Abstract
La grande maggioranza degli studi in vitro nanotoxicological hanno utilizzato linee di cellule immortali per la loro praticità. Tuttavia, i risultati di test di tossicità delle nanoparticelle in linee cellulari immortali o cellule primarie hanno mostrato discrepanze, evidenziando la necessità di estendere l'uso di pile per saggi in vitro. Questo protocollo descrive l'isolamento di macrofagi fegato di topo, cellule di Kupffer denominate e il loro uso per studiare la tossicità delle nanoparticelle. Cellule di Kupffer sono la popolazione più abbondanti macrofagi nel corpo e costituiscono parte del sistema reticolo-endoteliale (RES), responsabile per la cattura di nanoparticelle circolanti. Il metodo di isolamento delle cellule Kupffer qui riportata si basa su un metodo di perfusione 2-step seguita da purificazione su gradiente di densità. Il metodo, basato sulla digestione collagenasi e centrifugazione densità, è adattato dal protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. Ideato per ratto isolatio cellule del fegaton e fornisce ad alto rendimento (fino a 14 x 10 6 cellule per topo) e purezza elevata (> 95%) di cellule di Kupffer. Questo metodo di isolamento non richiede attrezzature sofisticate o costose e rappresenta quindi un compromesso ideale tra complessità e la resa delle cellule. L'uso di topi più pesanti (35-45 g) migliora la resa del metodo di isolamento, ma anche facilita notevolmente la procedura di cannulazione vena porta. La tossicità dei nanotubi di carbonio funzionalizzati f -CNTs stata misurata in questo modello con il saggio LDH modificato. Questo metodo valuta vitalità cellulare misurando la mancanza di integrità strutturale della membrana cellulare Kupffer, dopo incubazione con -CNTs f. La tossicità indotta da -CNTs f può essere misurato in modo coerente da questo test, evidenziando che le cellule di Kupffer isolate sono utili per i test di tossicità delle nanoparticelle. La comprensione globale di nanotossicologia potrebbe beneficiare di tali modelli, rendendo la selezione nanoparticelle per traduzione clinica più efficiente.
Introduction
Il campo di ricerca nanotossicologia mira a caratterizzare l'effetto biologico delle nanoparticelle. Studi tossicologici basati su indagini in vivo restano i metodi più accurati. Tuttavia, il loro impiego è limitato dalla loro costo, lavoro e tempo requisiti 1. Come saggi alternative, in vitro sono stati utilizzati per la loro semplicità e la possibilità di sviluppare ad alta produttività in piattaforme di test in vitro 2 - così estendendo il numero di condizioni testate. La maggior parte degli studi nanotoxicological sono eseguiti utilizzando in vitro con linee cellulari immortalizzate. Tuttavia, ci sono preoccupazioni per quanto riguarda l'estrapolazione di questi risultati sperimentali di effetti tossicologici in vivo 3. Infatti, le proprietà di linee cellulari immortalizzate possono essere significativamente diverso dai tessuti sono stati derivati da, per esempio la trasformazione genetica 4, il deterioramento delle caratteristiche morfologiche chiave5, perdita della polarità cellulare 6 e alterazioni funzionali come la regolamentazione dei mediatori infiammatori 7.
Cellule di Kupffer sono la popolazione più abbondanti macrofagi nel corpo e sono direttamente in contatto con il sangue allineando la parete di sinusoidi epatici. Come parte del sistema reticolo-endoteliale (RES), questi macrofagi sono responsabili per la cattura di circolazione nanoparticelle e pertanto costituiscono un modello particolarmente adatto per studiare la tossicità delle nanoparticelle. In vivo 8 e in vitro 9 studi di risposte infiammatorie associate con le cellule di Kupffer esposte a nanoparticelle sono stati pubblicati altrove. Cellule di Kupffer sono state coinvolte nella patogenesi delle malattie del fegato, come la malattia epatica alcolica 10, fibrosi epatica 11 o epatite virale 12. E 'stato riferito che le cellule di Kupffer isolate forniscono informazioni utili per descrivere i meccanismi cellulari involved in rottura di fegato 13,14.
Diversi metodi sono stati segnalati per isolare e purificare le cellule di Kupffer. Isolamento cellulare può derivare da meccanico o enzimatica dissociazione 15. Digestione Collagenase mostra il vantaggio di conservare l'integrità funzionale delle cellule di Kupffer, mentre portando a rendimento cellula di alta Kupffer 16. Molti approcci sperimentali, che variano in complessità e costi, sono stati utilizzati per separare le cellule di Kupffer da altre popolazioni cellulari del fegato. Ad esempio, la purezza delle cellule Kupffer può essere ottenuto mediante immunoaffinità 17, elettroforesi flusso 18, adesione selettiva 16 o mediante tecniche centrifughe 16, che selezionano celle in base alla loro dimensione e la densità. Una combinazione di questi metodi può essere scelto per aumentare la purezza della popolazione 16. Non c'è consenso sul metodo ideale per l'isolamento delle cellule Kupffer, in quanto dipende in gran parte l'applicazione e disponibili equipment. Tuttavia, nel caso di test di tossicità delle nanoparticelle, la semplicità e l'alta resa della tecnica associata con la conservazione funzionale delle cellule di Kupffer sembrava essere più adatto per questa applicazione.
Il metodo di isolamento delle cellule Kupffer qui riportata si basa su un metodo di perfusione 2-step seguita da purificazione su gradiente di densità. Il metodo è stato modificato dal protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. 16 progettato per l'isolamento delle cellule di fegato di ratto. La maggior parte degli studi hanno riportato e descritto l'isolamento delle cellule Kupffer da fegati di ratto. Qui, si descrive un metodo per isolare le cellule di Kupffer da fegato di topo, ad un alto rendimento e purezza. L'utilizzo di topi riduce il costo dell'esperimento e permette la lavorazione di diversi fegati di ottenere grandi quantità di cellule di Kupffer per test di tossicità nanoparticelle.
Nella seguente protocollo, cellule di Kupffer sono state incubate con nanotubi di carbonio funzionalizzati (f cioè alto rapporto lunghezza su diametro e grande superficie, hanno fatto CNT candidati interessanti come vettori per scopi terapeutici e di diagnosi. Tuttavia, sono state espresse in merito alla tossicità del CNT 19, e lo sviluppo di nuovi test in vitro è inteso a migliorare la comprensione di CNT effetto biologico. Tossicità in cellule di Kupffer è associato ad una mancanza di integrità strutturale della membrana cellulare. Questo viene misurato dalla perdita di enzima LDH citoplasmatica dalla cellula nel supernatante. Il principio di questo metodo, quindi, è quello di rimuovere qualsiasi LDH rilasciata e misurare ciò che resta nelle celle 20. Questo viene fatto in preferenza alla misura della LDH rilasciata nel supernatante perché la presenza di CNT nel surnatante interferisce con il test 21.
Proponiamo l'uso di questo efficace metho isolamento delle cellule Kupffer semplice ed economicod isolare elevato numero di cellule di Kupffer funzionali. Questo permette la proiezione di tossicità di una gamma di nanoparticelle, in un modello rilevante macrofagi primari.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e le agenzie di regolamentazione. Il protocollo di essere dimostrato è stata eseguita sotto la guida e l'approvazione del regolamento dell'ufficio IT Home
1. perfusione e Cell Collection (Figura 1)
Figura 1:. Fegato perfusione Dopo anestesia del mouse, il tratto digerente è lateralmente spostato a sinistra dell'addome in modo da rendere la vena porta (PV) accessibile. Il PV è cannulata con una bassa velocità di flusso (1-3 ml / min) della soluzione EGTA / HBSS e Veina cava inferiore (IVC) è immediatamente rotto per evitare qualsiasi eccesso di pressione all'interno del fegato. Entro il primo minuto di perfusione, la portata viene gradualmente aumentata a 7 ml / min. La soluzione di collagenasi viene perfuso a 10 ml / min fino a raggiungere la sua piena digestione.
- Prepari appena tutti i reagenti descritti nella tabella materiale.
- Scaldare il EGTA (glicole etilenico Tetra-acetico) / HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) Solution (50 ml per mouse) e la soluzione di collagenasi (100 ml per il mouse) per 30 minuti a 40 ° C.
- Sciacquare il tubo flessibile della pompa prima con il 70% di etanolo. Versare 40 ml di EGTA / HBSS soluzione in un tubo da centrifuga immerso nel bagno di acqua e risciacquare il tubo flessibile della pompa con pre-riscaldato EGTA / HBSS soluzione.
- Eseguire anestesia terminale utilizzando un barbiturico per produrre in modo affidabile di incoscienza prima depressione respiratoria e morte. Iniettare phenobarbitone a 1 mg / kg, ip in un topo CD1 femminile o maschile (35-45 g). Confermare l'anestesia da pizzicare punta.
- Shave peli addominali e sterilizzare la superficie addominale utilizzando una soluzione di etanolo al 70%.
- Tagliare attraverso la cavità addominale ed esporre la vena porta e la vena cava inferiore spostando l'intestino lateralmente a sinistra dell'addome.
- Stellat la pompa ad una velocità di 1-3 ml / min con la soluzione EGTA / HBSS e cannulate la vena porta con un ago 23 g farfalla (ali tagliate). Fissare la sezione della vena porta cannulata con l'ago 23 G e quindi capovolgere la pinza serrefine sulla superficie dell'addome del mouse aperto. Il fegato dovrebbe rapidamente pallido entro i primi 30 secondi di EGTA / HBSS soluzione perfusione.
- Rapidamente incidere la parte inferiore della vena cava inferiore per evitare edificio sovrappressione nel fegato, e quindi aumentare la portata gradualmente a 7 ml / min, il primo minuto di perfusione. L'animale muore a causa di sanguinamento secondario a Vena prelievo venoso cavale.
- Quando meno di 5 ml di EGTA / HBSS soluzione è rimanente in provetta, riempire con collagenasi Solution (40-50 ml). Aumentare la portata gradualmente a 10 ml / min, più di 30 sec.
- Rendere il rigonfiamento del fegato applicando pressione alla vena cava inferiore, utilizzando una pinzetta, per 5-10 intervalli sec. This può essere fatto periodicamente (5-10 volte durante la digestione). Questa fase permetterà di migliorare la dissociazione delle cellule del fegato e ridurre il tempo di perfusione con collagenasi.
- Quando meno di 10 ml di soluzione di Collagenasi rimane all'interno del tubo da centrifuga, versare 40-50 ml di soluzione pre-riscaldato Collagenase nel tubo da centrifuga.
- Dopo 10-15 minuti di perfusione e circa 70-80 ml di collagenasi Solution perfusi, applicare una piccola pressione sulla superficie del fegato con una pinza. Una stampa di pressione indica che le cellule epatiche sono dissociate.
- Rimuovere il fegato dalla cavità addominale come un unico pezzo e metterlo in una provetta da centrifuga contenente 20-30 ml di Kupffer celle d'isolamento medio. Mantenere cellule epatiche in ghiaccio oa 4 ° C per un periodo massimo di 3 ore per evitare di compromettere la vitalità delle cellule del fegato.
- Ripetere la procedura di perfusione su diversi animali, se necessario, mantenendo il fegato perfuso su ghiaccio. Pool 1-3 fegati per la purificazione e procedere con la fase 3.
2. Preparazione del gradiente di densità per centrifugazione (Figura 2)
Figura 2:. Preparazione del gradiente di densità Tutte le procedure sono eseguite in condizioni sterili. Il SIP è preparata mescolando 15,3 ml di soluzione di particelle di silice rivestite con 1,7 ml di 10 x PBS. A 5 ml di SIP sono mescolati con 15 ml di PBS per rendere soluzione SIP 20 ml di 25%. 10 ml di SIP sono mescolati con 10 ml di PBS per ottenere soluzione SIP 20 ml di 50%. Un tubo da centrifuga contenente la soluzione al 50% SIP (20 ml) è inclinato e la soluzione SIP 25% (20 ml) viene aggiunta lentamente utilizzando un ml pipetta sierologica 25.
- Procedere con le seguenti operazioni (sezione 2., 3. e 5.) sotto condizioni sterili e mantenere le cellule in ghiaccio o a 4 ° C. Preparare la SIP (Soluzione di particelle di silice rivestite Isotonic) mescolando 15,3 ml di soluzione di particelle di silice rivestiti con 1,7 ml di 10 x PBS. Per rendere 20 ml di soluzione SIP 25%, mescolare 5 ml di SIP con 15 ml di PBS. Per rendere 20 ml di soluzione SIP 50%, miscelare 10 ml di SIP con 10 ml di PBS.
- Riempire una provetta da centrifuga con 20 ml della soluzione SIP 50%. Inclinare la provetta da centrifuga con un angolo vicino a 90 ° e aggiungere lentamente la soluzione SIP 25% (20 ml) sulla parete laterale del tubo con un 25 ml pipetta sierologica, senza toccare la superficie dello strato SIP 50%. Quando si aggiunge la soluzione SIP 25%, ridurre progressivamente l'angolo del tubo. Mantenere il gradiente di densità su ghiaccio fino al momento dell'uso.
3. Kupffer Purificazione cellulare (Figura 3)
Figura 3:. Purificazione di cellule di Kupffer dal gradiente di densità centrifugazione e l'adesione cellulare Tutte le procedure sono eseguite in condizioni sterili. (A) Dopo la rottura della capsula di Glisson, cellule del fegato sono filtrate attraverso un 100 micron filtro. La sospensione è centrifugato a x 50 g di disfarsi epatociti (pellet) e raccogliere la frazione di cellule non parenchimali (surnatante). Questa fase viene ripetuta 3 volte. Le cellule non parenchimali vengono aggiunti in cima a un gradiente isotonica discontinuo e centrifugato a 800 xg per 15 min. Cellule di Kupffer raccolti dal cuscino SIP 25% sono purificati ulteriormente selezione adesione cellulare. (B) Le cellule vengono piastrate in piastra da 24 pozzetti e incubate a 37 ° C e 5% CO 2 per 30 min. Le cellule non aderenti vengono lavati una volta con 500 ml di HBSS. Cellule di Kupffer mostrano la loro aderenti morfologia 4 ore dopo la placcatura, quando -CNTs f possono essere aggiunti alle cellule. La barra della scala rappresenta il 25 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Mettere un fegato perfuso in una capsula di Petri con 15 ml di Kupffer isolamento delle cellule Medium. Rottura capsula di Glisson (membrana del fegato) con le forbici e rilasciare tutte le cellule del fegato nel mezzo di isolamento delle cellule Kupffer. Filtrare la soluzione se un filtro cellulare 100 micron per essere raccolto in una provetta da centrifuga. Ripetere la procedura di perfusione su altri fegati irrorati e riunire le celle nella stessa provetta da centrifuga (15 ml di un mouse, fino a 45 ml da tre topi).
- Centrifugare la sospensione cellulare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C. Cellule parenchimali (epatociti) saranno in pellet e cellule non parenchimali (comprese le cellule di Kupffer) saranno nel surnatante.
- Raccogliere il supernatante in una provetta da centrifuga pulita e centrifugare a 50 xg per 2 minuti ciascuno. Ripetere questa operazione per altre tre volte.
- Centrifugare a 1.350 xg per 15 minuti per far sedimentare le cellule non parenchimali. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di Kupffer isolamento delle cellule Medium.
- Aggiungere la soluzione di cellule non parenchimali sul gradiente discontinuo isotonica 25/50% come descritto al punto 2.3. Centesimorifuge a 850 xg per 15 minuti, senza accelerazione o interruzione.
- Localizzare la frazione di cellule di Kupffer arricchita torbidi all'interno della frazione SIP 25% vicino all'interfaccia SIP 25/50% (Figura 3). Utilizzando un 10 ml pipetta sierologica, aspirare circa 12 ml di frazione di cellule Kupffer arricchito. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga contenente 35-40 ml di Kupffer isolamento delle cellule Media. Miscelare delicatamente e centrifugare a 1.350 xg per 15 min a 4 ° C per sedimentare le cellule.
- Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 5-10 ml di pre-riscaldato cellule Kupffer Cultura Media. Contare le celle (emocitometro) e misurare la sostenibilità utilizzando trypan colorazione blu.
- Piastra le purificate cellule non parenchimali in piastre da 24 pozzetti ad una densità di 5 x 10 5 cellule / pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 (Figura 3). Dopo 30 minuti, togliere delicatamente il medium, lavare con pre-riscaldato soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) una volta quindi sostituirecon 500 ml di fresco e pre-riscaldato Kupffer terreno di coltura cellulare (per bene).
- Lasciare cellule di Kupffer per almeno 4 ore a 37 ° C e 5% CO 2 prima del trattamento con nanoparticelle, per consentire loro di acquisire loro morfologia aderente.
4. Caratterizzazione
- Kupffer Cells Purezza
- Preparare fresco soluzione PBS / BSA utilizzato per mantenere la vitalità delle cellule Kupffer. Lavare le cellule una volta con 500 ml di soluzione di PBS / BSA. Rimuovere la soluzione PBS / BSA e staccare cellule di Kupffer in 500 ml di soluzione fresca PBS / BSA con delicato raschiatura. Quando le cellule vengono piastrate in piastre da 24 pozzetti, abbreviare le estremità delle pale raschianti con forbici per rendere il distacco facile procedere. Trasferire le cellule in citometria a flusso tubi.
- Contare le cellule di Kupffer utilizzando un emocitometro e centrifugare 1 x 10 5 cellule a 1.350 x g. Risospendere le cellule Kupffer in 30 ml di F4 / 80 anticorpi (pulito). Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Mantenere le cellule non colorate (non incubate con l'anticorpo) su ghiaccio.
- Aggiungere 2 ml di soluzione PBS / BSA in cellule colorate, centrifugare a 1.350 g per 5 minuti e scartare il surnatante risultante. Risospendere cellule colorate in 200 ml di PBS / BSA.
- Per citometria a flusso, porta 10.000 non colorati cellule di Kupffer base alle loro dimensioni (forward scatter) e granularità (lato dispersione). Analizzare fluorescenza delle cellule gated in FL-1 canale.
- Ripetere la procedura per le cellule di Kupffer colorate mantenendo le stesse impostazioni utilizzate per l'analisi di citometria a flusso di cellule di Kupffer non colorati. Selezionare e quantificare la fluorescenza delle cellule colorate per valutare la purezza delle cellule Kupffer.
- Kupffer cellulare fagocitaria Attività
- Sostituire media con 0,5% (v / v) perline fluorescenti in Kupffer cellulare terreno di coltura e incubare per 4 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Al fine di rimuovere perline non interiorizzate, cellule di Kupffer centrifugare a 1.350 xg, discard le cellule surnatante e risospendere in 500 microlitri di PBS / BSA Solution. Ripetere questa operazione altre 2 volte.
- Raschiare le cellule Kupffer in 500 ml di soluzione e di trasferimento cellule PBS / BSA in un tubo di citometria a flusso.
- Cellule centrifuga Kupffer a 1.350 xg, scartare le cellule surnatante e risospendere in 200 ml di PBS / BSA Solution.
- Per citometria a flusso, porta 10.000 non colorati cellule di Kupffer base alle loro dimensioni (forward scatter) e granularità (lato dispersione). Analizzare fluorescenza delle cellule gated in FL-2 canali.
5. Incubazione di chimicamente nanotubi di carbonio funzionalizzati (f -CNTs)
- Preparare una dispersione di -CNTs f (1 mg / ml) in acqua mediante sonicazione per 15 minuti prima dell'uso. -CNTs F sono preparati in casa 22.
- Preparare 2x CNT f- concentrati dispersione in Kupffer terreno di coltura cellulare. CNT f- Sonicare dispersi in mezzo per2 min prima di procedere con passo 5.3).
- Per ogni bene, sostituire 250 ml di vecchi media con 250 ml di 2x dispersione -CNTs f. Pozzetti non trattati (250 l di media condizionata + 250 ml di fresco Kupffer terreno di coltura cellulare) e pozzi trattati con 10% di DMSO sono utilizzati come controlli negativi e positivi, rispettivamente.
- Incubare le cellule di Kupffer a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 o 72 ore.
6. Tossicità Valutazione della -CNTs f in cellule di Kupffer dal lattato deidrogenasi (LDH) Modificato
- Scartare il surnatante.
- Aggiungere 200 microlitri (per pozzetto della piastra da 24 pozzetti) di tampone di lisi e incubare a 37 ° C per 30 min-1 hr.
- Dopo aver effettuato pipettaggio vigoroso, raccolgono lisate cellule di Kupffer in provette da microcentrifuga e centrifugare a 40.000 g per 10 minuti a pellet -CNTs f che sono state prese dalle cellule e detriti cellulari.
- Raccogliere il surnatante (ƒ-CNT gratis) inprovette da microcentrifuga e conservare a -20 ° C o passare al punto 6.5).
- Trasferire 50 ml in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere un volume uguale di soluzione di substrato mix (kit LDH) a ciascun pozzetto. Coprire la piastra ed incubare a temperatura ambiente per 15 min prima di aggiungere 50 ml di soluzione di arresto (kit LDH). Aggiungere triplicato di pozzi vuoti contenenti 50 ml di tampone di lisi, 50 ml di soluzione di substrato mix e 50 ml di soluzione di stop.
- Leggere l'assorbanza a 490 nm in un lettore per micropiastre e utilizzare la seguente formula per calcolare il (%) vitalità cellulare.
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Representative Results
Il numero di cellule parenchimali non purificati era coerente e variava tra 8 e 14 x 10 6 cellule per topo (sono stati eseguiti 17 isolamenti). Ogni isolamento topo era sufficiente alla piastra 16-28 pozzi. La vitalità cellulare da trypan colorazione blu ha dimostrato la vitalità delle cellule ~ 95%. Cellule di Kupffer mostrato una forma rotonda in 30 min di incubazione a 37 ° C, in relazione alla loro morfologia incomplete aderente (Figura 4A). A 4 ore di incubazione e successivamente, le cellule sono state diffuse e gruppi di cellule hanno cominciato a formarsi.
Cellule di Kupffer sono stati poi caratterizzati per confermare la loro purezza e attività fagocitaria. Le cellule sono state colorate con F4 / 80 anticorpo per dimostrare la purezza delle cellule Kupffer. Citometria a flusso analisi ha mostrato la purezza delle cellule Kupffer superiore al 95% (Figura 4B). Le cellule sono state incubate con 1 micron perline fluorescenti, 12 ore dopo la placcatura, per confermare la loro capacità di raccogliere le particelle più grandi. Citometria a flusso analisi ha dimostrato that oltre l'85% delle cellule di Kupffer sono fagociti, vale a dire in grado di prendere le 1 micron perline (Figura 4C). Dopo 72 ore di cultura, il 40% delle cellule Kupffer erano fagociti, indicando che le cellule di Kupffer parzialmente perso la loro attività fagocitaria.
Microscopia imaging cellule di Kupffer incubate con -CNTs F per il 24 e 72 ore ha rivelato simile morfologia cellulare rispetto alle cellule naïve (Figura 5A). Cellule di Kupffer incubate con il 10% DMSO (controllo positivo) visualizzati morfologia necrotico (Figura 5A). Dopo l'analisi del test LDH modificato, cellule di Kupffer trattati con 10% DMSO (controllo positivo) per 24 ore e 72 hanno mostrato un'elevata tossicità (Figura 5B). In confronto, -CNTs f indotte lieve ma significativa riduzione della vitalità cellulare solo quando le cellule sono state esposte a 50 ug / ml per 72 ore (Figura 5B).
Figura 4: Purezza e l'assorbimento abilità delle cellule di Kupffer (A) le immagini al microscopio di cellule Kupffer placcato dopo 30 minuti o 24 ore a 37 ° C, con una atmosfera di 5% di CO 2.. La barra della scala presenta 50 micron. (B) citometria a flusso analisi delle cellule di Kupffer è stata effettuata a seguito FSC / SSC gating cellulare. Purezza delle cellule Kupffer è stato determinato utilizzando F4 / 80 colorazione anticorpale e ha mostrato di essere superiore al 95%. Cellule (C) Kupffer sono state incubate per 4 ore in presenza di 1 micron perline fluorescenti per valutare la loro attività fagocitaria. Le proprietà funzionali di Kupffer sono stati mantenuti meglio in cellule appena isolate (12 ore dopo la placcatura) rispetto alle cellule testate dopo 3 giorni.
Figura 5: Assorbimento e tossicità di <em> CNT f- nelle cellule di Kupffer. (A) immagini al microscopio delle cellule di Kupffer. Immagini mostrano cellule di Kupffer trattati con 10% DMSO e 50 ug / ml di -CNTs f a 37 ° C per 24 e 72 ore. La barra della scala presenta 50 micron. (B) Modificato test LDH. La vitalità delle cellule Basso è stato visto in DMSO cellule trattate il 10% (controlli positivi) mentre -CNTs f colpiti in modo significativo la vitalità cellulare solo dopo l'esposizione a 50 mg / ml per 72 ore. * P <0.05 rispetto alla condizione naïve (escluso il 10% condizione DMSO) utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA) con l'analisi post hoc dal test Tukey. La barra di scala corrisponde al 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I seguenti punti sono fondamentali per conseguire un livello elevato rendimento e l'alta vitalità delle cellule di Kupffer. Condizioni asettiche dovrebbero essere utilizzati per limitare il rischio di contaminazione batterica e fungina. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati prima dell'uso. I reagenti devono essere preparate al momento, prima di effettuare la procedura di isolamento.
La scelta di collagenasi IV, con bassa attività trittico, è di fondamentale importanza. Diversi lotti dallo stesso fornitore hanno attività enzimatica diverso e possono avere bisogno di essere paragonato inizialmente per selezionare il gruppo più adatto per l'isolamento delle cellule Kupffer. Questo può essere giudicato da valutare la resa delle cellule e la vitalità cellulare. Si consiglia inoltre di contattare il fornitore per fornire lotti che sono stati utilizzati per le applicazioni simili. Una volta deciso il lotto da utilizzare, riservare per un uso futuro.
La procedura di incannulamento richiede una formazione. Pianificare l'uso di diversi animali per prendere confidenza con la vena portaProcedura incannulamento. Con la pratica, cannulazione successo è facile da realizzare e la procedura può essere gestito da una sola persona. Si noti che l'utilizzo di animali pesanti aumenta il diametro della vena porta e quindi facilita la procedura. Quando la parete posteriore della vena porta è perforato, è tecnicamente difficile accedere nuovamente alla vena, soprattutto se sei nuovo con questo procedimento e, pertanto, è preferibile iniziare con un nuovo animale.
Le soluzioni HBSS e Collagenasi dovrebbero avere il loro pH regolato a 7,4 e essere pre-riscaldata a 40 ° C per ottenere una temperatura di uscita dalla pompa peristaltica di 37 ° C. La perfusione con EGTA / HBSS Solution (Ca 2+ e Mg 2+ gratuito) è necessario che contiene EGTA per l'interruzione di Ca 2+ molecole di adesione -dipendenti, chiamato desmosoma, indebolendo l'interazione cellula-cellula. Collagenasi di tipo IV è usato per staccare cellule epatiche dalla matrice extracellulare e quindi portare a fegatola dissociazione delle cellule. Il tempo di perfusione per le due soluzioni non deve superare 15 min per topi CD1 ma altri ceppi, quali C57BL / 6, richiedono fegato leggermente più lungo tempo di digestione.
Per ottenere un isolamento efficace, è necessario ottenere elevata resa e la vitalità cellulare. Se lo sperimentatore non ha alcuna esperienza in isolamento delle cellule del fegato, si consiglia di combinare pellet epatociti dai primi 3 centrifugazioni a 50 xg e contare le cellule da trypan blu test esclusione. Il rendimento epatociti deve essere> 20 x 10 6 cellule e la vitalità degli epatociti> 50%. I rendimenti bassi derivano essenzialmente da una cattiva dissociazione cellulare che porta indirettamente ad abbassare il rendimento delle cellule Kupffer. Dovrebbe essere confermato che il fegato è digerito al termine della fase di perfusione. Quando adatto resa epatociti è realizzata in combinazione con bassa viabilità epatociti, questo può derivare da una digestione collagenasi eccessivo ma è più probabilmente spiegato da un fegato appropriatoProcedura perfusione o l'uso di un reagente / materiale contaminato.
Dopo la placcatura, cellule di Kupffer sono sensibili e devono essere lavati delicatamente. Almeno 4 ore sono necessarie per le cellule di Kupffer di acquisire la loro morfologia aderente. Il trattamento viene effettuato generalmente 4-24 ore dopo la placcatura, come cellule di Kupffer mostrano la loro massima dell'attività fagocitaria nel 1 giorno dopo la placcatura.
Nel nostro protocollo, si descrive la dissociazione di CD1 cellule di fegato di topo, seguita dalla purificazione di cellule di Kupffer mediante gradiente di densità centrifugazione e selezione per adesione. La caratterizzazione delle cellule di Kupffer, citometria a flusso, dimostra che elevata resa e la purezza delle cellule di Kupffer possono essere realizzati con questo metodo.
Questo metodo di isolamento delle cellule Kupffer rappresenta un compromesso valido tra complessità e la resa delle cellule. Tuttavia, si segnala che alcuni metodi di cellule di Kupffer possono essere più facili da condurre, come il protocollo descritto daWu et al., In cui il fegato è digerito ex vivo 23. Tuttavia, il metodo descritto da Wu et al. porta ad un numero limitato di cellule e purezza cella inferiore. Resa e purezza possono essere ottenuti ma richiedono attrezzature costose e / o sofisticati e può richiedere molto tempo.
Il protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. 16 utilizzato un protocollo paragonabile base di 2-step metodo perfusione (HBSS + collagenasi digestione) seguita da centrifugazione su gradiente di Percoll e selezione del cuscino Percoll inferiore per ulteriore purificazione per adesione superficiale. Modificando la procedura di centrifugazione e raccogliendo il cuscino Percoll superiore, abbiamo aumentato la frazione arricchita di cellule Kupffer da 5,25 x 10 6-8,2 x 10 6 cellule per grammo di fegato. Tale miglioramento potrebbe essere attribuito all'uso di EGTA durante la fase perfusione presto al fine di facilitare la dissociazione delle cellule epatiche. Mnoltre, l'uso di citometria a flusso analisi ha permesso la caratterizzazione quantitativa affidabile di purezza delle cellule Kupffer e attività fagocitaria. Con una resa massima di 14 x 10 6 cellule purificate non parenchimali al fegato di topo. Il presente metodo di isolamento ottenere una maggiore quantità di cellule di Kupffer per topo fegato a quanto riportato in letteratura 24. Questo miglioramento può essere spiegata con l'uso di più pesante mouse (35-45 g) rispetto ad altri metodi 24. Accanto a questo aumento di quantità di cellule, l'uso di animali più grandi facilita notevolmente la procedura di cannulazione vena porta.
High-throughput test in vitro può essere effettuata con questo modello fagocitica primario, quindi simulando l'impatto tossicologico delle nanoparticelle in vivo. La comprensione globale di nanotossicologia potrebbe beneficiare di tali modelli, rendendo la selezione di nanoparticelle per la traduzione clinica più efficiente. Inoltre, è in linea conattuazione del concetto di 3 R (riduzione, perfezionamento e sostituzione) nella ricerca biomedica animali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
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