תאי Kupffer מאוכלוסיות תאי כבד אחרים. לדוגמא, טוהר תא Kupffer יכול להיות מושגת על ידי immunoaffinity 17, זרימת אלקטרופורזה 18, הדבקה סלקטיבית 16 או על ידי טכניקות צנטריפוגלי 16, שבחרו תאים בהתאם לגודל וצפיפותם. ניתן לבחור שילוב של שיטות אלה כדי להגדיל את טוהר של האוכלוסייה 16. אין הסכמה על השיטה האידיאלית לבידוד תא Kupffer, כפי שבעיקר תלויה בציוד היישום וזמיןלא. עם זאת, במקרה של בדיקת רעילות ננו-חלקיקים, הפשטות והתשואה גבוהה של הטכניקה הקשורים לשימור התפקודי של תאי Kupffer נראים מתאים ביותר עבור יישום זה.
שיטת בידוד תא Kupffer דיווחה כאן מבוססת על שיטת זלוף 2-צעד אחריו טיהור על שיפוע צפיפות. השיטה הייתה שונה מהפרוטוקול המקורי שפותח על ידי אל Smedsrød et. 16 מיועדים לבידוד תא כבד חולדה. רוב המחקרים שדווחו ותיארו את הבידוד של תאי Kupffer מכבדי חולדה. בזאת, אנו מתארים שיטה לבודד תאי Kupffer מהכבד עכבר, בתשואה גבוהה וטוהר. השימוש בעכברים מפחיתים את עלות הניסוי ומאפשר העיבוד של כמה כבדים להשיג כמויות גדולות של תאי Kupffer לבדיקת רעילות ננו-חלקיקים.
בפרוטוקול הבא, תאי Kupffer הודגרו עם צינורות פחמן פונקציונליות (ו כלומר גבוה אורך יחס קוטר ושטח פנים גדול, עשו מועמדים מעניינים צינוריות כוקטורים למטרות טיפול ואבחון. עם זאת, חששות הועלו בנוגע לרעילות של צינוריות 19, ופיתוח מוצרים החדשים בבדיקות מבחנה שמטרתו להגביר את ההבנה של השפעה ביולוגית CNT. רעילות בתא Kupffer קשורה עם חוסר השלמות מבנית של קרום התא. זו נמדדת על ידי האובדן של LDH אנזים cytoplasmic מהתא לsupernatant. העיקרון של שיטה זו, ולכן, הוא להסיר את כל LDH שוחרר ולמדוד את מה שנותר בתאים 20. הדבר נעשה בהעדפה למדידת LDH שוחרר בsupernatant בגלל הנוכחות של צינוריות בsupernatant מפריעה assay 21.
אנו מציעים את השימוש בmetho בידוד תא Kupffer זה פשוט וחסכוניד לבודד את המספר גבוה של תאי Kupffer פונקציונליים. זה מאפשר ההקרנה של רעילות של מגוון רחב של חלקיקים, במודל מקרופאג עיקרי רלוונטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לכל הנחיות הרלוונטיות, תקנות ורשויות רגולטוריות. הפרוטוקול שמפגינים בוצע תחת הדרכתו ואישורו של משרד הרגולציה בבריטניה הבית
1. זלוף ואוסף נייד (איור 1)
איור 1:. כבד זלוף לאחר ההרדמה של העכבר, מערכת העיכול מועברת רוחבית בצד השמאל של הבטן על מנת להפוך את וריד השער (PV) נגיש. PV הוא cannulated באמצעות קצב זרימה איטי (1-3 מיליליטר / דקה) של פתרון EGTA / HBSS וקאווה veina הנחות (IVC) הוא מייד קרע כדי למנוע לחץ עודף בכבד. כבר בדקה הראשונה של זלוף, קצב הזרימה מוגבר בהדרגה עד 7 מיליליטר / דקה. Collagenase אז הפתרון הוא perfused ב 10 מיליליטר / דקה עד עיכולו המלא מושגת.
- Prepaמחדש טרי כל ריאגנטים מתוארים בטבלת החומר.
- לחמם את EGTA / פתרון HBSS (מאוזן מלח הפתרון של האנק) (אתילן החומצה אצטית טטרה-גליקול) (50 מיליליטר לכל עכבר) וCollagenase הפתרון (לכל עכבר 100 מיליליטר) במשך 30 דקות ב -40 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף את הצינור גמיש המשאבה ראשונה עם 70% אתנול. יוצקים 40 מיליליטר של EGTA / HBSS פתרון לתוך צינור צנטריפוגות השקוע באמבט המים ולשטוף את הצינור גמיש המשאבה עם מראש חימם EGTA / HBSS פתרון.
- לבצע הרדמה מסוף באמצעות תרופות הרגעה ולייצר באופן מהימן חוסר הכרה לפני דיכאון ומוות בדרכי הנשימה. הזרק פנוברביטון ב1 מ"ג / קילוגרם, IP לעכבר נשי או גברי CD1 (35-45 גרם). לאשר את ההרדמה על ידי צביטת הבוהן.
- לגלח שערות בבטן ולעקר את פני השטח הבטן באמצעות 70% אתנול פתרון.
- לחתוך את חלל הבטן ולחשוף את וריד השער ווריד נבוב נחות על ידי הזזת המעי רוחבית בצד השמאל של הבטן.
- כוכביםלא המשאבה במהירות של 1-3 מיליליטר / דקה עם פתרון EGTA / HBSS וcannulate את וריד הפורטל באמצעות מחט פרפר 23 גרם (כנפיים לחתוך). הצמד את הסעיף של וריד שער cannulated עם מחט 23 G ואז להעיף את המלקחיים serrefine על פני השטח של בטן העכבר נפתחה. הכבד צריך חיוור במהירות בתוך 30 שניות הראשונות של זלוף EGTA / HBSS הפתרון.
- במהירות לחתוך את החלק התחתון של נחות הווריד הנבוב, כדי למנוע בניית לחץ עודפת בכבד, ולאחר מכן בהדרגה להגדיל את קצב הזרימה עד 7 מיליליטר / דקה, על הדקה הראשונה של זלוף. בעלי החיים מתים בשל דימום משני לנבובים venipuncture caval.
- כאשר פחות מ 5 מיליליטר של EGTA / HBSS פתרון הוא שנותר לצינור צנטריפוגות, למלא אותו עם Collagenase פתרון (40-50 מיליליטר). להגדיל את קצב הזרימה בהדרגה עד 10 מיליליטר / דקה, יותר מ- 30 שניות.
- הפוך להתנפח הכבד על ידי הפעלת לחץ על הווריד הנבוב הנחות, באמצעות פינצטה, למשך 5-10 מרווחי שניות. תיים ניתן לעשות מעת לעת (5-10 פעמים במהלך עיכול). צעד זה ישפר את תא דיסוציאציה כבד ולצמצם את זמן זלוף עם collagenase.
- , כאשר פחות מ -10 מיליליטר של תמיסת Collagenase נשאר בתוך צינור צנטריפוגות לשפוך 40-50 מיליליטר של תמיסת Collagenase מראש חימם לתוך צינור צנטריפוגות.
- לאחר 10-15 דקות של זלוף ועל 70-80 מיליליטר של Collagenase פתרון perfused, להחיל לחץ קטן על פני השטח של הכבד עם מלקחיים. הדפסה של הלחץ מצביעה על כך שתאי כבד הם ניתקו.
- הסר את הכבד מחלל הבטן כחתיכה אחת ולמקם אותו בצינור צנטריפוגות המכיל 20-30 מיליליטר של בידוד תאי Kupffer בינוני. שמור את תאי כבד על קרח או על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 3 שעות, כדי למנוע משפיעים על כדאיויות תא כבד.
- חזור על תהליך זלוף בכמה בעלי חיים במידת צורך, תוך שמירה על כבד perfused על קרח. בריכה 2:59 כבדים לטיהור ולהמשיך בשלב 3.
2. הכנת שיפוע הצפיפות לצנטריפוגה (איור 2)
איור 2:. הכנת שיפוע הצפיפות כל ההליכים מתבצעים בתנאים סטריליים. SIP הוא מוכן על ידי ערבוב 15.3 מיליליטר של תמיסת חלקיקי סיליקה המצופה עם 1.7 מיליליטר של 10 x PBS. 5 מיליליטר של SIP מעורבב עם 15 מיליליטר של PBS לעשות 20 מיליליטר של 25% פתרון SIP. 10 מיליליטר של SIP מעורבב עם 10 מיליליטר של PBS לעשות 20 מיליליטר של 50% פתרון SIP. צינור צנטריפוגות מכיל את הפתרון של 50% SIP (20 מיליליטר) מוטה ופתרון SIP 25% (20 מיליליטר) הוא הוסיף באיטיות בעזרת פיפטה מיליליטר סרולוגיות 25.
- המשך בשלבים הבאים (סעיף 2., 3. ו5.) בתנאים סטריליים ולשמור על תאים על קרח או על 4 מעלות צלזיוס. הכן את SIP (הפתרון של חלקיקי סיליקה משקה מצופים) על ידי ערבוב 15.3 מיליליטר של תמיסת חלקיקי סיליקה המצופה עם 1.7 מיליליטר של 10 x PBS. כדי להפוך 20 מיליליטר של 25% פתרון SIP, לערבב 5 מיליליטר של SIP עם 15 מיליליטר של PBS. כדי להפוך 20 מיליליטר של 50% פתרון SIP, לערבב 10 מיליליטר של SIP עם 10 מיליליטר של PBS.
- מלא צינור צנטריפוגות אחד עם 20 מיליליטר של פתרון SIP 50%. הטה את צינור צנטריפוגות בזווית קרובה ל 90 מעלות ולאט להוסיף את הפתרון של 25% SIP (20 מיליליטר) על הקיר בצד של הצינור בעזרת פיפטה 25 מיליליטר סרולוגית, בלי לגעת במשטח של שכבת SIP 50%. בעת הוספת פתרון SIP 25%, בהדרגה להפחית את הזווית של הצינור. שמור את שיפוע הצפיפות על קרח עד לשימוש.
3. טיהור סלולארי Kupffer (איור 3)
איור 3:. טיהור של תאי Kupffer על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות והידבקות תא כל ההליכים מתבצעים בתנאים סטריליים. (א) לאחר הקרע של הקפסולה של Glisson, מסוננים תאי כבד דרך 100 מיקרומטר מסננת. ההשעיה היא centrifuged בx 50 גרם להתעלמות hepatocytes (כדורים) ולאסוף את החלק הלא parenchymal התא (supernatant). צעד זה חוזר על עצמו 3 פעמים. תאים הלא parenchymal מתווספים על גבי שיפוע איזוטוני רציף וcentrifuged ב 800 XG במשך 15 דקות. תאי Kupffer נאספו מכרית SIP 25% הם מטוהרים עוד יותר על ידי בחירת הידבקות תא. תאים (ב ') הם מצופים בצלחת 24 גם וטופחו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. תאים שאינם חסיד נשטפים פעם עם 500 μl של HBSS. תאי Kupffer להציג מורפולוגיה 4 שעות החסידות לאחר ציפוי, כאשר ניתן להוסיף -CNTs F לתאים. סרגל קנה המידה מייצג 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- שים כבד perfused אחד בצלחת פטרי עם 15 מיליליטר של בידוד תא Kupffer בינוני. קרע הכמוסה של Glisson (קרום של הכבד) באמצעות מספריים ולשחרר את כל תאי הכבד לתוך מדיום בידוד תא Kupffer. סנן את הפתרון אם כי מסננת תא 100 מיקרומטר שתיגבה בצינור צנטריפוגות. חזור על תהליך זלוף על כבדי perfused נוספים וברכת התאים באותו הצינור צנטריפוגות (15 מיליליטר מעכבר אחד, עד 45 מיליליטר משלושה עכברים).
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG למשך 2 דקות על 4 מעלות צלזיוס. תאי parenchymal (hepatocytes) יהיו בגלולה והתאים הלא parenchymal (כוללים תאי Kupffer) יהיו בsupernatant.
- לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגות נקי וצנטריפוגות ב 50 XG במשך 2 דקות כל אחד. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות.
- צנטריפוגה ב 1,350 XG במשך 15 דקות עד גלולה תאים הלא parenchymal. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של בידוד תא Kupffer בינוני.
- מוסיף את פתרון התא הלא parenchymal על השיפוע איזוטוני רציף 25/50% כפי שמתואר ב2.3. סנטrifuge ב 850 XG במשך 15 דקות ללא האצה או הפסקה.
- למקם את החלק היחסי של תאי Kupffer המועשר מופיע עכור בתוך 25% חלק SIP הקרוב לממשק SIP 25/50% (איור 3). באמצעות פיפטה 10 מיליליטר סרולוגית, לשאוב כ -12 מיליליטר של שבריר תא Kupffer המועשר. העברת תאים לתוך צינור צנטריפוגות המכיל 35-40 מיליליטר של בידוד תא Kupffer בינוני. מערבבים בעדינות וצנטריפוגות ב 1,350 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C עד גלולה תאים.
- מחק את תאי supernatant וגלולים ב5-10 מיליליטר של תאי Kupffer מראש חיממו תרבות בינונית. ספירת תאים (haemocytometer) ולמדוד את הכדאיות באמצעות מכתים trypan הכחול.
- צלחת התאים הלא parenchymal המטוהרים בצלחות 24 גם בצפיפות של 5 x 10 5 תאים / טוב. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (איור 3). לאחר 30 דקות, להסיר בעדינות בינונית, לשטוף עם טרום חימם מאוזן מלח הפתרון של האנק (HBSS) פעם אחת ולאחר מכן להחליףזה עם 500 μl של תא Kupffer הטרי ומראש חימם תרבות בינונית (בכל טוב).
- השאר תאי Kupffer לפחות 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני הטיפול עם חלקיקים, כדי לאפשר להם לרכוש מורפולוגיה החסידה.
4. אפיון
- טוהר תאי Kupffer
- הכן את פתרון PBS / BSA טרי משמש כדי לשמור על כדאיות תא Kupffer. לשטוף את תאי פעם אחת עם 500 μl של פתרון PBS / BSA. הסר את פתרון PBS / BSA ולנתק תאי Kupffer ב500 μl של פתרון PBS / BSA הטרי באמצעות גירוד עדין. כאשר תאים מצופה בלוחות 24 גם, לקצר את הגפיים של להבי מגרד במספריים כדי להפוך קל יותר הניתוק כדי להמשיך. העבר את התאים לתוך cytometry זרימת צינורות.
- ספירת תאי Kupffer באמצעות haemocytometer צנטריפוגות 1 x 10 5 תאים ב1,350 x גרם. תאי Resuspend Kupffer בμl 30 של F4 / 80 נוגדן (מסודר). מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. שמור את התאים בלא כתם (לא הודגרו עם הנוגדן) על קרח.
- הוסף 2 מיליליטר של תמיסת PBS / BSA בתאים מוכתמים, צנטריפוגות ב 1,350 גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant וכתוצאה מכך. Resuspend תאים מוכתמים ב200 μl של PBS / BSA.
- לניתוח cytometry זרימה, שער 10,000 בלא כתם תאי Kupffer פי גודלם (פיזור קדימה) וגרעיניות (פיזור צד). ניתוח הקרינה של תאים מגודרות בערוץ FL-1.
- חזור על התהליך עבור תאי Kupffer מוכתמים שמירה אותן הגדרות המשמשות לניתוח cytometry הזרימה של תאי Kupffer בלא כתם. בחר ולכמת את הקרינה של תאים מוכתמים להעריך את טוהר של תא Kupffer.
- תא Kupffer phagocytic פעילות
- החלף תקשורת עם 0.5% (V / V) חרוזי ניאון בתא Kupffer תרבות בינוני ודגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- על מנת להסיר חרוזים לא הפנימו, תאי Kupffer צנטריפוגות ב 1,350 XG, discard תאי supernatant וגלול ב500 μl PBS / BSA פתרון. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר.
- תאים לגרד Kupffer ב500 μl של תאי פתרון והעברת PBS / BSA לcytometry זרימת צינור.
- תאי צנטריפוגה Kupffer ב1,350 XG, להשליך את תאי supernatant וגלולים ב200 μl של PBS / BSA פתרון.
- לניתוח cytometry זרימה, שער 10,000 בלא כתם תאי Kupffer פי גודלם (פיזור קדימה) וגרעיניות (פיזור צד). ניתוח הקרינה של תאים מגודרות בFL-2 ערוץ.
5. דגירה של כימי פחמן פונקציונליות (ו -CNTs)
- הכן פיזור של -CNTs f (1 מ"ג / מיליליטר) במים על ידי sonication במשך 15 דקות לפני השימוש. -CNTs F ערוכים-בית 22.
- הכן 2x צינוריות F- מרוכזים פיזור בתא Kupffer תרבות בינוני. צינוריות F- Sonicate מפוזרות במדיום ל2 דקות לפני שתמשיך עם שלב 5.3).
- לכל טוב, להחליף 250 μl של המדיה ישנה עם 250 μl של פיזור -CNTs ו 2x. בארות שלא טופלו (250 μl של מדיום + 250 μl המותנה של תא Kupffer הטרי תרבות בינונית) ובארות מטופלים עם DMSO 10% משמשות כביקורת שלילית וחיובית, בהתאמה.
- דגירה תאי Kupffer על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 או 72 שעות.
6. רעילות הערכת -CNTs F בתאי Kupffer על ידי קטט דהידרוגנז (LDH) Assay השתנה
- בטל supernatant.
- הוסף 200 μl (לכל גם צלחת 24 גם) של תמוגה הצפת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 שעות דקות-1.
- לאחר ביצוע pipetting הנמרץ, לאסוף lysed תאי Kupffer לתוך צינורות microcentrifuge וצנטריפוגות ב 40,000 XG במשך 10 דקות עד גלולה -CNTs F שנלקחו על ידי תאים ופסולת התא.
- לאסוף supernatants (חינם ƒ-CNT) לצינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C או המשיכו לשלב 6.5).
- העברה 50 μl לתוך צלחת 96-היטב ולהוסיף נפח שווה של פתרון שילוב מצע (ערכת LDH) זה טוב. מכסה את הצלחת ודגירה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות לפני הוספת 50 μl של פתרון התחנה (ערכת LDH). להוסיף triplicates של בארות ריקות המכילות 50 μl של חיץ תמוגה, 50 μl של פתרון שילוב מצע ו -50 μl של פתרון תחנה.
- קראו את הספיגה ב 490 ננומטר בקורא microplate ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את (%) כדאיות תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מספר תאי parenchymal שאינם מטוהרים היה עקבי ונע בין 8 ל 14 x 10 6 תאים לכל עכבר (17 בידודים בוצעו). כל בידוד עכבר היה מספיק לצלחת 16-28 בארות. תא כדאיות ידי צביעת trypan הכחולה הראתה תא כדאיות ~ 95%. תאי Kupffer הראו צורה עגולה בתוך 30 דקות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, הקשורים למורפולוגיה חסיד שלמה שלהם (איור 4 א). ב 4 שעות של דגירה ולאחר מכן, תאים להתפשט וצבירי תאים התחילו ליצור.
תאי Kupffer אז אופיינו כדי לאשר טוהר שלהם ופעילות phagocytic. תאים הוכתמו F4 / 80 נוגדן כדי להדגים את טוהר תא Kupffer. ניתוח תזרים cytometry הראה טוהר תא Kupffer מעל 95% (איור 4). תאים הודגרו עם 1 מיקרומטר חרוזי ניאון, 12 שעות לאחר ציפוי, כדי לאשר את היכולת שלהם לקחת את החלקיקים גדולים. Cytometry זרימת הניתוח הראה thaלא יותר מ -85% מתאי Kupffer הם phagocytic, כלומר יכול לקחת את חרוזים 1 מיקרומטר (איור 4C). לאחר 72 שעות של תרבות, 40% מתאי Kupffer היו phagocytic, מצביעים על כך שתאי Kupffer חלקי איבדו פעילות phagocytic.
הדמיה מיקרוסקופית של תאי Kupffer מודגרות עם -CNTs F 24 ו -72 שעות חשפה מורפולוגיה תא דומה בהשוואה לתאים נאיביים (איור 5 א). תאי Kupffer מודגרות עם 10% DMSO (בקרה חיובית) מוצגים מורפולוגיה נמקים (איור 5 א). בעקבות הניתוח של assay LDH שונה, תאי Kupffer טופלו עם 10% DMSO (בקרה חיובית) במשך 24 ו -72 שעות הראו רעילות גבוהה (איור 5). לשם השוואה, -CNTs F מושרה ירידה קלה אך משמעותית בכדאיויות תא רק כאשר תאים נחשפו בגיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 72 שעות (איור 5).
יכולות טוהר וספיגה של תאי Kupffer () תמונות מיקרוסקופיות של תאי Kupffer מצופים לאחר 30 דקות או 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם אווירה של 5% CO 2: איור 4.. סרגל קנה המידה מציג 50 מיקרומטר. (ב) Cytometry זרימת הניתוח של תאי Kupffer בוצע הבא FSC / gating תא SSC. טוהר תא Kupffer נקבע באמצעות F4 / מכתים נוגדן 80 והראה להיות מעל 95%. תאים (C) Kupffer הודגרו במשך 4 שעות בנוכחות של 1 מיקרומטר חרוזי ניאון כדי להעריך את פעילות phagocytic. התכונות הפונקציונליות של Kupffer נשמרו טובות יותר בתאים המבודדים טרי (12 שעות לאחר ציפוי) בהשוואה לתאים שנבדקו לאחר 3 ימים.
איור 5: ספיגה ורעילות של <em> צינוריות זיונים בתאי Kupffer. () תמונות מיקרוסקופית של תאי Kupffer. תמונות מראות תאי Kupffer טופלו ב/ מיליליטר DMSO ו -50 מיקרוגרם 10% מ-CNTs ו ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ו- 72. סרגל קנה המידה מציג 50 מיקרומטר. assay LDH השתנה (B). כדאיות תא נמוכות נתפסו בתאי 10% DMSO שטופל (בקרות חיוביות) תוך -CNTs F המושפע באופן משמעותי את כדאיויות תא רק לאחר החשיפה ל -50 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 72 שעות. * P <0.05 ביחס למצב הנאיבי (לא כולל 10% מצב DMSO) באמצעות ניתוח שונות (בכיוון אחד ANOVA) עם ניתוח שלאחר הוק על ידי מבחן Tukey. סרגל קנה המידה מתאים ל -50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הבאים הם קריטיים להשגת תשואה גבוהה וכדאיות גבוהה של תאי Kupffer. יש להשתמש בתנאי אספטי להגביל את הסיכון של זיהום חיידקים ופטריות. כל המכשירים צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש. ריאגנטים צריכים להיות מוכנים טריים לפני ביצוע הליך הבידוד.
הבחירה של IV collagenase, עם פעילות tryptic נמוכה, היא חיונית. יש לי המון שונה מאותו הספק פעילות האנזימטית שונה והם ייתכן שיהיו הצורך בהשוואה תחילה כדי לבחור את המנה המתאימה ביותר לבידוד תא Kupffer. זה יכול להישפט על ידי הערכת תשואת תא וכדאיויות תא. מומלץ גם ליצור קשר עם הספק לספק קבוצות שהיה בשימוש עבור יישומים דומים. החליט פעם אחת על אצווה כדי לשמש, להזמין אותו לשימוש עתידי.
הליך cannulation דורש אימון. לתכנן את השימוש בבעלי חיים שונים כדי להפוך בטוח עם וריד הפורטלהליך cannulation. בעזרת תרגול, cannulation המוצלח יושג בקלות ובהליך יכול להיות מטופלים על ידי אדם אחד. שים לב שהשימוש בבעלי החיים כבדים מגדיל את הקוטר של וריד השער, ולכן מאפשר את ההליך. כאשר הקיר האחורי של וריד השער מחורר, זה קשה מבחינה טכנית כדי לגשת לווריד שוב, במיוחד אם אתה חדש בהליך זה, ולכן, עדיף להתחיל עם בעלי חיים חדשים.
פתרונות HBSS וCollagenase צריכים pH שלהם מותאם ל7.4 ולהיות מחומם מראש ב 40 ° C כדי להשיג טמפרטורת פלט ממשאבת הנפיחה של 37 מעלות צלזיוס. זלוף עם EGTA / HBSS פתרון (Ca 2 + וMg 2 + חינם) יש צורך EGTA מכיל לשיבוש Ca 2 + מולקולות הידבקות -dependent, desmosome שם, מחליש את האינטראקציה תאי תאים. סוג IV collagenase משמש לניתוק תאי כבד מהמטריצה תאית וכך להוביל לכבדתא ניתוק. זלוף הזמן לשני פתרונות לא יעלה על 15 דקות לעכברי CD1 אבל זנים אחרים, כגון C57Bl / 6, דורש זמן עיכול כבד מעט יותר.
כדי להשיג בידוד מוצלח, יש צורך להשיג תשואת תא גבוהה ויכולת קיום. אם הנסיין אין לו ניסיון בבידוד תא כבד, מומלץ לשלב כדורי hepatocytes מ3 centrifugations הראשון בגיל 50 XG ולספור תאים על ידי assay הדרת trypan הכחול. תשואת hepatocyte צריכה להיות> 20 x 10 6 תאים ואת כדאיות hepatocyte> 50%. תשואות נמוכות לגרום במהותה מהתא דיסוציאציה עניה מובילות בעקיפין להורדת תשואת תא Kupffer. יש אישר כי הכבד מתעכל כראוי בסוף שלב זלוף. כאשר תשואת hepatocyte המתאימה מושגת בשילוב עם יכולת קיום hepatocyte הנמוך, זה יכול להיגרם כתוצאה מעיכול collagenase מוגזם אבל הוא סביר יותר שהוסבר על ידי כבד בלתי הולםהליך זלוף או שימוש במגיב / חומר מזוהם.
לאחר ציפוי, תאי Kupffer רגישים ויש לשטוף בעדינות. לפחות 4 שעות דרושות לתאי Kupffer לרכוש מורפולוגיה החסידה. הטיפול מתבצע בדרך כלל מתוך 4-24 שעות לאחר ציפוי, כמו תאי Kupffer להראות פעילות phagocytic המרבית שלהם תוך יום 1 לאחר ציפוי.
בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים את הניתוק של תאי כבד עכבר CD1 אחרי הטיהור של תאי Kupffer על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ובחירה על ידי הידבקות. האפיון של תאי Kupffer, על ידי cytometry זרימה, מוכיח כי תשואה גבוהה וטוהר של תאי Kupffer יכולים להיות מושגת באמצעות שיטה זו.
שיטת בידוד תא זה Kupffer מהווה פשרה בין ערך מורכבות ותשואת תא. עם זאת, הוא דיווח כי שיטות תא מסוימות Kupffer יכולות להיות קלה יותר לנהל, כגון הפרוטוקול שתואר על ידיוו et al., שבו הכבד מתעכל vivo לשעבר 23. עם זאת, השיטה שתוארה על ידי אל וו ואח. מוביל לכמות מוגבלת של תאים וטוהר תא תחתון. ניתן להשיג תשואה גבוהה יותר וטוהר אך דורשים ציוד יקר ו / או מתוחכם ויכולות להיות זמן רב.
הפרוטוקול המקורי שפותח על ידי Smedsrød et al. 16 השתמש בפרוטוקול דומה המבוסס על שיטת 2-צעד זלוף (HBSS + עיכול collagenase) ואחריו צנטריפוגה בשיפוע Percoll ובחירה של כרית Percoll הנמוכה לטיהור נוספת על ידי הדבקת משטח. על ידי שינוי הליך צנטריפוגה ואיסוף כרית Percoll העליונה, הגדלנו את החלק היחסי של תאי Kupffer המועשר מ5.25 x 10 6-8.2 x 10 6 תאים לגרם של כבד. שיפור זה ניתן לייחס לשימוש בEGTA במהלך השלב המוקדם זלוף על מנת להקל הניתוק של תאים כבד. Moreover, השימוש בניתוח התזרים cytometry אפשר אפיון הכמות אמין של טוהר תא Kupffer ופעילות phagocytic. עם תשואה מקסימלית של 14 x 10 6 תאים הלא parenchymal מטוהרים לכבד עכבר. שיטת הבידוד הנוכחית להשיג סכום גבוה יותר של תאי Kupffer לכבד עכבר למה שדווח בספרות 24. שיפור זה יכול להיות מוסבר על ידי השימוש בעכבר כבד יותר (35-45 גר ') בהשוואה לשיטות אחרות 24. לצד הגידול בתשואת תא, השימוש בבעלי חיים גדולים יותר מקל להפליא ההליך של cannulation וריד שער.
תפוקה גבוהה בבדיקות מבחנה יכולה להתבצע באמצעות מודל phagocytic עיקרי זה, ולכן מחקה את ההשפעה הרעילה in vivo של חלקיקים. ההבנה הכוללת של nanotoxicology יכולה להפיק תועלת ממודלים כאלה, מה שהופכת את בחירת ננו-חלקיקים לתרגום קליני יעילה יותר. בנוסף, הוא נמצא בקו אחד עםיישום הרעיון של 3 R (הפחתה, עידון והחלפה) במחקר הביו-רפואי בבעלי החיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
