Abstract
In vitro çalışmalar nanotoxicological büyük çoğunluğu onların pratiklik için ölümsüzleştirdi hücre hatları kullandık. Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri veya primer hücrelerde nanopartikül toksisite testi sonuçları in vitro deneyler için birincil hücrelerin kullanımını genişletmek için ihtiyaç ortaya farklılıklar göstermiştir. Bu protokol, fare karaciğer makrofaj izolasyonu, adı Kupffer hücreleri ve nanoparçacık toksisitesini incelemek için kullanımlarını tarif eder. Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve nanopartiküller dolaşımdaki yakalama sorumlu retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçasını oluşturmaktadır. Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. kolajenaz sindirimi ve yoğunluk santrifüj göre yöntem olup, Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir protokolden uyarlanmıştır. sıçan karaciğer hücre, izolasyon için tasarlanmışn ve yüksek bir verim sağlar ve Kupffer hücreleri, yüksek saflıkta (>% 95) (14 x 10 6 fare başına hücre kadar). Bu izolasyon yöntemi sofistike ya da pahalı ekipman gerektirmez ve bu nedenle karmaşıklığı ve hücre verimi arasında ideal bir uzlaşma temsil etmez. ağır farelerde (35-45 gr) kullanılması izolasyon yönteminin verimini artırır ama aynı zamanda son derece portal ven kanülasyonu prosedürü kolaylaştırır. CNT f işlevselleştirilmiş Karbon nanotüplerin toksisite modifiye LDH testi ile bu modelde ölçülmüştür. Bu yöntem, ön-CNT ile inkübasyondan sonra, Kupffer hücre zarı yapısal bütünlüğünün eksikliği ölçülerek hücre canlılığı değerlendirir. F CNT neden olduğu toksisite izole Kupffer hücreleri nanoparçacık toksisite testleri için faydalı olduğu öne bu tahlili kullanılarak sürekli olarak ölçülebilir. Nanotoksikoloji genel anlayış klinik çeviri daha verimli için nanoparçacık seçim yaparak, bu tür modellerden yarar olabilirkatsayısıdır.
Introduction
Nanotoksikoloji araştırması alanı, nanopartiküller biyolojik etkisini belirlemeyi amaçlamaktadır. In vivo araştırmalara dayalı Toksikolojik çalışmalar en doğru yöntemleri kalır. Ancak, bunların kullanımı maliyet, emek ve zaman gereksinimleri 1 ile sınırlıdır. Alternatifler, in vitro tahliller için basitlik ve vitro test platformları 2 yüksek verim yakalanma olasılığı kullanılmıştır gibi - yani test edilen koşullar sayısını uzanır. En nanotoxicological çalışmalar, ölümsüz hücre çizgileri ile in vitro deneyler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, in vivo toksikolojik etkileri 3 bu deneysel bulguların ekstrapolasyonuna konusunda endişeler vardır. Gerçekten de, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri özellikleri de elde edilmiştir dokular, örneğin, genetik dönüştürme 4, temel morfolojik özelliklerini bozulması önemli ölçüde farklı olabilir5, hücresel polarite 6 ve inflamatuar mediatörlerin 7 düzenlenmesi gibi fonksiyonel değişikliklerin kaybı.
Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve karaciğer sinüsoidlerinden duvarını kaplayan kan ile doğrudan temas halinde bulunmaktadır. Retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçası olarak, bu makrofajlar nanopartiküller dolaşım ve bu nedenle yakalanması için sorumlu olan, nanopartikül toksisitesini incelemek için son derece uygun bir model teşkil etmektedir. In vivo 8 ve in vitro nanopartiküller maruz Kupffer hücreleri ile ilişkili inflamatuar tepkilerin 9 çalışmaları başka yayınlanmıştır. Kupffer hücreleri aynı zamanda alkolik karaciğer hastalığı 10, karaciğer fibrozis 11 veya viral hepatit 12 olarak karaciğer hastalıklarının patogenezinde yer almış. Bu izole Kupffer hücreleri, hücresel mekanizmalar inv açıklamak için yararlı bilgi sağlar olduğu bildirilmiştirKaraciğer bozulması 13,14 olved.
Çeşitli yöntemler, izole edilmesi ve Kupffer hücrelerinin saflaştırılması için rapor edilmiştir. Hücre izolasyonu, mekanik ya da enzimatik ayrılma 15 kaynaklanabilir. Kollajenaz sindirimi yüksek Kupffer hücre verimi 16 giden ise, Kupffer hücreleri fonksiyonel bütünlüğü muhafaza avantajını gösterir. Karmaşıklığı ve maliyeti değişen pek çok deneysel yaklaşım, diğer karaciğer hücre popülasyonlarından Kupffer hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Örneğin, Kupffer hücre saflık immünoafinite 17, akış elektroforez 18, yapışmayı 16 tarafından ya da bunların büyüklüğü ve yoğunluğuna göre hücreleri seçin santrifüj teknikleri 16, ile elde edilebilmektedir. Bu yöntemlerin bir kombinasyonu nüfusun 16 saflığını geliştirmek için seçilebilir. Çoğunlukla uygulama ve mevcut ekipman bağlı olduğu Kupffer hücre izolasyonu için ideal yöntem hakkında görüş birliği yokturt. Bununla birlikte, nanopartikül toksisite testi durumunda, basitliği ve Kupffer hücreleri fonksiyonlarının korunması ile bağlantılı teknik yüksek verimi, bu uygulama için en uygun olduğu ortaya çıktı.
Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. yöntem Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen özgün protokolden modifiye edildi. 16 sıçan karaciğer hücre izolasyonu için tasarlanmış. Çalışmaların çoğu rapor ve sıçan ciğeri Kupffer hücrelerinin izolasyonu nitelendirdi. Burada, yüksek verim ve saflıkta, fare karaciğerinden Kupffer hücreleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. farelerin kullanılması deney maliyetini düşürür ve çeşitli karaciğerinin işleme nanoparçacık toksisite testleri için Kupffer hücreleri büyük miktarlarda elde etmesini sağlar.
Aşağıdaki protokol, Kupffer hücreleri (f işlevselleştirilmiş C-nanotüpler ile inkübe edildi yani. Ancak, endişeleri CNTs 19 toksisitesi, ve in vitro testlerde yeni gelişme CNT biyolojik etkisinin anlaşılmasını artırmayı hedefliyor ilgili gündeme gelmiş. Kupffer hücre içinde toksisite, hücre zarının yapısal bütünlüğünün eksikliği ile bağlantılıdır. Bu yüzey maddesine hücreden sitoplazmik enzimin LDH kaybı ile ölçülür. Bu yöntemin prensibi, bu nedenle, herhangi bir serbest LDH çıkarın ve hücreleri 20 kalanları ölçmektir. Üstte kalan sıvı kısımdaki CNTs varlığının tayinin 21 müdahale, bu süpernatan içinde salınan LDH ölçülmesi tercih yapılır.
Biz bu basit ve uygun maliyetli Kupffer hücre izolasyonu metho kullanımını öneriyoruzD fonksiyonel Kupffer hücreleri çok sayıda izole etmek. Bu, ilgili primer makrofaj modelinde, nanopartiküller bir dizi toksisite tarama sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri ilgili tüm kurallar, yönetmelikler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde idam edildi. protokol UK Home ofis düzenleme rehberlik ve onayı altında gerçekleştirildi gösterdi ediliyor
1. Perfüzyon ve Hücre Toplama (Şekil 1)
Şekil 1:. Karaciğer Perfüzyon fare anestezi sonrasında, sindirim kanalı yanal erişilebilir portal ven (PV) yapmak için karın sol taşınır. PV hemen karaciğer içinde herhangi bir aşırı basıncı önlemek için rüptüre EGTA / HBSS çözüm yavaş bir akış hızı (1-3 ml / dak) ve alt veina kava (IVC) 'dir kullanılarak kanüle edilmiştir. Perfüzyon ilk dakika içinde, akış hızı kademeli / min oranıyla, 7 ml artar. Tam sindirim elde edilene kadar kolagenaz çözelti daha sonra 10 ml / dakika ile perfüze edilmiştir.
- Prepataze malzeme tabloda açıklanan tüm reaktifleri yeniden.
- EGTA (etilen glikol tetra-asetik asit) / HBSS (Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) solüsyonu (fare başına 50 mi) ve 40 ° C'de 30 dakika boyunca kolagenaz çözelti (fare başına 100 mi) ısıtın.
- İlk% 70 etanol ile pompa esnek boruyu durulayın. Su banyosuna daldırılmış bir santrifüj tüpüne EGTA / HBSS Çözüm 40 ml dökün ve önceden ısıtılmış EGTA / HBSS Çözümü ile pompa esnek boruyu durulayın.
- Güvenilir solunum depresyonu ve ölmeden önce bilinç oluşturmak için bir barbitürat kullanarak Terminal anestezi uygulayın. Bir dişi ya da erkek CD 1 fare (35-45 g) içine 1 mg / kg, ip de fenobarbiton enjekte edilir. Ayak kısma anestezi onaylayın.
- Karın tüyleri tıraş edin ve% 70 etanol çözeltisi kullanılarak karın yüzeyi sterilize edin.
- Karın boşluğunda kesti ve karın sol yanal bağırsak hareket ettirerek portal ven ve inferior vena kava maruz kalmaktadır.
- Start EGTA / HBSS Çözüm ile 1-3 ml / dk'lık bir hızda pompası ve 23 gr bir kelebek iğne kullanılarak portal ven kanüle (kanatlar kesilmiş). 23 G iğne ile kanüle portal ven bölümünü Kelepçe ve daha sonra açılan fare karın yüzeyinde serrefine forseps çevirin. Karaciğer hızla EGTA / HBSS Çözüm perfüzyon ilk 30 sn içinde soluk gerekir.
- Hızla karaciğerde aşırı basınç bina önlemek için inferior vena kava alt kısmını insizyon ve sonra perfüzyon ilk dakika içinde, 7 ml / dk kademeli akış oranını artırmak. Hayvan nedeniyle kaval Damara vena ikincil kanama ölür.
- EGTA / HBSS Çözüm az 5 ml santrifüj tüpüne kalan zaman, kollajenaz Çözüm (40-50 ml) ile doldurmak. 30 saniye içinde, 10 ml / dk akış hızıyla kademeli olarak artırır.
- 5-10 sn aralıklarla, cımbız kullanarak, inferior vena kava basınç uygulayarak karaciğer kabarma olun. This (sindirim sırasında 5-10 kez) periyodik olarak yapılabilir. Bu adım, karaciğer hücre ayrışmasını geliştirmek ve kollajenaz ile perfüzyon süresini azaltacaktır.
- Kollajenaz çözelti en az 10 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde kalmaya devam ederse, bir santrifüj tüpü içine önceden ısıtılmış kollajenaz çözelti 40-50 mi dökün.
- Perfüzyon 10-15 dakika ve perfüze kolagenaz çözelti, yaklaşık 70-80 ml sonra, forseps ile karaciğer yüzeyinde küçük bir basınç uygulamak. Basınç Bir baskı karaciğer hücreleri ayrışmış olduğunu gösterir.
- Tek parça olarak karın boşluğunda karaciğer çıkarın ve Kupffer hücreleri izolasyon ortamında 20-30 ml ihtiva eden bir santrifüj tüpüne koyun. Karaciğer hücre canlılığını etkileyen bilmek 3 saatlik bir süre için buz üzerinde ya da 4 ° C 'de, karaciğer hücreleri tutun.
- Buz üzerinde perfüze karaciğer tutarken, gerekirse birkaç hayvanlar üzerinde perfüzyon işlemi tekrarlayın. Havuz arıtma için üç karaciğerler bir ve evre 3 ile devam edin.
Santrifüj için Yoğunluk Gradyan 2. Hazırlama (Şekil 2)
Şekil 2:. Yoğunluk gradyanı hazırlanması Bütün prosedürler steril koşullar altında gerçekleştirilir. SIP, 10 1.7 ml x PBS ile kaplanmış silika partikül solüsyonunun 15.3 ml karıştırılmasıyla hazırlanır. SIP 5 ml 20 ml% 25 SIP çözelti yapmak için PBS, 15 ml ile karıştırılır. SIP 10 mi, 20 ml 50% SIP solüsyon yapmak için, 10 ml PBS ile karıştırılır. 50% SIP çözeltisi (20 mi) hareket ettirildiğinde, 25% SIP çözeltisi (20 mi) ihtiva eden bir santrifüj tüpü yavaşça serolojik 25 mi pipet kullanarak eklenir.
- Steril koşullar altında, aşağıdaki adımları (bölüm 2., 3. ve 5.) ile devam edin ve C buz üzerinde veya 4 ° hücreleri tutun. 10 1.7 ml x PBS ile kaplanmış silika parçacık çözeltisi 15.3 ml karıştırarak SIP (İzotonik kaplı silika Partiküllerinin Çözüm) hazırlayın. , 25% SIP çözeltisi 20 ml yapmak PBS, 15 ml ile SIP 5 ml karıştırın. 10 ml PBS ile SIP 10 ml karışımı, 50% SIP çözeltisi 20 ml yapmak için.
- 50% SIP çözeltisi 20 ml bir santrifüj tüpüne doldurun. 90 ° ye yakın bir açı ile santrifüj tüpü yatırın ve 50% SIP katmanı yüzeyine dokunmadan, 25 ml'lik bir pipet kullanılarak serolojik borunun yan duvara yavaş 25% SIP çözeltisi (20 mi) ilave edin. % 25 SIP çözümü eklerken, giderek tüpün açısını azaltır. Buz üzerinde kullanıma kadar yoğunluk gradiyenti tutun.
3. Kupffer hücre Arıtma (Şekil 3)
Şekil 3:. Yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme ve hücre yapışması Kupffer hücreleri 'nin Saflaştırılması Tüm işlemler, steril koşullar altında gerçekleştirilir. (A) Glisson en kapsülün delinmesinden sonra karaciğer hücreleri, bir 1 süzülür00 mikron süzgeç. Süspansiyon hepatositler (pelet) iptal ve non-parenkimal hücreli fraksiyonu (süpernatant) toplamak için x 50 g'de santrifüje tabi tutulur. Bu aşama 3 kez tekrar edilir. Sigara parankimal hücreler, kesintili bir izotonik gradyanın üzerine ilave edildi ve 15 dakika boyunca 800 x g'de santrifüje tabi tutulur. 25% SIP yastığı toplanan Kupffer hücreleri hücre yapışma seçimi ile daha da saflaştırılır. (B) Hücreler, 24 oyuklu plakada kaplanmıştır ve 30 dakika boyunca CO2 37 ° C'de inkübe edildi ve% 5 vardır. Yapışkan olmayan hücreler HBSS 500 ul ile bir kez yıkanır. Kupffer hücreleri f CNT hücrelere ilave edilebilir kaplama, sonra yapışmayan morfolojisi 4 saat gösterir. Ölçek çubuğu 25 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Kupffer hücre izolasyon ortamında 15 ml ile bir Petri kabı içinde tek bir perfüze karaciğer koyun. (Glisson en kapsülü yırtılabilirKaraciğerin zarı) makas kullanarak ve Kupffer hücre izolasyonu ortama tüm karaciğer hücreleri bırakın. 100 mikron hücre süzgeç bir santrifüj tüpüne toplanacak olsa çözüm Filtre. Ek perfüze karaciğerleri üzerinde perfüzyon işlemi tekrarlayın ve (üç fareden 45 ml kadar, bir fareden 15 ml), aynı santrifüj tüpüne hücreleri havuz.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 50 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Pelet ve (Kupffer hücreleri dahil) olmayan parankimal hücreler süpernatanda olacak parankimal hücreler (hepatositler) olacaktır.
- 2 dakika her biri için 50 xg'de temiz bir santrifüj tüpüne ve santrifüj süpernatant toplayın. Bu adımı üç kez daha tekrarlayın.
- 15 dakika 1.350 xg'de Santrifüj olmayan parankimal pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve Kupffer hücre izolasyonu Orta 10 ml pelletini.
- 2.3 açıklandığı gibi süreksiz izotonik degrade 25/50% dışı parankimal hücre çözüm ekleyin. Senthızlanma veya ara vermeden 15 dakika 850 xg'de rifuge.
- 25/50% SIP arayüzüne yakın% 25 SIP fraksiyonu (Şekil 3) içinde bulanık görünen zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonu yerelleştirilmesine. 10 ml serolojik pipet, aspirat zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonunun yaklaşık 12 ml kullanma. Kupffer hücre izolasyon ortamında 35-40 ml ihtiva eden bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın. Pelet hücreleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1350 x g'de yumuşak ve santrifüj karıştırın.
- Önceden ısıtılmış Kupffer hücre kültür aracı maddesi, 5-10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. Hücreler (hemositometre) Sayım ve tripan mavisi boyama kullanarak canlılığı ölçün.
- / Oyuk 5 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 oyuklu plakalarda saflaştırılmış olmayan parankimal hücreler plaka. 37 ° C'de ve% 5 CO2 (Şekil 3) hücreleri inkübe edin. 30 dakika sonra, yavaşça yıkanır, orta kaldırmak Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), daha sonra bir kez yerine önceden ısıtılmıştaze ve önceden ısıtılmış Kupffer hücre kültür ortamında 500 ul bu (oyuk başına).
- Onlara yapışık morfolojisi elde etmek için izin vermek için, nanopartiküller ile tedaviden önce, 37 ° C'de en az 4 saat% 5 CO2 için Kupffer hücreleri bırakın.
4. Karakterizasyonu
- Kupffer hücreleri Saflık
- Kupffer hücre canlılığını korumak için kullanılan taze PBS / BSA çözeltisi hazırlayın. PBS / BSA çözeltisi 500 ul ile bir kez hücreler yıkanır. PBS / BSA çözeltisi çıkarın ve yumuşak bir kazıma ile taze PBS / BSA çözeltisi 500 ul Kupffer hücreleri ayırmak. Hücreler 24-yuvalı plakalar içinde plakalanmıştır zaman devam etmek için ayrılma kolaylaştırmak için makas ile sıyırıcı bıçak uçlarını kısaltır. Tüpler flow sitometri içine hücreleri aktarın.
- Bir hemositometre ve santrifüj 1,350 x g 1 x 10 5 hücre kullanarak Kupffer hücreleri saymak. (Saf) F4 / 80 antikorunun 30 ul içinde süspanse Kupffer hücreleri. İyice karıştırın ve 3 için oda sıcaklığında inkübe0 dak. Buz üzerinde lekesiz hücreleri (antikor ile kuluçkaya değil) tutun.
- 5 dakika boyunca 1,350 g'de, lekeli hücrelerde santrifüj PBS / BSA çözeltisi 2 ml ilave edilir ve elde edilen süpernatant atılır. PBS / BSA, 200 ul, boyanan hücreleri yeniden süspanse edin.
- Flow sitometri analizi için kapı 10,000 boylarına (ileri dağılım) ve parçalı (yan dağılım) göre Kupffer hücreleri boyanmamış. FL-1 kanalında kapılanmış hücrelerin floresans analiz edin.
- Lekesiz Kupffer hücrelerinin flow sitometri analizi için kullanılan aynı ayarları tutmak lekeli Kupffer hücreleri için prosedürü tekrarlayın. Seçip Kupffer hücre saflığını değerlendirmek için boyalı hücrelerin floresans ölçmek.
- Kupffer hücre Fagositik Etkinliği
- % 0.5 ile değiştirin (h / h) Kupffer hücre kültür ortamı içinde flüoresan boncuklar ve 37 ° C'de 4 saat inkübe edilir ve% 5 CO2.
- 1.350 xg, di non-içselleştirilmiş boncuk, santrifüj Kupffer hücreleri ortadan kaldırmak için500 ul PBS / BSA Çözüm supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri scard. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın.
- Tüp sitometri akışı içine PBS / BSA çözeltisi ve transfer hücrelerinin 500 ul Pençe Kupffer hücreleri.
- Santrifüj Kupffer hücreleri 1,350 xg'de, PBS / BSA çözeltisi 200 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atın.
- Flow sitometri analizi için kapı 10,000 boylarına (ileri dağılım) ve parçalı (yan dağılım) göre Kupffer hücreleri boyanmamış. FL-2 kanal kapılı hücrelerin floresan analiz edin.
(CNT f) Kimyasal Fonksiyonlu Karbon Nanotüpler 5. Kuluçka
- Kullanımdan önce, 15 dakika süreyle sese tabi tutularak su içinde ön-CNT (1 mg / ml) 'in bir dağılımı hazırlanır. F-CNT içi 22 hazırlanır.
- 2x konsantre edildi f- CNT hazırlanması Kupffer hücre kültür aracı maddesi içinde dispersiyon. Için ortam içinde dağılmış sonikasyon f CNT2 dk) aşama 5.3 geçmeden önce.
- Her kuyu için, 2x f-CNT dağılım 250 ul eski medya 250 ul değiştirin. Tedavi edilmeyen kuyu (tatlı Kupffer hücre kültür ortamının koşullandırılmış ortamı + 250 ul 250 ul) ve% 10 DMSO ile muamele edilmiş kuyu sırasıyla negatif ve pozitif kontrol olarak kullanılır.
- 24 veya 72 saat boyunca CO2 37 ° C'de, Kupffer hücreleri inkübe ve% 5.
Modifiye Laktat Dehidrojenaz (LDH) Testi ile Kupffer hücrelerinde f-CNT 6. Toksisite Değerlendirmesi
- Süpernatantı atın.
- Lizis Tamponu (24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için) 200 ul ilave edin ve 30 dakika-1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
- 10 dakika Hücreler ve hücre artığı tarafından alınan f CNT pelet süreyle kuvvetli bir şekilde pipetleme yaptıktan sonra, 40,000 x g'de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj içine Kupffer hücreleri lize toplamak.
- Süpernatantlar (ƒ-CNT ücretsiz) içine toplayınmikrosantrifüj tüpleri ve -20 ° C'de mağaza ya) 6.5 adıma geçin.
- 96 oyuklu bir plaka başına 50 ul ve her bir alt-tabaka karışımı çözeltisi (LDH kit) eşit hacmi ekleyin. Plaka örtün ve durdurma solüsyonu (LDH kiti) 50 ul ilave edilmeden önce 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Liziz tamponu 50 ul substrat karışımı çözeltisi 50 ul ve durdurma çözeltisi 50 ul ihtiva eden boş bir kuyu triplicates ekleyin.
- Mikroplaka okuyucu içinde 490 nm'deki absorbansı okumak ve (%) hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması için aşağıdaki formül kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
saflaştırılmamış parankimal hücrelerin sayısı, tutarlı ve (17 izolasyon yapıldı) fare başına 6 ila 10 8 ila 14 x hücreler arasında değişmektedir. Her fare izolasyon 16-28 kuyu plaka için yeterli oldu. Tripan mavi boyama Hücre canlılığı hücre canlılığını ~% 95 gösterdi. Kupffer hücreleri eksik yapışkan morfoloji (Şekil 4A) ilgili, 37 ° C'de inkübe edildikten sonra 30 dakika içinde yuvarlak bir şekli göstermektedir. 4 saat inkübasyon ve daha sonra, hücreler yayılmış ve hücre kümeleri meydana başlanmıştır.
Kupffer hücreleri daha sonra saflık ve fagositik etkinliğinin doğrulanması için karakterize edildi. Hücreler, Kupffer hücre saflık göstermek için F4 / 80 antikoru ile birlikte boyandı. Flow sitometri analizi% 95 (Şekil 4B), yukarıda Kupffer hücre saflık gösterdi. Hücreler, büyük partikülleri almak için yeteneklerini teyit etmek için 1 um flüoresan boncuklar, kaplamadan sonra 12 saat, ile inkübe edildi. Tha gösterdi Flow sitometri analizit Kupffer hücreleri daha fazla% 85 1 mikron boncuk (Şekil 4C) sürebilir, yani fagositik vardır. Kültür, 72 saat sonra, Kupffer hücreleri% 40 Kupffer hücreleri, kısmen fagositik aktivitesi kayıp gösteren fagositik edildi.
24 ve 72 saat için ön-CNT ile inkübe Kupffer hücreleri Mikroskopi görüntüleme saf hücreleri (Şekil 5A) ile karşılaştırıldığında benzer bir hücre morfolojisi saptandı. % 10 DMSO (pozitif kontrol) ile inkübe Kupffer hücreleri nekrotik morfoloji (Şekil 5A) gösterilir. Değiştirilmiş LDH deneyi analizi takiben, Kupffer hücreleri 24 10% DMSO (pozitif kontrol) ile muamele edilmiş ve 72 saat yüksek toksisiteye (Şekil 5B) gösterdi. Buna karşılık, f-CNT hücreler 72 saat (Şekil 5B), 50 ug / ml'de maruz bırakıldı, sadece hücre canlılığı hafif fakat önemli bir azalmaya neden olmuştur.
Şekil 4: Kupffer hücrelerinin arılığı ve Alım Kabiliyetler (A), 30 dakika ya da% 5 CO2 atmosferi ile 37 ° C'de 24 saat sonra kaplı Kupffer hücreleri mikroskobik görüntüleri.. Ölçek çubuğu 50 mikron sunar. (B), Kupffer hücreleri Flow sitometri analizi FSC / SSC hücre gating takip edilmesiyle gerçekleştirildi. Kupffer hücresi saflık F4 / 80 antikor boyama kullanılarak tespit ve% 95 üstünde olması gösterdi. (C) Kupffer hücreleri fagositik aktivitesini değerlendirmek için 1 um floresan boncuk mevcudiyetinde 4 saat inkübe edildi. Kupffer fonksiyonel özellikleri taze 3 gün sonra test hücrelere kıyasla (12 saat sonra kaplama) izole hücrelerde daha iyi muhafaza edilmiştir.
Şekil 5: Alım ve toksisitesi <Kupffer hücrelerinde em> f- CNT. (A) Kupffer hücrelerinin Mikroskopi görüntüler. Görüntüler 24 ile 72 saat boyunca 37 ° C'de ön-CNT% 10 DMSO ve 50 mg / ml ile muamele edilmiş Kupffer hücreleri göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 mikron sunar. (B) Modifiye LDH deneyi. Düşük hücre canlılığı f CNT önemli ölçüde sadece 72 saat boyunca 50 ug / ml maruz bıraktıktan sonra hücre canlılığı etkilenen ise% 10 DMSO ile muamele edilmiş hücreler (pozitif kontrol) 'de görülmüştür. * P <Tukey testi ile post hoc analizi ile varyans (one-way ANOVA) analizi kullanılarak saf durumda (% 10 DMSO durumu hariç) 0.05 göreli. ölçek çubuğu 50 um karşılık gelir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aşağıdaki adımlar, yüksek verim ve Kupffer hücreleri yüksek canlılığı elde etmek için kritiktir. Aseptik koşullar bakteriyel ve fungal kirlenme riskini sınırlamak için kullanılır. Tüm araçlar kullanılmadan önce sterilize edilmesi gerekir. Reaktifler taze izolasyon prosedürü gerçekleştirmeden önce hazırlanmalıdır.
kollajenaz IV seçimi, düşük triptik aktivite ile, çok önemlidir. Aynı ilgili farklı birçok farklı enzimatik aktiviteye sahip olan ve Kupffer hücre izolasyonu için en uygun toplu seçmek için ilk karşılaştırılabilir gerekebilir. Bu hücre, verim ve hücre canlılığı değerlendirerek yargılanabilir. Aynı zamanda benzer uygulamalar için kullanılmaktadır toplu sağlamak için tedarikçi temasa tavsiye edilir. Bir kez kullanılan ileride kullanmak üzere ayırmak için toplu karar verdi.
kanülasyon prosedürü eğitim gerektirir. Portal ven ile emin olmak için birkaç hayvanların kullanımını planlayınkanülasyon prosedürü. Uygulama ile, başarılı kanülasyon kolayca elde edilecek ve işlem bir kişi tarafından ele alınabilir. Ağır hayvanların kullanımı portal ven çapı artar ve bu nedenle prosedürü kolaylaştırır unutmayın. Portal ven arka duvarı delikli zaman, bu prosedüre yeni, özellikle tekrar damara ulaşmak için teknik olarak zordur ve bu nedenle, yeni bir hayvan ile başlamak tercih edilir.
HBSS ve kolajenaz Solutions olarak pH değeri 7.4'e ayarlanmış ve 37 ° C arasında bir peristaltik pompa, bir çıkış sıcaklığı elde etmek için 40 ° C'de önceden ısıtılmış olmalıdır. EGTA / HBSS Çözümü ile perfüzyon (Ca 2 + ve Mg 2 + ücretsiz) içeren EGTA hücre-hücre etkileşimi zayıflaması, Ca 2 + bağımlı adezyon molekülleri adlı dezmozom bozulması için gereklidir. Kollajenaz tip IV ekstraselüler matriks karaciğer hücreleri ayırmak ve böylece karaciğere yol kullanılırhücre ayrışma. iki çözeltinin perfüzyon süresi, CD1 fareleri ancak C57BL / 6 gibi başka suşlar, 15 dakikadan fazladır biraz daha uzun karaciğer sindirim süresi gerektirmemelidir.
Başarılı bir izolasyon elde etmek için, yüksek hücre verimini ve canlılığı elde etmek için gereklidir. Deneyci karaciğer hücre izolasyonu hiçbir deneyimi varsa, tripan mavisi dışlama deneyi ile hücrelerin 50 xg'de ilk 3 santrifüj gelen hepatositlerin pelet birleştirmek ve saymak için tavsiye edilir. hepatosit verim> 20 x 10 6 hücre ve hepatosit canlılığı>% 50 olmalıdır. Düşük verim Kupffer hücresi verimi düşük dolaylı lider yoksul hücre ayrılma esasen sonuçlanır. Karaciğeri perfüzyon aşamasının sonunda dijeste olduğu teyit edilmelidir. Uygun hepatosit verimi düşük hepatosit canlılığı ile kombinasyon halinde elde edilir, bu aşırı kolajenaz sindirimi neden olabilir, ancak daha çok uygun olmayan bir karaciğer tarafından açıklanmıştırperfüzyon yordam veya kontamine reaktif / malzeme kullanımı.
Kaplama sonrasında, Kupffer hücreleri duyarlı ve yavaşça yıkanmalıdır. En az 4 saat kendi yapışan morfolojisi elde etmek için Kupffer hücreleri için gereklidir. Kupffer hücreleri kaplama sonrası 1 gün içinde maksimum fagositik aktiviteyi göstermek gibi tedavi genellikle, sonra kaplama 4-24 saat gerçekleştirilir.
Bizim protokol, yapışma ile yoğunluk gradyan santrifüjü ve seçme ile, Kupffer hücreleri geçirilmiş, ardından arıtma CD1 fare karaciğer hücrelerinin ayrılmasını tarif eder. Kupffer hücreleri karakterizasyonu, akış sitometrisi ile, Kupffer hücreleri yüksek verimi ve saflığı, bu yöntem kullanılarak elde edilebileceğini göstermektedir.
Bu Kupffer hücre izolasyon yöntemi karmaşıklığı ve hücre verimi arasında çok değerli bir uzlaşma temsil etmektedir. Bununla birlikte, belirli bir Kupffer hücre yöntemleri, tarafından tarif edilen protokol olarak, gerçekleştirmek için daha kolay olabilir bildirilmektedirWu ve ark., Karaciğer, ex vivo 23 sindirilmiştir. Bununla birlikte, Wu ve arkadaşları tarafından tarif edilen yöntem. Bir hücrelerin sınırlı bir miktarı ve daha düşük hücre saflık yol açar. Daha yüksek verim ve saflık elde değil gerektiren pahalı ve / veya gelişmiş donanım ve zaman alıcı olabilir yapılabilir.
Smedsrød ve ark., 16 tarafından geliştirilen bir protokol Percoll gradyanı ve bir yüzey yapışma ile daha fazla saflaştırma için daha düşük Percoll yastık seçimi santrifüj, ardından 2 adımlı perfüzyon yöntemi (HBSS + kolajenaz sindirimi) dayalı benzer bir protokol kullanıldı. Santrifüj işlemi değiştirerek ve üst Percoll yastığı toplayarak, biz karaciğer gram başına 8.2 x 10 6 hücre için 5.25 x 10 6 zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonu arttı. Bu iyileştirme, karaciğer hücrelerinin ayrılmasını kolaylaştırmak için erken perfüzyon aşaması esnasında EGTA kullanımına atfedilebilir. Moreover, flow sitometri analizi kullanımı Kupffer hücre saflık ve fagositik aktivitesinin güvenilir kantitatif karakterizasyonu izin verdi. Fare karaciğer başına 14 x 10 6 saflaştırılmış non-parankimal hücrelerin maksimum verim ile. Mevcut izolasyon yöntemi literatürde 24 rapor edilmiştir ne fare karaciğer başına Kupffer hücreleri yüksek miktarda elde eder. Bu gelişme, diğer yöntemlerle 24 kıyasla daha ağır fare (35-45 g) kullanılması ile açıklanabilir. Hücre veriminde bu artış yanında, büyük hayvanların kullanımı oldukça portal ven kanülasyonu prosedürü kolaylaştırır.
In vitro deneyler Yüksek verim nedenle nanopartiküller in vivo toksikolojik etki taklit bu primer fagositik modeli kullanılarak gerçekleştirilebilir. Nanotoksikoloji genel anlayış klinik çeviri için nanoparçacık seçimi daha verimli hale tür modellerden yarar olabilir. Buna ek olarak, uygun olduğuHayvan biyomedikal araştırmalarda 3 R (küçültme, arıtma ve yedek) kavramını uygulamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
