Abstract
Большинство в пробирке nanotoxicological исследований использовали увековечены клеточных линий для их практичности. Тем не менее, результаты испытаний на токсичность наночастиц в бессмертных клеточных линий или первичных клеток показали расхождения, подчеркнув необходимость расширить использование первичных клеток для анализов в пробирке. Этот протокол описывает выделение макрофагами печени мышей, названные клетки Купфера, и их использование для изучения наночастиц токсичности. Купфер клетки наиболее распространенным населения макрофагов в организме и составляют часть ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), ответственного за захват циркулирующих наночастиц. Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Метод, основанный на коллагеназы пищеварения и центрифугирования в градиенте плотности, приспособлен от оригинального протокола, разработанного Smedsrød др. предназначен для крыс isolatio клеток печенин и обеспечивает высокий выход (до 14 × 10 6 клеток на мышь) и высокой чистоты (> 95%) в клетках Купфера. Этот метод изоляции не требует сложного или дорогостоящего оборудования и, следовательно, представляет собой идеальный компромисс между сложностью и выходом клеток. Использование более тяжелых мышей (35-45 г) улучшает выход способа выделени, но также облегчает заметно процедуру катетеризации воротной вены. Токсичность функционализированных углеродных нанотрубок F -CNTs измеряли в этой модели с помощью модифицированного LDH анализа. Этот метод оценивает жизнеспособность клеток путем измерения отсутствие структурной целостности клеточной мембраны купферовских после инкубации с F -CNTs. Токсичность индуцируется F -CNTs может быть измерена с помощью последовательно этот анализ, подчеркнув, что изолированные клетки Купфера полезны для тестирования наночастиц токсичности. Общая понимание нанотоксикологии могли извлечь выгоду из таких моделей, что делает выбор наночастиц для клинического перевода более эффекциент.
Introduction
Поле нанотоксикологии исследований направлена охарактеризовать биологическое действие наночастиц. Токсикологические исследования, основанные на исследованиях в естественных условиях остаются наиболее точных методов. Тем не менее, их применение ограничено их стоимости, трудовых и временных требований 1. Как анализы альтернатив, в пробирке были использованы из-за их простоты и возможности разработки высокой пропускной в пробирке тестирования платформ 2 - так увеличения количества тестируемых условиях. Большинство nanotoxicological исследования проводили с использованием в анализах пробирке с иммортализованных клеточных линий. Тем не менее, существуют опасения относительно экстраполяции этих экспериментальных данных в естественных условиях токсикологических эффектов 3. Действительно, свойства иммортализованных клеточных линий может быть существенно отличается от тканей они были получены из, например, генетической трансформации 4, ухудшение ключевых морфологических признаков5, потеря сотовой полярности 6 и функциональных изменений, таких как регулирование медиаторов воспаления 7.
Клетки Купфера являются наиболее распространенными население макрофагов в организме и непосредственно в контакте с кровью, выравнивая стенки синусоиды печени. В рамках ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), эти макрофаги несут ответственность за захват циркулирующих наночастиц и поэтому представляют собой весьма подходящую модель для изучения наночастиц токсичности. В естественных условиях 8 и в пробирке были опубликованы в другом месте 9 исследования воспалительных реакций, связанных с клетками Купфера, подверженных наночастиц. Клетки Купфера также участвуют в патогенезе заболеваний печени, таких как алкогольная болезнь печени, 10 фиброза печени 11 или вирусного гепатита 12. Было сообщено, что изолированные клетки Купфера обеспечить полезную информацию для описания клеточных механизмов инвolved к нарушению печени 13,14.
Несколько методов были зарегистрированы для выделения и очистки клетки Купфера. Изолятор может быть результатом механического или ферментативного разложения 15. Коллагеназа пищеварения показывает преимущество сохранения функциональной целостности клеток Купфера, в то время как ведущие к высокой доходности купферовских клеток 16. Многие экспериментальные подходы, различные по сложности и затрат, были использованы, чтобы отделить клетки Купфера от других популяций клеток печени. Например, чистота Купфера клетка может быть достигнуто с помощью иммуноаффинной 17, электрофорез поток 18, селективной адгезии 16 или центробежными методами 16, которые отбирают клетки в зависимости от их размера и плотности. Сочетание этих методов может быть выбран, чтобы повысить чистоту населения 16. Там нет консенсуса о идеального метода для выделения клеток Купфера, а это в основном зависит от применения и имеющихся оборудование длят. Тем не менее, в случае испытаний на токсичность наночастиц, простота и высокий выход техники, связанной с сохранением функциональной клетки Купфера оказались наиболее подходящим для этого применения.
Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Этот метод был модифицирован из исходной протоколу, разработанному Smedsrød др. 16 предназначен для выделения клеток печени крысы. Большинство исследований сообщает и описал изоляции клеток Купфера печени крыс с. При этом мы опишем метод, чтобы изолировать клетки Купфера печени от мыши, с высоким выходом и чистотой. Использование мышей снижает стоимость эксперимента и позволяет обработка нескольких печени, чтобы получить большие количества клеток Купфера для тестирования наночастиц токсичности.
В следующем протоколе, клетки Купфера инкубировали с функционализированных углеродных нанотрубок (е т.е. высокое отношение длины к диаметру и большой площадью поверхности, сделали УНТ интересных кандидатов в качестве векторов для целей терапии и диагностики. Тем не менее, проблемы были подняты о токсичности УНТ 19 и разработке новых в пробирке тесты направлена на повышение понимания УНТ биологического эффекта. Токсичность в Клетка Купфера связано с отсутствием структурной целостности клеточных мембран. Этот процесс измеряется потерей цитоплазматического фермента ЛДГ из клетки в супернатанте. Принцип этого метода, таким образом, чтобы удалить любой выпущенный ЛДГ и измерить то, что осталось в клетках 20. Это делается в предпочтении к измерению выпущенный ЛДГ в супернатанте, так как наличие нанотрубок в надосадочной жидкости мешает анализа 21.
Мы предлагаем использовать этот простой и экономически эффективной мето изоляции Купфера клеткиd, чтобы изолировать большое количество функциональных клеток Купфера. Это позволяет скрининг токсичности в диапазоне наночастиц, в соответствующей первичной модели макрофагов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были выполнены в соответствии со всеми соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Протокол демонстрируется была выполнена под руководством и утверждении Положения внутренних дел Великобритании
1. перфузии и сбора клеток (рисунок 1)
Рисунок 1:. Печень перфузии после анестезии мыши, желудочно-кишечного тракта в боковом перемещении влево живота для того, чтобы в портальную вену (PV) доступной. П.В. канюлю с помощью медленной скорости потока (1-3 мл / мин) EGTA / HBSS раствора и низший veina вены (НПВ) немедленно разрывается, чтобы избежать избыточного давления в печени. В первую минуту перфузии, расход постепенно повышают до 7 мл / мин. Раствора коллагеназы затем перфузии при 10 мл / мин до тех пор, его полное переваривание пока не будет достигнута.
- Подготовительномповторно свежую все реагенты, описанные в таблице материала.
- Теплый EGTA (этиленгликоль тетра-уксусной кислоты) / HBSS (Хэнка сбалансированный солевой раствор) раствор (50 мл на мышь) и раствором коллагеназы (100 мл на мышь) в течение 30 мин при 40 ° С.
- Промыть насос гибкий шланг сначала 70% -ным этанолом. Налейте 40 мл ЭГТА / HBSS раствора в пробирку для центрифугирования, погруженного в ванну с водой и ополосните насоса гибкий шланг с подогретого ЭГТА / HBSS решение.
- Выполните терминала анестезии с использованием барбитурата надежно производить бессознательное, прежде дыхания и смерти. Вводите фенобарбитал в дозе 1 мг / кг, IP в женской или мужской CD1 мыши (35-45 г). Подтвердите анестезия пальца щипать.
- Бритье волос брюшной и стерилизовать в животе поверхность, используя 70% раствор этанола.
- Вырезать через брюшную полость и подвергать воротной вены и нижней полой вены путем перемещения в кишечник в поперечном направлении к левой части брюшной полости.
- Звездат насос со скоростью 1-3 мл / мин с EGTA / HBSS раствора и иглу в портальную вену с использованием 23 г бабочка иглы (обрезают крылья). Зажмите раздел воротной вены канюлированного с 23 G иглой, а затем переверните сосудистый зажим пинцет на поверхности открытой брюшной полости мыши. Печень должна быстро бледно в течение первых 30 сек ЭГТА / ССРХ Solution перфузии.
- Быстро надрезать нижнюю часть нижней полой вены, чтобы избежать избыточного давления здания в печени, а затем увеличить скорость потока постепенно до 7 мл / мин, в течение первой минуты перфузии. Животное умирает из-за кровотечения вторичной полой вены венепункции.
- При менее 5 мл / ЭГТА HBSS решение является оставшиеся в центрифужную пробирку, заполнить его с раствором коллагеназы (40-50 мл). Увеличение скорости потока постепенно до 10 мл / мин, в течение 30 сек.
- Сделать выпуклость печени путем приложения давления к нижней полой вене, с помощью пинцета, в течение 5-10 с интервалами. Тхис может быть сделано периодически (в 5-10 раз во время пищеварения). Этот шаг позволит повысить диссоциации клеток печени и сократить время перфузии коллагеназой.
- При менее чем 10 мл раствора коллагеназы остается в центрифужную пробирку, заливают 40-50 мл подогретого раствора коллагеназы в центрифужную пробирку.
- После 10-15 мин перфузии и 70-80 мл раствора коллагеназы перфузии, нанесите небольшое давление на поверхности печени с пинцетом. Печати давления указывает, что клетки печени диссоциируют.
- Удалить печень от брюшной полости, как один кусок и поместить его в центрифужную пробирку, содержащую 20-30 мл клеток Купфера изоляции Medium. Хранить клетки печени на льду или при 4 ° С в течение максимального периода 3 часов, чтобы избежать влияния на жизнеспособность клеток печени.
- Повторите процедуру перфузии на нескольких животных, если это необходимо, при сохранении печени, поддерживаемой перфузией на льду. Бассейн 2:59 печени для очистки и заполните стадии 3.
2. Подготовка градиент плотности для центрифугирования (Рисунок 2)
Рисунок 2:. Подготовка градиента плотности Все процедуры проводятся в стерильных состоянии. SIP получают путем смешивания 15,3 мл раствора с покрытием частиц кремнезема с 1,7 мл 10 х PBS. Через 5 мл SIP смешивают с 15 мл PBS, чтобы 20 мл 25% -ного раствора SIP. 10 мл SIP смешивают с 10 мл PBS, чтобы 20 мл 50% -ного раствора SIP. Центрифужную пробирку, содержащую 50% раствора SIP (20 мл) наклонена и 25% -ный раствор SIP (20 мл) медленно добавляют с помощью пипетки мл серологической 25.
- Перейдите с помощью следующих шагов (раздел 2., 3. и 5.) под стерильном состоянии и сохранить клетки на льду или при 4 ° С. Подготовка SIP (решение изотонический покрытием частиц кремнезема) путем смешивания 15,3 мл раствора с покрытием частиц кремнезема с 1,7 мл 10 х PBS. Для того, чтобы 20 мл 25% -ного раствора SIP, смешать 5 мл SIP с 15 мл PBS. Для того, чтобы 20 мл 50% -ного раствора SIP, смешать 10 мл SIP с 10 мл PBS.
- Наполните одну центрифужную пробирку с 20 мл 50% раствора SIP. Наклон центрифужную пробирку под углом, близким к 90 ° и добавить медленно в 25% -ный раствор SIP (20 мл) на боковой стенке трубы с помощью 25 мл серологической пипеткой, не касаясь поверхности 50% SIP слоя. При добавлении 25% -ного раствора SIP, постепенно уменьшить угол трубки. Держите градиент плотности на льду до использования.
3. Клетка Купфера Очистка (Рисунок 3)
Рисунок 3:. Очистка клетки Купфера центрифугированием в градиенте плотности и адгезии клеток Все процедуры проводятся в стерильных состоянии. (А) После разрыва капсулы в Глиссона, в клетки печени фильтруют через 100 мкм фильтр. Суспензию центрифугируют при х 50 г, чтобы отменить гепатоциты (пеллеты) и собрать без паренхимы фракции клеток (супернатант). Этот шаг повторяется 3 раза. Номера паренхиматозные клетки добавили сверху прерывистой изотонического градиента и центрифугировали при 800 х г в течение 15 мин. Купфера клетки, собранные из 25% SIP подушки очищают далее путем выбора клеточной адгезии. (B) Клетки высевают в 24-луночный планшет и инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 30 мин. Неприлипающие клетки один раз промывали 500 мкл HBSS. Клетки Купфера отображать их приверженцем морфология 4 часа после посева, когда F -CNTs могут быть добавлены к клеткам. Шкалы представляет 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Положите одну перфузии печени в чашке Петри с 15 мл Купфера сотовый изоляции Medium. Разрыв капсулы в Глиссон (вмембрана печени) с помощью ножниц и освободить всех клеток печени в изоляторе среды купферовских. Фильтр решение, хотя фильтр 100 мкм клеток, которые будут собраны в центрифужную пробирку. Повторите процедуру перфузии на дополнительных перфузии печени и объединить ячейки в той же центрифужную пробирку (15 мл из одной мыши, до 45 мл из трех мышей).
- Центрифуга клеточной суспензии в 50 мкг в течение 2 мин при 4 ° С. Паренхимных клеток (гепатоциты) будет в осадок и не паренхиматозные клетки (в том числе клетки Купфера) будет в надосадочной жидкости.
- Собирают супернатант в чистую центрифужную пробирку и центрифугируют при 50 мкг в течение 2 минут каждый. Повторите этот шаг еще три раза.
- Центрифуга при 1350 мкг в течение 15 мин для осаждения без паренхиматозных клеток. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл Купфера сотовый изоляции Medium.
- Добавьте без паренхимы решение клеток на разрывной изотонического градиента 25/50%, как описано в 2.3. Центrifuge на 850 мкг в течение 15 мин без ускорения или перерыва.
- Локализация обогащенный Kupffer клеточной фракции, появляющийся в мутной 25% SIP фракции, близком к интерфейсу SIP 25/50% (рисунок 3). Использование 10 мл серологические пипетки, аспирации около 12 мл обогащенной фракции клеток купферовских. Передача клеток в центрифужную пробирку, содержащую 35-40 мл Купфера сотовый изоляции среде. Тщательно перемешать и центрифуге при 1350 х г в течение 15 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
- Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 5-10 мл подогретого Купфера клеточной культуральной среды. Граф клеток (гемоцитометре) и определения жизнеспособности с использованием трипанового синего окрашивания.
- Пластина очищенные без паренхимных клеток в 24-луночные планшеты при плотности 5 × 10 5 клеток / лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 (рисунок 3). Через 30 мин, осторожно удалить носитель, промыть предварительно нагревают сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) один раз, затем заменитьэто 500 мкл свежей и предварительно нагревают Купфера клеточной культуральной среде (на лунку).
- Оставьте клетки Купфера, по крайней мере, 4 ч при 37 ° С и 5% СО 2 перед обработкой с наночастицами, чтобы позволить им приобретают клейкий морфологию.
4. Характеристика
- Клетки Купфера Чистота
- Готовят свежий раствор PBS / BSA, используемый для поддержания жизнеспособности клеток Купфера. Промыть клетки один раз с 500 мкл раствора PBS / BSA. Удалить раствор PBS / BSA и отделить клетки Купфера в 500 мкл свежего раствора PBS / BSA с использованием нежный соскоб. Когда клетки высевают в 24-луночные планшеты, сократить конечностей скребковых лопастей с ножницами, чтобы сделать проще отряд, чтобы продолжить. Перевести клетки в проточной цитометрии труб.
- Граф Купфера клетки, используя гемоцитометра и центрифуги 1 х 10 5 клеток на 1350 х г. Ресуспендируют клетки Купфера в 30 мкл F4 / 80 антителом (чистый). Все хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Хранить неокрашенных клеток (не инкубированных с антителом) на льду.
- Добавить 2 мл раствора PBS / BSA в окрашенных клеток, центрифуги при 1350 г в течение 5 мин и отбросить полученного супернатанта. Ресуспендируют окрашенных клеток в 200 мкл PBS / BSA.
- Для анализа потока цитометрии, ворота 10000 запятнано Купфера клетки в зависимости от их размера (вперед разброс) и детализации (боковой разброс). Анализ флуоресценции закрытых ячеек в Флорида-1 канала.
- Повторите процедуру для окрашенных клеток Купфера, сохраняя те же параметры, используемые для анализа потока цитометрии неокрашенных клеток Купфера. Выбрать и количественной оценки флуоресценции клеток, окрашенных для оценки чистоты Клетка Купфера.
- Купфер сотовый фагоцитарной активности
- Заменить носитель с 0,5% (об / об) флуоресцентные шарики в Купфера клеточной культуральной среды и инкубируют в течение 4 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- Для того, чтобы удалить без усвоенные бусы, центрифуг клетки Купфера при 1350 мкг, диSCard супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл PBS / BSA решение. Повторите этот шаг еще в 2 раза.
- Scrape клетки Купфера в 500 мкл PBS / BSA решение и передачи клеток в проточной цитометрии трубки.
- Центрифуга клетки Купфера при 1350 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в 200 мкл PBS / BSA решение.
- Для анализа потока цитометрии, ворота 10000 запятнано Купфера клетки в зависимости от их размера (вперед разброс) и детализации (боковой разброс). Анализ флуоресценции закрытых ячеек в Флорида-2 канала.
5. Инкубационный химически функционализованных углеродных нанотрубок (F -CNTs)
- Готовят дисперсию F -CNTs (1 мг / мл) в воде при обработке ультразвуком в течение 15 мин перед использованием. F -CNTs готовят в доме 22.
- Подготовка 2x концентрированные f-УНТ дисперсия в Купфера клеточной культуральной среды. Соникатные f- УНТ, диспергированные в среде для2 мин, прежде чем приступить к шагу 5.3).
- Для каждой лунки, заменить 250 мкл старой среды с 250 мкл 2x F -CNTs дисперсии. Необработанные скважины (250 мкл кондиционированной среды + 250 мкл свежей Купфера клеточной культуральной среды) и скважины обрабатывают 10% ДМСО использовали в качестве негативного и позитивного контроля, соответственно.
- Инкубируйте клетки Купфера при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 или 72 ч.
6. Токсичность Оценка F -CNTs в клетках Купфера по модифицированной лактатдегидрогеназы (ЛДГ) Пробирной
- Удалите супернатант.
- Добавить 200 мкл (на лунку 24-луночного планшета) буфера для лизиса и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин-1 час.
- После проведения активную пипеткой, собирают лизируют клетки Купфера в микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 40000 х г в течение 10 мин для осаждения F -CNTs, которые были приняты до клетками и клеточного дебриса.
- Сбор супернатанты (ƒ-CNT бесплатно) вмикроцентрифужные трубы и хранить при температуре -20 ° С или перейдите к шагу 6.5).
- Передача 50 мкл в 96-луночный планшет и добавляют равный объем раствора субстрата смесь (LDH комплекта) в каждую лунку. Накройте тарелку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин перед добавлением 50 мкл стоп-раствора (ЛДГ комплект). Добавить трижды пустых лунок, содержащих 50 мкл буфера для лизиса, 50 мкл раствора субстрата смеси и 50 мкл стоп-раствора.
- Измерить оптическую плотность при 490 нм в микропланшетного и использовать следующую формулу для вычисления (%) жизнеспособность клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Количество не очищенных паренхиматозных клеток согласуется и колебалась между 8 и 14 х 10 6 клеток на мышь (проводились 17 изоляция). Каждый изоляция мыши было достаточно, чтобы пластина 16 до 28 скважин. Жизнеспособность клеток путем окрашивания трипановым синим показала жизнеспособность клеток ~ 95%. Клетки Купфера показали круглую форму в течение 30 мин инкубации при 37 ° С, в связи с их неполной клейкого морфологии (фиг.4А). В 4 часа инкубации и впоследствии клетки распространились и клеточные кластеры начали образовываться.
Купфер клетки затем характеризуется подтвердить свою чистоту и фагоцитарную активность. Клетки окрашивали F4 / 80 антитела демонстрируют чистоту Клетка Купфера. Проточной цитометрии показал чистоту Kupffer клеток выше 95% (рис 4В). Клетки инкубировали с 1 мкм флуоресцентные шарики, 12 ч после посева, чтобы подтвердить свою способность поглощать большие частицы. Анализ проточной цитометрией показал, Тат больше, чем 85% от Купфера клетки фагоцитарной, т.е. может занять до бусы 1 мкм (рис 4в). После 72 ч культуры, 40% клеток Купфера были фагоцитарной, указывая, что клетки Купфера частично утратили фагоцитарную активность.
Микроскопия визуализация клеток Купфера инкубировали с F -CNTs 24 и 72 ч показало аналогичную морфологии клеток по сравнению с наивных клеток (рис 5А). Купфера клетки, инкубированные с 10% ДМСО (положительный контроль) отображается некротических морфологии (фиг.5А). После анализа модифицированного LDH анализа, клетки Купфера обрабатывали 10% ДМСО (положительный контроль) в течение 24 и 72 ч показали высокую токсичность (фиг.5В). Для сравнения, F -CNTs индуцированной небольшое, но значимое снижение жизнеспособности клеток только тогда, когда клетки подвергали при 50 мкг / мл в течение 72 ч (фиг.5В).
Фигура 4: Чистота и поглощение Способности клетки Купфера (A) микроскопических изображений Купфера посеянных клеток через 30 мин или 24 ч при 37 ° С с атмосферой 5% CO 2.. Шкалы представляет 50 мкм. (В) Анализ проточной цитометрией на клетках Купфера проводилась в соответствии FSC / SSC стробирования клеток. Чистота Купфера клеток определяли с использованием окрашивания F4 / 80 антител и показал, чтобы быть выше 95%. (С) Купфера клетки инкубировали в течение 4 ч в присутствии 1 мкм флуоресцентные шарики, чтобы оценить их фагоцитарную активность. Функциональные свойства Купфера были сохранены лучше в клетках свежеизолированных (12 ч после посева) по сравнению с клетками тестируемых после 3-х дней.
Рисунок 5: поглощение и токсичность <EM> f-УНТ в клетках Купфера. (A) микроскопия изображения клеток Купфера. Изображения показывают клетки Купфера обрабатывают 10% ДМСО и 50 мкг / мл F -CNTs при 37 ° С в течение 24 и 72 ч. Шкалы представляет 50 мкм. (В) Модифицированный LDH анализа. Низкий жизнеспособность клеток была замечена в 10% ДМСО обрабатывают клеток (положительные контроли), а F -CNTs существенно отразится на жизнеспособность клеток только после экспозиции в 50 мкг / мл в течение 72 ч. * Р <0,05 по отношению к наивной состоянии (исключая 10% ДМСО) состояние с помощью дисперсионного анализа (односторонним ANOVA) с постфактум анализа с помощью теста Тьюки. Шкалы соответствует 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Следующие шаги имеют решающее значение для достижения высокой урожайности и высокой жизнеспособности клеток Купфера. Асептических условиях должны быть использованы, чтобы снизить риск бактериального и грибкового загрязнения. Все инструменты должны быть стерилизованы перед использованием. Реагенты должны быть свежеприготовленной перед проведением процедуры выделения.
Выбор коллагеназы IV с низкой активностью трипсином, имеет решающее значение. Различные много из того же поставщика есть другой ферментативную активность, и они, возможно, потребуется по сравнению с первоначально выбрать наиболее подходящий для изоляции партию купферовских клеток. Об этом можно судить по оценке урожая клеток и жизнеспособность клеток. Он также рекомендуется обратиться к поставщику, чтобы обеспечить партии, которые были использованы для аналогичных приложений. После того, как принято решение о партии, которые будут использоваться, оставляем его для дальнейшего использования.
Процедура катетеризации требует подготовки. Планирование использования нескольких животных, чтобы стать уверенным в воротной венеПроцедура катетеризации. С практикой, успешно катетеризации будет легко достигнуто, и процедура может осуществляться одним человеком. Обратите внимание, что использование тяжелых животных увеличивает диаметр воротной вены и, следовательно, облегчает процедуру. Когда задняя стенка воротной вены перфорирована, это технически сложно получить доступ к вены снова, особенно если вы новый с этой процедурой, и поэтому, предпочтительно, чтобы начать с нового животного.
Растворы HBSS и коллагеназы должны иметь их рН доводили до 7,4, и предварительно нагревают при 40 ° С, чтобы достичь температуры на выходе из перистальтического насоса 37 ° С. Перфузии с ЭГТА / HBSS решение (Са 2+ и Mg 2+ бесплатно), содержащий ЭГТА необходим для разрушения Са 2+ -зависимых молекул адгезии, по имени десмосома, ослабляя взаимодействие клетка-клетка. Коллагеназа типа IV используется для отделить клетки печени от внеклеточного матрикса и так приведет к печенидиссоциации клеток. Время перфузии для двух растворов не должна превышать 15 мин для CD1 мышей, но другие штаммы, такие как C57BL / 6, требует несколько больше времени пищеварение печени.
Для достижения успешного изоляцию, необходимо, чтобы получить высокий выход клеток и жизнеспособность. Если экспериментатор не имеет никакого опыта в изоляции клеток печени, рекомендуется сочетать гепатоциты гранул из первых 3 центрифугирования при 50 мкг и рассчитывать клетки трипановым голубым. Выход гепатоцитов должно быть> 20 х 10 6 клеток и гепатоцитов жизнеспособность> 50%. Низкая урожайность приводит в основном из бедных диссоциации клеток приводит косвенно к снижению урожайности Kupffer клеток. Это должно быть подтверждено, что печень образом переваривается в конце стадии перфузии. Когда подходит выход гепатоцитов достигается в сочетании с низкой жизнеспособности гепатоцитов, это может привести к от чрезмерного коллагеназы пищеварения, но более вероятно, объясняется ненадлежащим печениПроцедура перфузии или использование загрязненного реагента / материала.
После обшивки, Купфера клетки чувствительны и должны быть вымыты мягко. По крайней мере, 4 ч, необходимых для клетки Купфера, чтобы приобрести их клейкий морфологию. Лечение обычно проводят 4-24 ч после посева, а клетки Купфера показать свою максимальную фагоцитарную активность в течение 1 дня после посева.
В нашем протоколе мы опишем диссоциации CD1 клеток печени мышей с последующим очистки клеток Купфера по центрифугирования в градиенте плотности и отбора по адгезии. Характеристика клетки Купфера, с помощью проточной цитометрии, показывает, что высокий выход и чистоту клетки Купфера может быть достигнуто с помощью этого метода.
Этот метод изолятор Купфера представляет собой ценный компромисс между сложностью и выходом клеток. Тем не менее, он сообщил, что некоторые методы Купфера клетка может быть легче проводить, например, согласно протоколу, описанномуУ и др., Где печени переваривали экс виво 23. Однако способ, описанный Ву и др. приводит к ограниченному количеству клеток и низкую чистоту клеток. Высшее выход и чистота может быть получена, но требуют дорогостоящей и / или сложного оборудования и может занять много времени.
Оригинальный протокол, разработанный Smedsrød и др. 16 использовали сравнимую протокол, основанный на 2-шагового метода перфузии (HBSS + коллагеназы пищеварения) с последующим центрифугированием в градиенте перколла и отбора нижней Перколла подушки для дальнейшей очистки поверхности адгезии. Изменяя процедуру центрифугированием и сбором верхнюю перколлом подушку, мы увеличили обогащенного клеточной фракции Купфера от 5,25 × 10 6 до 8,2 × 10 6 клеток на грамм печени. Это улучшение может быть связано с использованием EGTA в течение ранней стадии перфузии, чтобы облегчить диссоциацию клеток печени. Мoreover, использование проточной цитометрии позволило надежную количественную характеристику купферовских чистоты клеток и фагоцитарной активности. С максимальным выходом 14 х 10 6 очищенных без паренхимных клеток в печени мышей. Способ изоляции присутствует достичь более высокое количество клеток Купфера в печени мышей на то, что сообщалось в литературе 24. Это улучшение может быть объяснено с помощью тяжелой мыши (35-45 г) по сравнению с другими методами 24. Кроме этого увеличения урожайности клеток, использование более крупных животных способствует удивительно процедуру катетеризации воротной вены.
Высокая пропускная способность в пробирке тестирования может быть осуществлена с помощью этого первичного фагоцитарную модель, поэтому имитируя в естественных токсикологическую воздействие наночастиц. Общая понимание нанотоксикологии могли извлечь выгоду из таких моделей, что делает выбор наночастиц для клинического перевод более эффективным. Кроме того, в соответствии среализации концепции 3 R (сокращение, уточнения и замены) в животных биомедицинских исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
