Abstract
الغالبية العظمى من الدراسات في المختبر nanotoxicological استخدمت خطوط الخلايا خلد عن التطبيق العملي لها. ومع ذلك، فقد أظهرت النتائج من جسيمات متناهية الصغر اختبار السمية في خطوط الخلايا خلد أو الخلايا الأولية التناقضات، مما يبرز الحاجة إلى توسيع استخدام الخلايا الأولية للفحوصات في المختبر. يصف هذا البروتوكول عزلة الضامة كبد الفأر، وخلايا كوبفر اسمه، واستخدامها لدراسة سمية جسيمات متناهية الصغر. خلايا كوبفر هي السكان بلعم الأكثر وفرة في الجسم، وتشكل جزءا من الجهاز الشبكي البطاني (RES)، المسؤولة عن القبض على تعميم النانوية. ويستند كوبفر طريقة عزل الخلايا ذكرت هنا على طريقة التروية 2-خطوة تليها تنقية على التدرج الكثافة. طريقة، بناء على الهضم كولاجيناز والكثافة الطرد المركزي، ومقتبسة من البروتوكول الأصلي الذي وضعته Smedsrød وآخرون. مصممة للفئران خلايا الكبد isolatioن ويقدم عالية الغلة (ما يصل إلى 14 × 10 6 خلايا لكل الماوس) ونقاء عالية (> 95٪) من خلايا كوبفر. هذه الطريقة العزلة لا يتطلب معدات متطورة أو باهظة الثمن، وبالتالي يمثل حلا وسطا مثاليا بين التعقيد والعائد الخلية. استخدام الفئران أثقل (35-45 ز) يحسن العائد من طريقة العزل ولكن أيضا يسهل بشكل ملحوظ الإجراء من الوريد البابي إقناء؛ إدخال القنية. وقد تم قياس سمية أنابيب الكربون النانوية functionalized و -CNTs في هذا النموذج من قبل فحص LDH تعديلها. هذا الأسلوب يقيم بقاء الخلية عن طريق قياس انعدام السلامة الهيكلية للغشاء الخلية كوبفر بعد الحضانة مع -CNTs و. سمية الناجم عن -CNTs و يمكن قياسها باستمرار باستخدام هذا الاختبار، مشددا على أن خلايا كوبفر معزولة مفيدة لاختبار السمية جسيمات متناهية الصغر. الفهم الشامل للnanotoxicology يمكن أن تستفيد من هذه النماذج، مما يجعل اختيار جسيمات متناهية الصغر للترجمة السريرية أكثر ايفيcient.
Introduction
ويهدف مجال البحث nanotoxicology لوصف التأثير البيولوجي للجزيئات النانوية. لا تزال الدراسات السمية بناء على التحقيقات المجراة الطرق الأكثر دقة. ومع ذلك، فإن استخدامها محدود بسبب التكلفة والعمل والوقت متطلباتهم 1. كما تم استخدام البدائل، فحوصات في المختبر بسبب بساطتها وإمكانية تطوير الإنتاجية العالية في منصات اختبار المختبر 2 - حتى تمديد عدد من الشروط التي تم اختبارها. يتم تنفيذ معظم الدراسات nanotoxicological استخدام في فحوصات المختبر مع خطوط الخلايا خلد. ومع ذلك، هناك مخاوف بشأن استقراء هذه النتائج التجريبية لفي الجسم الحي الآثار السمية 3. في الواقع، يمكن أن خصائص خطوط الخلايا خلد تكون مختلفة كثيرا عن الأنسجة كانوا المتأتي من مثل التحول الجيني 4، وتدهور الخصائص المورفولوجية الرئيسية5، وفقدان قطبية الخلوية 6 والتعديلات الفنية مثل تنظيم وسطاء التهابات 7.
خلايا كوبفر هي السكان بلعم الأكثر وفرة في الجسم، وهي على اتصال مباشر مع الدم عن طريق المبطنة لجدار الجيوب الكبد. كجزء من الجهاز الشبكي البطاني (RES)، وهذه البلاعم هي المسؤولة عن القبض على تعميم النانوية، وبالتالي، تشكل نموذجا مناسبا للغاية لدراسة سمية جسيمات متناهية الصغر. في الجسم الحي 8 وفي المختبر وقد نشرت دراسات 9 من الاستجابات الالتهابية المرتبطة مع خلايا كوبفر تتعرض لالنانوية في مكان آخر. كما شاركت خلايا كوبفر في التسبب في أمراض الكبد مثل أمراض الكبد الكحولية 10، تليف الكبد أو التهاب الكبد الفيروسي 11 12. وأفيد أن خلايا كوبفر معزولة توفر البصيرة مفيدة لوصف الآليات الخلوية الجردolved في اضطراب الكبد 13،14.
وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لعزل وتنقية خلايا كوبفر. عزل الخلايا يمكن أن تنجم عن ميكانيكي أو الأنزيمية التفكك 15. يظهر الهضم كولاجيناز ميزة الحفاظ على سلامة الوظيفية للخلايا كوبفر، في حين يؤدي إلى ارتفاع كوبفر الخلايا العائد 16. مناهج تجريبية عديدة، متفاوتة في التعقيد والتكاليف، وقد استخدمت لفصل خلايا كوبفر من غيرهم من السكان خلايا الكبد. على سبيل المثال، لا يمكن أن يتحقق كوبفر نقاء الخلية immunoaffinity 17، وتدفق الكهربائي 18، التصاق الانتقائي 16 أو من خلال تقنيات الطرد المركزي 16، والذي حدد الخلايا وفقا لحجمها وكثافة. مزيج من هذه الطرق يمكن اختيار لزيادة نقاء من السكان 16. لا يوجد إجماع حول الأسلوب الأمثل لعزل الخلايا كوبفر، لأنها تعتمد في الغالب على تطبيق والمعدات المتاحةر. ومع ذلك، في حالة اختبار السمية جسيمات متناهية الصغر، وبساطة وإنتاجية عالية من التقنية المرتبطة الحفاظ الوظيفي للخلايا كوبفر يبدو أن الأكثر ملاءمة لهذا التطبيق.
ويستند كوبفر طريقة عزل الخلايا ذكرت هنا على طريقة التروية 2-خطوة تليها تنقية على التدرج الكثافة. تم تعديل طريقة من البروتوكول الأصلي الذي وضعته Smedsrød وآخرون 16 تصميم لعزل خلايا كبد الفئران. ذكرت معظم الدراسات وصفت عزل خلايا كوبفر من كبد الفئران. هنا، نحن تصف طريقة لعزل خلايا كوبفر من كبد الفأر، في ارتفاع العائد والنقاء. استخدام الفئران يقلل من تكلفة التجربة ويسمح بتجهيز عدة كبد للحصول على كميات كبيرة من خلايا كوبفر في اختبارات السمية جسيمات متناهية الصغر.
في بروتوكول التالية، وحضنت خلايا كوبفر مع أنابيب الكربون النانوية functionalized (و أي طول ارتفاع نسبة القطر ومساحة كبيرة، جعلت الأنابيب النانوية الكربونية المرشحين للاهتمام وهي الحاملة لأغراض العلاج والتشخيص. ومع ذلك، فقد أثيرت مخاوف بشأن سمية تشارك المركز الوطني 19، وتطوير جديدة في اختبارات المختبر يهدف إلى زيادة فهم تأثير بيولوجي CNT. ويرتبط سمية في خلية كوبفر مع عدم وجود السلامة الهيكلية للغشاء الخلية. يتم قياس ذلك من خلال فقدان إنزيم LDH حشوية من الخلية إلى طاف. مبدأ هذه الطريقة، لذلك، هو إزالة أي LDH صدر وقياس ما تبقى في خلايا 20. ويتم ذلك في الأفضلية لقياس LDH صدر في طاف لأن وجود الأنابيب النانوية الكربونية في طاف يتداخل مع مقايسة 21.
نقترح استخدام هذا فعال metho كوبفر العزلة خلية بسيطة والتكلفةد لعزل عدد كبير من خلايا كوبفر وظيفية. وهذا يسمح للفحص السمية من مجموعة من الجسيمات النانوية، في نموذج بلعم الأولية ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأعدم كل التجارب على الحيوانات في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة. يتم شرحها بروتوكول أجريت تحت إشراف وموافقة من تنظيم مكتب المملكة المتحدة الرئيسية
1. الإرواء وجمع الخليوي (الشكل 1)
الشكل 1: الكبد الإرواء بعد التخدير من الفأرة، يتم نقل الجهاز الهضمي أفقيا إلى اليسار من البطن من أجل جعل الوريد البابي (PV) للوصول. ومقنى الكهروضوئية باستخدام بطء تدفق (1-3 مل / دقيقة) من الحل EGTA / HBSS وveina الأجوف السفلي (IVC) هو تمزق على الفور لتجنب أي ضغط زائد داخل الكبد. في الدقيقة الاولى من نضح، يتم زيادة معدل تدفق تدريجيا إلى 7 مل / دقيقة. ثم يتم perfused لالحل كولاجيناز في 10 مل / دقيقة حتى يتم تحقيق الهضم الكامل.
- استعداداتإعادة طازجة كل الكواشف هو موضح في الجدول المواد.
- تدفئة EGTA (جلايكول الإثيلين رباعي حمض الخل) / HBSS (محلول الملح المتوازن هانك) محلول (50 مل لكل الماوس)، والحل كولاجيناز (100 مل لكل الماوس) لمدة 30 دقيقة في 40 ° C.
- شطف ضخ أنابيب مرنة لأول مرة مع 70٪ من الإيثانول. صب 40 مل من EGTA / HBSS الحل في أنبوب الطرد المركزي مغمورة في حمام الماء وشطف ضخ أنابيب مرنة مع درجة حرارة ما قبل EGTA / HBSS الحل.
- أداء التخدير الطرفي باستخدام الباربيتورات لإنتاج موثوق اللاوعي قبل هبوط في التنفس والموت. حقن الفينوباربيتون في 1 مغ / كغ، والملكية الفكرية في الماوس CD1 الإناث أو الذكور (35-45 جم). تأكيد التخدير من أخمص القدمين معسر.
- حلق الشعر في البطن وتعقيم سطح البطن باستخدام 70٪ محلول الإيثانول.
- قطع طريق تجويف البطن وفضح الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي عن طريق تحريك الأمعاء أفقيا إلى الجهة اليسرى من البطن.
- نجمةر المضخة بسرعة 1-3 مل / دقيقة مع الحل EGTA / HBSS ويقني؛ يدخل القنية الوريد البابي باستخدام إبرة 23 G فراشة (أجنحة قطع). المشبك الجزء من الوريد البابي مقنى مع إبرة 23 G والوجه ثم ملقط مليقط على سطح البطن الماوس فتح. الكبد يجب شاحب بسرعة داخل ثانية 30 الأول من نضح EGTA / HBSS الحل.
- شق بسرعة الجزء السفلي من الوريد الأجوف السفلي لتجنب بناء الضغط الزائد في الكبد، ومن ثم زيادة معدل تدفق تدريجيا إلى 7 مل / دقيقة، خلال الدقيقة الأولى من نضح. يموت الحيوان بسبب النزيف الثانوي إلى الوريد الأجوف بزل الوريد.
- عند أقل من 5 مل من EGTA / HBSS الحل باق في أنبوب الطرد المركزي، وملء هذا الامر مع كولاجيناز الحل (40-50 مل). زيادة معدل تدفق تدريجيا إلى 10 مل / دقيقة، وأكثر من 30 ثانية.
- جعل تضخم الكبد عن طريق الضغط على الوريد الأجوف السفلي، وذلك باستخدام الملقط، لمدة 5-10 فترات ثانية. ثيالصورة يمكن أن يتم بشكل دوري (5-10 مرات أثناء عملية الهضم). وهذه الخطوة تحسين تفكك خلية الكبد وتقليل الوقت نضح مع كولاجيناز.
- عندما يكون أقل من 10 مل من محلول كولاجيناز تبقى داخل أنبوب الطرد المركزي، صب 40-50 مل من قبل تحسنت حل كولاجيناز إلى أنبوب الطرد المركزي.
- بعد 10-15 دقيقة من نضح وحوالي 70-80 مل من كولاجيناز الحل perfused ل، وتطبيق ضغط صغيرة على سطح الكبد مع ملقط. A المطبوعة من الضغط تشير إلى أن خلايا الكبد يتم فصلها.
- إزالة الكبد من تجويف البطن كقطعة واحدة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 20-30 مل من كوبفر زنازين العزل متوسط. الحفاظ على خلايا الكبد على الجليد أو على 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد على 3 ساعات لتجنب التأثير بقاء الخلية الكبد.
- كرر الإجراء نضح على العديد من الحيوانات إذا لزم الأمر، مع الحفاظ على الكبد perfused لعلى الجليد. تجمع 02:59 كبد لتنقية والمضي قدما في المرحلة 3.
2. إعداد التدرج الكثافة الطرد المركزي (الشكل 2)
الشكل 2: إعداد التدرج الكثافة يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل حالة معقمة. يتم تحضير SIP عن طريق خلط 15.3 مل من محلول السيليكا المغلفة الجسيمات مع 1.7 مل من 10 × برنامج تلفزيوني. يتم خلط A 5 مل من SIP مع 15 مل من برنامج تلفزيوني لجعل 20 مل من 25٪ من محلول SIP. يتم خلط 10 مل من SIP مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لجعل 20 مل من 50٪ من محلول SIP. يضاف أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على حل 50٪ SIP (20 مل) يميل والحل SIP 25٪ (20 مل) ببطء باستخدام المصلية 25 مل ماصة.
- المضي قدما في الخطوات التالية (القسم 2.، 3. و5.) تحت ظروف معقمة والحفاظ على الخلايا على الجليد أو على 4 درجات مئوية. إعداد SIP (الحل من الجسيمات السيليكا متساوي التوتر مغلفة) عن طريق خلط 15.3 مل من محلول السيليكا المغلفة الجسيمات مع 1.7 مل من 10 × برنامج تلفزيوني. لجعل 20 مل من 25٪ من محلول SIP، مزيج 5 مل من SIP مع 15 مل من برنامج تلفزيوني. لجعل 20 مل من 50٪ من محلول SIP، مزيج 10 مل من SIP مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- ملء واحدة أنبوب الطرد المركزي مع 20 مل من محلول SIP 50٪. إمالة أنبوب الطرد المركزي في زاوية قريبة من 90 درجة وإضافة ببطء الحل SIP 25٪ (20 مل) على الجدار الجانبي للأنبوب باستخدام 25 مل ماصة المصلية، من دون لمس سطح طبقة SIP 50٪. عند إضافة حل SIP 25٪، وخفض تدريجيا إلى زاوية من الأنبوب. الحفاظ على درجة الكثافة على الجليد حتى الاستخدام.
3. كوبفر تنقية الخليوي (الشكل 3)
الرقم 3: تنقية خلايا كوبفر بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج والتصاق الخلايا يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل حالة معقمة. (A) وبعد تمزق كبسولة غليسون، تتم تصفية خلايا الكبد من خلال 100 ميكرومتر مصفاة. يتم طرد تعليق في × 50 جم لتجاهل خلايا الكبد (الكريات) وجمع جزء الخلية غير متني (طاف). ويتكرر هذه الخطوة 3 مرات. تضاف الخلايا غير متني على رأس التدرج متساوي التوتر متقطع وطرد في 800 x ج لمدة 15 دقيقة. ويتم تنقية خلايا كوبفر التي تم جمعها من 25٪ وسادة SIP كذلك عن طريق الانتقاء التصاق الخلية. ومطلي (B) خلايا في 24 لوحة جيدا والمحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة. تغسل الخلايا غير ملتصقة مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من HBSS. خلايا كوبفر العرض الخاصة بها ملتصقة التشكل 4 ساعات بعد الطلاء، وعندما -CNTs و يمكن أن تضاف إلى الخلايا. ويمثل الشريط على نطاق و25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- وضع واحد الكبد perfused لفي طبق بيتري مع 15 مل من كوبفر عزل الخلايا المتوسطة. تمزق كبسولة غليسون (غشاء الكبد) باستخدام المقص والإفراج عن جميع خلايا الكبد في كوبفر عزل الخلايا المتوسطة. تصفية حل على الرغم من خلية مصفاة 100 ميكرون التي سيتم جمعها في أنبوب الطرد المركزي. كرر الإجراء نضح على الكبد perfused لإضافية وتجمع الخلايا في نفس أنبوب الطرد المركزي (15 مل من ماوس واحدة، وتصل إلى 45 مل من ثلاثة الفئران).
- الطرد المركزي تعليق خلية في 50 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. والخلايا متني (خلايا الكبد) يكون في بيليه والخلايا غير متني (بما في ذلك خلايا كوبفر) سيكون في طاف.
- جمع طاف في أنبوب الطرد المركزي نظيفة وأجهزة الطرد المركزي في 50 x ج لمدة 2 دقيقة لكل منهما. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر.
- أجهزة الطرد المركزي في 1350 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير الخلايا غير متني. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 10 مل من كوبفر عزل الخلايا المتوسطة.
- إضافة محلول الخلايا غير متني على التدرج متساوي التوتر متقطع 25/50٪ كما هو موضح في 2.3. المائةrifuge في 850 x ج لمدة 15 دقيقة دون تسارع أو كسر.
- توطين المخصب جزء الخلية كوبفر الظهور عكر ضمن 25٪ SIP جزء قريب من واجهة SIP 25/50٪ (الشكل 3). باستخدام 10 مل ماصة المصلية، نضح حوالي 12 مل من أثرى جزء الخلية كوبفر. نقل الخلايا في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 35-40 مل من كوبفر عزل الخلايا المتوسطة. المزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي في 1350 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لتكوير الخلايا.
- تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 5-10 مل من قبل تحسنت كوبفر خلية الثقافة المتوسطة. عدد الخلايا (haemocytometer) وقياس الجدوى باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
- لوحة الخلايا غير متني النقاء في 24 لوحات جيدة في كثافة 5 × 10 5 خلايا / جيد. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (الشكل 3). بعد 30 دقيقة، وإزالة بلطف والمتوسطة، ويغسل ما قبل درجة حرارة محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) مرة واحدة ثم استبدالمع 500 ميكرولتر من الطازجة واستعد قبل خلية كوبفر الثقافة المتوسطة (لكل بئر).
- ترك خلايا كوبفر لا يقل عن 4 ساعة على 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ قبل العلاج مع النانوية، لتمكينهم من الحصول على التشكل ملتصقة.
4. توصيف
- كوبفر الخلايا الطهارة
- إعداد الطازجة حل PBS / BSA تستخدم للحفاظ على بقاء الخلية كوبفر. غسل خلايا مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من محلول PBS / BSA. إزالة حل PBS / BSA وفصل خلايا كوبفر في 500 ميكرولتر من الطازجة حل PBS / BSA باستخدام كشط لطيف. عندما يتم مطلي الخلايا في 24 لوحات جيدا، وتقصير القصوى من ريش مكشطة مع مقص لجعل الانفصال أسهل والمضي قدما. نقل الخلايا في أنابيب التدفق الخلوي.
- عد خلايا كوبفر باستخدام haemocytometer وأجهزة الطرد المركزي 1 × 10 5 خلايا في 1350 ز س. Resuspend الخلايا كوبفر في 30 ميكرولتر من F4 / 80 الأضداد (أنيق). تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الحفاظ على الخلايا غير ملوثين (لا حضنت مع الأجسام المضادة) على الجليد.
- إضافة 2 مل من محلول PBS / جيش صرب البوسنة في الخلايا الملون، الطرد المركزي في 1350 ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف الناتجة عن ذلك. الخلايا resuspend الملون في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / BSA.
- لتحليل التدفق الخلوي، بوابة 10000 غير ملوثين خلايا كوبفر وفقا لحجمها (مبعثر إلى الأمام) وتحبب (الجانب مبعثر). تحليل مضان من الخلايا المغلقة في FL-1 القناة.
- كرر الإجراء لخلايا كوبفر الملون الحفاظ على نفس الإعدادات المستخدمة لتحليل التدفق الخلوي للخلايا كوبفر غير ملوثين. تحديد وقياس مضان من الخلايا الملون لتقييم نقاء خلية كوبفر.
- كوبفر خلية أكلة آخر
- استبدال وسائل الإعلام مع 0.5٪ (V / V) حبات الفلورسنت في كوبفر خلية الثقافة المتوسطة واحتضان لمدة 4 ساعات في 37 ° C وCO 2 5٪.
- من أجل إزالة حبات غير المنضوية، الطرد المركزي خلايا كوبفر في 1350 x ج، ديscard الخلايا وطاف resuspend في 500 ميكرولتر PBS / BSA الحل. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر.
- خلايا كوبفر كشط في 500 ميكرولتر من الحل ونقل الخلايا PBS / BSA إلى التدفق الخلوي الأنبوب.
- خلايا كوبفر أجهزة الطرد المركزي في 1350 x ج، تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / BSA الحل.
- لتحليل التدفق الخلوي، بوابة 10000 غير ملوثين خلايا كوبفر وفقا لحجمها (مبعثر إلى الأمام) وتحبب (الجانب مبعثر). تحليل مضان من الخلايا المغلقة في FL-2 القناة.
5. حضانة كيميائيا Functionalized أنابيب الكربون النانوية (و -CNTs)
- إعداد تشتت -CNTs و (1 ملغ / مل) في المياه عن طريق صوتنة لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. وتعد -CNTs و في المنزل 22.
- إعداد 2X الأنابيب النانوية الكربونية -و تتركز تشتت في كوبفر خلية الثقافة المتوسطة. الأنابيب النانوية الكربونية -و يصوتن فرقت في وسط ل2 دقيقة قبل الشروع في الخطوة 5.3).
- لكل بئر، واستبدال 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام القديمة مع 250 ميكرولتر من 2X -CNTs و التشتت. تستخدم الآبار غير المعالجة (250 ميكرولتر من مشروط المتوسطة + 250 ميكرولتر من خلية كوبفر الطازجة الثقافة المتوسطة) والآبار التي تمت معالجتها مع 10٪ DMSO كما المراقبة السلبية والإيجابية، على التوالي.
- احتضان خلايا كوبفر عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 أو 72 ساعة.
6. تقييم سمية -CNTs و في خلايا كوبفر من اللاكتات هيدروجيناز (LDH) الفحص التعديل
- تجاهل طاف.
- إضافة 200 ميكرولتر (لكل بئر من 24 لوحة جيدا) من الاحتياطي تحلل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 1 ساعة.
- بعد إجراء pipetting لقوي، وجمع هي lysed خلايا كوبفر في أنابيب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير -CNTs و التي تم تناولها من قبل الخلايا والحطام الخلية.
- جمع supernatants (ƒ-CNT مجاني) إلىأنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 ° C أو انتقل إلى الخطوة 6.5).
- نقل 50 ميكرولتر إلى لوحة 96-جيدا وإضافة حجم مساو من الحل مزيج الركيزة (مجموعة LDH) إلى كل بئر. تغطية لوحة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل أن يضيف 50 ميكرولتر من الحل محطة (مجموعة LDH). إضافة يثلث الآبار فارغة تحتوي على 50 ميكرولتر من تحلل العازلة، 50 ميكرولتر من محلول مزيج الركيزة و 50 ميكرولتر من محلول توقف.
- قراءة الامتصاصية في 490 نانومتر في قارئ صفيحة ميكروسكوبية واستخدام الصيغة التالية لحساب (٪) بقاء الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان عدد الخلايا متني غير النقاء بما يتفق وتراوحت ما بين 8 و 14 × 10 6 خلايا في الماوس (تم تنفيذ 17 العزلة). وكانت كل العزلة الماوس كافية لوحة 16-28 الآبار. وأظهرت بقاء الخلية التي تلطيخ التريبان الأزرق بقاء الخلية ~ 95٪. أظهرت خلايا كوبفر شكل دائري غضون 30 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، المتعلقة بهم التشكل ملتصقة غير مكتمل (الشكل 4A). في 4 ساعات من الحضانة وبعد ذلك، تم نشر الخلايا وبدأت مجموعات الخلايا لتشكيل.
وبعد ذلك تتميز خلايا كوبفر لتأكيد نقاء والنشاط أكلة. كانت ملطخة الخلايا مع F4 / 80 الأجسام المضادة للتدليل على نقاء خلايا كوبفر. وأظهر تحليل التدفق الخلوي كوبفر نقاء خلية تزيد عن 95٪ (الشكل 4B). وحضنت الخلايا مع 1 ميكرومتر الخرز الفلورسنت، 12 ساعة بعد الطلاء، لتأكيد قدرتها على تناول الجزيئات الكبيرة. تحليل التدفق الخلوي أظهرت ثار أكثر من 85٪ من خلايا كوبفر هي أكلة، أي يمكن أن تصل إلى 1 ميكرومتر الخرز (الشكل 4C). بعد 72 ساعة من الثقافة، وكانت 40٪ من خلايا كوبفر أكلة، مشيرا إلى أن خلايا كوبفر فقدت جزئيا نشاطهم أكلة.
التصوير المجهري للخلايا كوبفر حضنت مع -CNTs و لمدة 24 و 72 ساعة كشف مورفولوجيا الخلايا مماثل بالمقارنة مع خلايا ساذجة (الشكل 5A). خلايا كوبفر حضنت مع 10٪ DMSO (مراقبة إيجابية) عرض التشكل النخر (الشكل 5A). بعد تحليل فحص LDH تعديل، وخلايا كوبفر تعامل مع 10٪ DMSO (مراقبة إيجابية) لمدة 24 وأظهرت 72 ساعة سمية عالية (الشكل 5B). في المقابل، -CNTs و الناجم عن انخفاض طفيف ولكنه هام في بقاء الخلية فقط عندما تعرضت الخلايا في 50 ميكروغرام / مل لمدة 72 ساعة (الشكل 5B).
الرقم 4: الطهارة وامتصاص قدرات خلايا كوبفر (A) وصور مجهرية للخلايا كوبفر مطلي بعد 30 دقيقة أو 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع أجواء 5٪ CO 2. ويعرض شريط نطاق 50 ميكرون. ونفذت (B) تحليل التدفق الخلوي للخلايا كوبفر في أعقاب FSC / SSC النابضة الخلية. تم تحديد كوبفر نقاء الخلية باستخدام F4 / 80 تلوين الأجسام المضادة وأظهرت أن أكثر من 95٪. وحضنت الخلايا (C) كوبفر لمدة 4 ساعة بحضور 1 ميكرومتر الخرز الفلورسنت لتقييم نشاطهم أكلة. تم الحفاظ على الخصائص الفنية للكوبفر أفضل في الخلايا المعزولة حديثا (12 ساعة بعد الطلاء) مقارنة مع الخلايا اختبار بعد 3 أيام.
الشكل 5: امتصاص وسمية <م> الأنابيب النانوية الكربونية -و في خلايا كوبفر. (A) الصور المجهري للخلايا كوبفر. الصور تظهر خلايا كوبفر تعامل مع 10٪ DMSO و 50 ميكروغرام / مل من -CNTs و عند 37 درجة مئوية لمدة 24 و 72 ساعة. ويعرض شريط نطاق 50 ميكرون. (B) التعديل فحص LDH. واعتبر منخفضة بقاء الخلية في DMSO تعامل الخلايا 10٪ (الضوابط الإيجابية)، في حين -CNTs و تتأثر بشكل كبير بقاء الخلية إلا بعد المعرض إلى 50 ميكروغرام / مل لمدة 72 ساعة. * P <0.05 نسبة إلى حالة ساذجة (باستثناء 10٪ حالة DMSO) باستخدام تحليل التباين (ANOVA في اتجاه واحد) مع التحليل اللاحق من قبل اختبار توكي. يتوافق شريط النطاق إلى 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات التالية هي حاسمة لتحقيق عائدات عالية وقابلية عالية للخلايا كوبفر. وينبغي أن تستخدم ظروف معقمة للحد من مخاطر التلوث الجرثومي والفطري. يتعين على جميع الأدوات اللازمة لتعقيمها قبل استخدامها. الكواشف يجب الطازجة قبل تنفيذ إجراء العزل.
اختيار كولاجيناز الرابع، مع انخفاض النشاط زيتية، أمر بالغ الأهمية. الكثير مختلفة من نفس المورد لها النشاط الأنزيمي مختلفة، وأنها قد تحتاج إلى مقارنة في البداية لتحديد الدفعة الأنسب لكوبفر العزلة الخلية. هذا يمكن الحكم من خلال تقييم العائد الخلية وبقاء الخلية. ويوصى أيضا للاتصال المورد لتوفير دفعات التي تم استخدامها لتطبيقات مماثلة. مرة واحدة قررت على دفعة لاستخدامها، حجز للاستخدام في المستقبل.
يتطلب الإجراء إقناء؛ إدخال القنية التدريب. التخطيط لاستخدام العديد من الحيوانات لتصبح ثقة مع الوريد البابيالإجراء إقناء؛ إدخال القنية. مع الممارسة، سوف تتحقق إقناء؛ إدخال القنية الناجح بسهولة ويمكن التعامل معها الإجراء من قبل شخص واحد. لاحظ أن استخدام الحيوانات الثقيلة يزيد من قطر الوريد البابي وبالتالي يسهل الإجراء. عندما يتم ثقب الجدار الخلفي من الوريد البابي، فإنه من الصعب تقنيا للوصول إلى الوريد مرة أخرى، وخاصة إذا كنت جديدا على هذا الإجراء، وبالتالي، فمن الأفضل أن تبدأ مع حيوان جديد.
يجب أن يكون حلول HBSS وكولاجيناز الحامضية والقاعدية تعديلها إلى 7.4 ويمكن قبل تحسنت عند 40 درجة مئوية إلى تحقيق درجة الحرارة الناتج من مضخة تحوي 37 ° C. نضح مع EGTA / HBSS الحل (الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ مجانا) هناك حاجة تحتوي على EGTA لتعطيل كا 2+ جزيئات الالتصاق معتمد على، واسمه جسيم رابط، وإضعاف التفاعل خلية خلية. ويستخدم نوع كولاجيناز الرابع لفصل خلايا الكبد من المصفوفة خارج الخلية ويؤدي ذلك إلى الكبدتفكك خلية. الوقت نضح لالحلين يجب أن لا تتجاوز 15 دقيقة بالنسبة للفئران CD1 لكن السلالات الأخرى، مثل C57BL / 6، تتطلب أطول قليلا الكبد الوقت الهضم.
لتحقيق العزلة الناجحة، فمن الضروري الحصول على العائد خلية العالية وقدرتها على البقاء. إذا المجرب ليس لديه خبرة في عزل خلايا الكبد، وينصح الجمع بين الكريات خلايا الكبد من centrifugations 3 الأول في 50 x ج وعدد الخلايا عن طريق التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة. يجب أن يكون العائد الكبدية> 20 × 10 6 خلايا والجدوى الكبدية> 50٪. العائدات المنخفضة تؤدي أساسا من سوء تفكك خلية مما يؤدي بشكل غير مباشر إلى انخفاض العائد خلية كوبفر. وينبغي التأكيد على أن الكبد يهضم بشكل صحيح في نهاية الخطوة الارواء. وعندما يتحقق العائد الكبدية مناسبة في تركيبة مع قابلية منخفضة الكبدية، وهذا يمكن أن ينتج عن عملية الهضم كولاجيناز المفرط ولكن من المرجح أوضح من قبل الكبد غير مناسبالإجراء نضح أو استخدام الملوثة كاشف / المواد.
بعد الطلاء، وخلايا كوبفر حساسة ويجب غسلها برفق. وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن 4 ساعة للخلايا كوبفر للحصول على التشكل ملتصقة. ويتم العلاج عادة من 4-24 ساعة بعد الطلاء، كما تظهر خلايا كوبفر الأقصى نشاطهم أكلة في حدود 1 يوم بعد الطلاء.
في بروتوكول لدينا، ونحن تصف تفكك CD1 خلايا الكبد الماوس تليها تنقية خلايا كوبفر بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة والتحديد عن طريق الالتصاق. توصيف خلايا كوبفر، من خلال التدفق الخلوي، يوضح أن ارتفاع العائد ونقاء خلايا كوبفر يمكن تحقيقه باستخدام هذا الأسلوب.
ويمثل هذا كوبفر طريقة عزل الخلايا حلا وسطا بين قيمة التعقيد والعائد الخلية. ومع ذلك، تشير التقارير إلى أن بعض وسائل خلية كوبفر يمكن أن يكون أسهل لإجراء مثل بروتوكول صفهاوو وآخرون، حيث يتم هضم الكبد خارج الجسم الحي 23. ومع ذلك، فإن الطريقة التي وصفها وو وآخرون. يؤدي إلى كمية محدودة من الخلايا وأقل نقاء الخلية. ويمكن الحصول على عائدات أعلى والنقاء ولكنها تتطلب معدات باهظة الثمن و / أو متطورة، ويمكن أن يكون مضيعة للوقت.
البروتوكول الأصلي الذي وضعته Smedsrød وآخرون. 16 استخدام بروتوكول مماثل على أساس 2-خطوة طريقة الارواء (HBSS + الهضم كولاجيناز) تليها الطرد المركزي على التدرج Percoll واختيار وسادة Percoll أقل لمزيد من التنقية من خلال التصاق السطح. عن طريق تعديل إجراءات الطرد المركزي وجمع وسادة Percoll العليا، قمنا بزيادة المخصب جزء خلية كوبفر من 5.25 × 10 6-8،2 × 10 6 خلايا في كل غرام من الكبد. ويمكن أن يعزى هذا التحسن إلى استخدام EGTA خلال خطوة نضح في وقت مبكر من أجل تسهيل تفكك خلايا الكبد. Moreover، هل استخدام تحليل التدفق الخلوي يسمح للتوصيف الكمي يمكن الاعتماد عليها من كوبفر نقاء الخلية ونشاط البلعمة. مع تحقيق عائد أعلى من 14 × 10 6 المنقى الخلايا غير متني في كبد الفأر. طريقة العزل الحالي تحقيق قدر أكبر من خلايا كوبفر في الكبد الماوس لما تم الإبلاغ عنها في الأدب 24. هذا التحسن يمكن تفسيرها من خلال استخدام الماوس أثقل (35-45 جم) مقارنة مع الطرق الأخرى 24. بجانب هذه الزيادة في العائد خلية، واستخدام الحيوانات الكبيرة يسهل بشكل ملحوظ الإجراء من الوريد البابي إقناء؛ إدخال القنية.
الإنتاجية العالية في اختبار المختبر يمكن القيام بها باستخدام هذا النموذج أكلة الأساسي، وبالتالي محاكاة تأثير في الجسم الحي سمية الجسيمات النانوية. الفهم الشامل للnanotoxicology يمكن أن تستفيد من هذه النماذج، مما يجعل اختيار جسيمات متناهية الصغر للترجمة السريرية أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتماشى معتطبيق مفهوم من 3 R (الحد، والصقل واستبدال) في أبحاث الطب الحيوي الحيواني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
