Abstract
시험 관내 연구 nanotoxicological 대다수는 실용성 불멸화 세포주를 사용 하였다. 그러나, 불멸화 세포주 또는 일차 전지에 나노 입자 독성 시험의 결과는 시험 관내 분석법 일차 전지의 사용을 확장 할 필요성을 강조 불일치를 보여 주었다. 이 프로토콜은 마우스 간 대 식세포의 분리라는 쿠퍼 세포 및 나노 입자의 독성을 연구하는 사용을 설명합니다. 쿠퍼 세포는 체내에서 가장 풍부한 식세포 인구이며, 나노 입자 순환 캡쳐 책임 세망 내피 체계 (RES)의 일부를 구성한다. 여기에보고 된 쿠퍼 세포 분리 방법은 밀도 구배에 의해 정제 하였다 2 단계 관류 법에 기초한다. 콜라게나 제 소화 밀도 원심 분리에 기초한 방법은, Smedsrød 동부 등에 의해 개발 된 기존의 프로토콜에서 적응된다. 래트 간세포 isolatio 설계된N과 높은 수율을 제공하며, 쿠퍼 세포의 고순도 (> 95 %) (14 × 10 (6) 마우스 당 세포까지). 이 분리 방법은 복잡한 또는 고가의 장비를 필요로하기 때문에 복잡성과 세포 수율 사이의 이상적인 타협을 대표하지 않습니다. 무거운 마우스 (35-45g)의 사용은 분리 방법의 수율을 현저하게 향상시킬뿐만 아니라, 문맥 삽관의 절차를 용이하게한다. -CNTs F 기능화 된 탄소 나노 튜브의 독성 변성 LDH 분석으로이 모델에서 측정되었다. 이 방법은 F -CNTs 함께 배양 후 쿠퍼 세포막의 구조적 무결성의 부족을 측정함으로써 세포 생존 능력을 평가한다. F -CNTs 의해 유도 된 독성 절연 쿠퍼 세포 나노 독성 시험에 유용한 것을 강조,이 분석을 이용하여 지속적으로 측정 할 수있다. 나노 독성학의 전반적인 이해는 임상 번역 더 effi의 나노 입자 선택을, 같은 모델의 혜택을 누릴 수 있습니다효율적인.
Introduction
나노 독성 연구 분야는 나노 입자의 생물학적 효과의 특성을 목표로한다. 생체 내 연구에 기초한 독성 연구는 가장 정확한 방법이 남아있다. 그러나, 그들의 사용은 자신의 비용, 노동과 시간 요구 사항 (1)에 의해 제한된다. 대안, 시험 관내 분석은 그들의 단순성 및 시험 관내 시험에서 플랫폼이 높은 처리량을 개발의 가능성으로서 사용되고있다 - 그렇게 시험 조건의 수를 확장. 대부분의 nanotoxicological 연구는 불멸화 세포주와 체외 분석에 사용하여 수행됩니다. 그러나, 생체 내 독성 학적 영향 (3)이 실험 결과의 추정에 대한 우려가있다. 실제로, 불멸화 세포주의 특성들이 조직으로부터 유래 된, 예를 들어 유전 적 변형 4 열쇠 형태 적 특징의 열화와 크게 상이 할 수있다5, 6 및 셀룰러 극성 염증성 매개체 (7)의 조정 등의 기능 변화의 손실.
쿠퍼 세포는 체내에서 가장 풍부한 식세포 인구이며 간 정현파의 벽을 라이닝하여 혈액과 직접 접촉한다. 세망 내피 시스템 (RES)의 일환으로,이 대 식세포는 나노 입자를 순환하기 때문에 캡처에 대한 책임, 나노 입자의 독성을 연구하기 위해 매우 적합 모델을 구성한다. 생체 내 (8) 체외에서 나노 입자에 노출 쿠퍼 세포와 관련된 염증 반응의 9 연구는 다른 곳에서 발표되었다. 쿠퍼 세포는 또한 알콜 성 간 질환 (10), 간 섬유증 (11) 또는 (12)로 바이러스 성 간염, 간 질환의 발병 기전에 관여하고있다. 그것은 절연 쿠퍼 세포가 세포기구 반전을 설명하는 유용한 통찰을 제공 할 것으로 알려졌다간 장애 (13, 14)에 olved.
여러 방법은 분리 및 쿠퍼 세포를 정화하는 것으로보고되었다. 세포 분리는 기계적 또는 효소 분해 (15)에서 발생할 수 있습니다. 콜라게나 제 소화 높은 쿠퍼 세포의 생산량 (16)에 이르는 동안, 쿠퍼 세포의 기능적 완전성을 보존하는 장점을 보여준다. 복잡성과 비용 가변 많은 실험 방법은, 다른 간세포 집단에서 쿠퍼 세포를 분리하는데 사용되어왔다. 예를 들면, 쿠퍼 세포 면역 순도 17 전기 흐름 (18) (16)에 의해 선택적으로 부착 또는 크기와 밀도에 따라 세포를 원심 선택 기법 (16)에 의해 달성 될 수있다. 이들 방법의 조합이 인구 (16)의 순도를 증가시키기 위해 선택 될 수있다. 그것은 대부분의 응용 프로그램 및 사용 가능한 기술 장비에 따라 달라집니다로 쿠퍼 세포 분리를위한 이상적인 방법에 대한 합의는 없다T. 그러나, 나노 입자의 독성 시험의 경우에는, 단순 및 쿠퍼 세포의 보존 기능과 관련된 기술의 높은 수율이 애플리케이션에 가장 적합한 것으로 나타났다.
여기에보고 된 쿠퍼 세포 분리 방법은 밀도 구배에 의해 정제 하였다 2 단계 관류 법에 기초한다. 방법은 Smedsrød 동부 등에 의해 개발 된 기존의 프로토콜에서 변성시켰다. 16 래트 간세포 분리 설계된. 대부분의 연구는보고 된 쥐의 간에서 쿠퍼 세포의 분리를 설명. 여기서, 우리는 높은 수율 및 순도, 마우스 간에서 쿠퍼 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 마우스의 사용은 실험 비용을 감소시키고, 간 몇몇의 처리는 나노 입자에 대한 독성 시험 쿠퍼 세포 다량 수득 할 수있다.
다음의 프로토콜에서, 쿠퍼 세포 (F 기능화 된 탄소 나노 튜브와 함께 배양 하였다 즉. 그러나, 문제는 탄소 나노 튜브 (19)의 독성 및 시험 관내 시험에서의 새로운 개발 CNT 생물학적 효과의 이해를 증가시키는 것을 목적 관한 제기되었다. 쿠퍼 세포 독성은 세포막의 구조적 무결성의 부족과 관련된다. 이것은 상등액으로 세포로부터 세포질 효소 LDH의 손실에 의해 측정된다. 이 방법의 원리에 따라서, 어떤 공개 LDH를 제거하고, 세포 (20)에 남아 있는지를 측정하는 것이다. 상등액 중 탄소 나노 튜브의 존재는 21 분석법을 방해하기 때문 상청 LDH 방출의 측정에 우선하여 수행된다.
우리는이 간단하고 비용 효과적인 쿠퍼 세포 분리 운전 방식의 사용을 제안D는 기능 쿠퍼 세포의 높은 숫자를 분리합니다. 이는 관련 차 대식 세포 모델에서, 나노 입자의 범위의 독성 검사를 할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 처형되었다. 이 프로토콜은 영국 홈 오피스 규제의지도 및 승인하에 수행되었다 설명하는
1. 관류 및 셀 컬렉션 (그림 1)
그림 1. 간 관류 마우스의 마취 후 소화관 측방 접근 간문맥 (PV)를 확인하기 위해 복부의 왼쪽으로 이동된다. PV 즉시 간 내의 과도한 압력을 피하기 위해 파열 EGTA / HBSS 용액의 느린 유속 (1-3 ml / 분) 및 열등한 veina 정맥 (IVC)은 캐 뉼러를 사용한다. 관류 제 분내, 유속은 점차 / 분 7 ml의 증가된다. 그것의 완전 분해가 달성 될 때까지 콜라게나 제 용액을 10 ㎖ / 분으로 관류된다.
- 처리장갓 재료 테이블에 설명 된 모든 시약을 다시.
- EGTA (에틸렌 글리콜 테트라 아세트산) / HBSS (행크 균형 염 용액) 용액 (마우스 당 50 mL) 및 40 ° C에서 30 분 동안 콜라게나 제 용액 (마우스 당 100 ㎖)를 따뜻하게.
- 처음 70 % 에탄올로 펌프 유연한 튜브를 씻어. 수조에 담가 원심 분리기 튜브에 EGTA / HBSS 용액 40 ml에 붓고 미리 예열 EGTA / HBSS 용액으로 펌프 유연한 튜브를 씻어.
- 안정적으로 호흡 억제 및 사망하기 전에 무의식을 생산하는 바르비 투르 산염을 사용하여 단말기 마취를 수행합니다. 여성 또는 남성 CD1 마우스 (35-45g)로 1 ㎎ / ㎏, IP에 phenobarbitone을 주입한다. 발가락 집어 마취를 확인합니다.
- 복부의 털을 면도하고 70 % 에탄올 용액을 사용하여 복부 표면 살균.
- 복강을 통해 잘라 복부의 왼쪽 옆으로 장을 이동하여 포털 정맥과 하대 정맥을 노출.
- 별t EGTA / HBSS 용액을 1-3 ml / 분의 속도로 펌프와 23g의 버터 플라이 니들을 이용하여 문맥을 cannulate (날개 절단). 23 G 바늘 유관 포털 정맥의 부분을 클램프하고 열린 마우스 복부의 표면에서 serrefine의 집게를 뒤집습니다. 간은 빨리 EGTA / HBSS 용액 관류의 첫 번째 30 초 이내에 창백합니다.
- 급속 간 과잉 압력을 피하기 위해 건물 대정맥의 하부 부분을 절개 한 다음 제 관류 분 이상, 7 ㎖ / 분으로 서서히 유량을 증가시킨다. 동물에 의한 대정맥 정맥 천자를 베나하는 이차 출혈로 죽는다.
- EGTA / HBSS 용액 미만 5 ml의 원심 분리 튜브에 남아있는 경우, 콜라게나 제 용액 (40-50 ml)로 그것을 채울. 30 초 이상, 10 ml / 분으로 점진적으로 유량을 증가시킨다.
- 50-10 초 간격 들어 핀셋을 사용하여, 하대 정맥에 압력을인가함으로써 간 팽윤 만들기. 티들 (소화하는 동안 5 ~ 10 회) 정기적으로 수행 할 수 있습니다. 이 단계는 간세포 해리를 향상 콜라게나 재관류 시간을 단축한다.
- 콜라게나 제 용액의 10 ml를 원심 분리 튜브 내에서 유지하는 경우, 원심 분리 튜브에 미리 가온 된 콜라게나 제 용액의 40-50 mL로 붓는다.
- 관류 10-15 분, 콜라게나 제 관류 용액의 약 70 내지 80 ml의 후 집게로 간 표면에 작은 압력을 적용한다. 압력의 인쇄는 간 세포가 해리되어 있음을 나타냅니다.
- 하나의 조각으로 복강에서 간을 제거하고 쿠퍼 세포 격리 중간의 20 ~ 30 ml의를 포함하는 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 간 세포 생존율에 영향을 피하기 위해 3 시간의 최대 시간 동안 얼음 상 또는 4 ℃에서 간 세포를 유지.
- 얼음에 관류 간을 유지하면서, 필요한 경우 여러 동물 관류 절차를 반복합니다. 풀 정제를위한 세 가지 간 하나와 3 단계를 진행합니다.
원심 분리의 밀도 구배 2. 준비 (그림 2)
그림 2 :. 밀도 구배의 준비는 모든 절차는 무균 상태에서 수행된다. SIP는 10 X 1.7 ml의 PBS로 코팅 된 실리카 입자 용액 15.3 ml를 혼합하여 제조된다. SIP의 5 ml를 20 ml의 25 %의 SIP 용액을 만들기 위해 PBS 15 ㎖로 혼합 하였다. SIP 10 ㎖를 20 ㎖의 50 %의 SIP 용액을 만들기 위해 PBS 10 mL로 혼합한다. SIP 50 % 용액 (20 ㎖) 및 기울어 SIP 25 % 용액 (20 ㎖)를 함유하는 원심 분리 관 천천히 혈청 25 ㎖ 피펫을 이용하여 첨가한다.
- 멸균 상태에서 다음 단계 (제 2, 3 및 5)을 진행하고 C 얼음 또는 4 °에서 세포를 유지합니다. (10)의 1.7 mL의 X PBS로 코팅 된 실리카 입자 용액 15.3 mL를 혼합함으로써 SIP (등장 성 코팅 된 실리카 입자 용액)을 준비한다. 25 %의 SIP 용액 20 ㎖을 PBS 15 ㎖로 SIP 5 mL를 혼합한다. PBS 10 mL로 SIP 10 ㎖를 혼합하여, 50 %의 SIP 용액 20 mL로한다.
- SIP 50 % 용액 20 ㎖로 한 원심 관을 채운다. 90 °에 가까운 각도로 원심 관을 기울여 50 % SIP 층의 표면을 터치하지 않고, 25 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 튜브의 측벽에 천천히 25 % SIP 용액 (20 ml)에 추가한다. SIP 25 % 용액을 첨가 할 때 점진적으로 튜브의 각을 감소시킨다. 얼음에 사용할 때까지 밀도 구배를 유지합니다.
3. 쿠퍼 세포 정제 (그림 3)
도 3 :. 밀도 구배 원심 분리 및 세포 유착에 의해 쿠퍼 세포의 정제 모든 절차는 멸균 조건 하에서 수행된다. (A) Glisson의 캡슐의 파열 후에, 간세포는 (1)를 통해 여과되고00 μm의 여과기입니다. 간세포 현탁액을 (펠릿)을 무시하고 비 실질 세포 분획 (상청액)을 수집 × 50 g에서 원심 분리된다. 이 단계는 3 회 반복된다. 비 실질 세포 등장액 불연속 구배의 상부에 첨가하고, 15 분 동안 800 XG에서 원심 분리된다. 25 % SIP 쿠션 수집 쿠퍼 세포는 세포 접착 선택에 의해 추가로 정제된다. (B) 세포를 24- 웰 플레이트에 도금 30 분 동안 CO 2, 37 ° C에서 배양 5 %이다. 비 - 부착 세포는 500 μL HBSS로 한번 세척 하였다. 쿠퍼 세포 F -CNTs가 세포에 첨가 할 수있는 도금 후에도 접착 형태 4 시간을 표시. 스케일 바는 25 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 쿠퍼 세포 격리 중간의 15 mL를 페트리 접시에 하나의 관류 간을 넣습니다. (Glisson의 캡슐을 파열간 막) 가위를 사용 쿠퍼 세포 분리 배지에 모든 간세포를 분리. 100 ㎛ 세포 스트레이너는 원심 분리 튜브에 수집 될지라도 용액 필터. 추가 관류 간에서 관류 절차를 반복하고 (세 쥐에서 45 ml의 최대 하나의 마우스에서 15 ml의) 같은 원심 분리기 튜브에 세포를 풀.
- 4 ℃에서 2 분 동안 50 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 펠릿과 (쿠퍼 세포를 포함) 비 실질 세포 상층 액에있을 것입니다에 실질 세포 (간세포)입니다.
- 2 분 각 50 XG에 깨끗한 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 수집합니다. 이 단계를 세 번 이상 반복합니다.
- 15 분 동안 1,350 XG에 원심 분리기가 아닌 실질 세포 펠렛합니다. 뜨는을 취소하고 쿠퍼 세포 격리 중간 10ml에 펠렛을 재현 탁.
- 2.3에 기술 된 바와 같이 불연속 구배에 등장 50분의 25 %의 비 실질 세포 용액을 첨가. 센트가속 또는 휴식없이 15 분 동안 850 XG에 rifuge.
- 50분의 25 %의 SIP 인터페이스에 가까운 25 % SIP 분획 (도 3) 내에 나타나는 혼탁 농후 쿠퍼 세포 분획 지역화. 10 ㎖의 혈청 학적 피펫, 기음 풍부한 쿠퍼 세포 분획의 약 12 ml의 사용. 쿠퍼 세포 격리 중간의 35-40 ml를 함유하는 원심 분리 관에 넣고 세포. 세포 펠렛 4 ℃에서 15 분 동안 1,350 XG에 부드럽게 원심 분리기 섞는다.
- 미리 예열 쿠퍼 세포 배양 매체의 5 ~ 10 ㎖에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기하십시오. 세포 (혈구)를 카운트하고 트리 판 블루 염색을 사용하여 생존 능력을 측정한다.
- / 웰의 5 X 105 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에서 정제 된 비 실질 세포 접시. 37 ℃, 5 % CO 2 (그림 3)에서 세포를 품어. 30 분 후, 부드럽게 세척, 매체를 제거 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 한 번 교체를 미리 예열신선하고 미리 예열 쿠퍼 세포 배양 매체의 500 μL와 그것 (물론 당).
- 그들의 부착 된 형태를 획득 할 수 있도록, 나노 입자로 처리하기 전에 37 ℃에서 적어도 4 시간과 5 % CO 2 쿠퍼 세포를 남겨.
4. 특성화
- 쿠퍼 세포의 순도
- 쿠퍼 세포 생존을 유지하는 데 사용되는 신선한 PBS / BSA 용액을 준비한다. PBS / BSA 용액 500 μL로 한 번 세포를 씻으십시오. PBS / BSA 솔루션을 제거하고 부드러운 스크래핑을 사용하여 신선한 PBS / BSA 용액 500 μL에 쿠퍼 세포를 분리. 세포를 24 웰 플레이트에 도금하는 경우, 계속하려면 분리를 쉽게하기 위해 가위 스크레이퍼 블레이드의 사지를 줄이십시오. 튜브 유동 세포 계측법에 세포를 전송합니다.
- 혈구 원심 1,350 x g에서 1 × 105 세포를 사용 쿠퍼 세포 카운트. (깔끔한) F4 / 80 항체의 30 μL에 재현 탁 쿠퍼 세포. 잘 혼합 3 상온에서 부화0 분. 얼음에 흠 세포 (항체로 배양되지 않음)를 유지합니다.
- 5 분 1,350g에서 염색 된 세포에서 원심 분리기를 PBS / BSA 용액 2 ㎖를 추가하고 결과 상층 액을 버린다. PBS / BSA 200 μL에 염색 된 세포를 재현 탁.
- 유동 세포 계측법 분석의 경우, 게이트 10,000 크기 (정 분산) 및 입도 (측면 분산)에 따라 쿠퍼 세포를 염색. FL-1 채널 게이트 세포의 형광을 분석 할 수 있습니다.
- 흠 쿠퍼 세포의 유동 세포 계측법 분석에 사용 된 것과 동일한 설정을 유지하는 염색 쿠퍼 세포에 대해 절차를 반복한다. 선택 및 쿠퍼 세포의 순도를 평가하기 위해 염색 된 세포의 형광을 정량.
- 쿠퍼 세포 식세포 활동
- 0.5 %로 용지를 교체 (v / v)의 쿠퍼 세포 배양 배지에서 형광 구슬은 37 ℃에서 4 시간 동안 품어 5 % CO 2.
- 1350 XG, 다이에 비 내재화 비드, 원심 쿠퍼 세포를 제거하기 위해서500 μL PBS / BSA 용액에 뜨는에 resuspend 세포를 scard. 이 단계를 2 번 더 반복합니다.
- 튜브 세포 계측법 흐름으로 PBS / BSA 솔루션 및 전송 세포 500 μL에 스크랩 쿠퍼 세포.
- 원심 분리기 쿠퍼 세포는 1,350 XG에서, PBS / BSA 용액 200 μL에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기합니다.
- 유동 세포 계측법 분석의 경우, 게이트 10,000 크기 (정 분산) 및 입도 (측면 분산)에 따라 쿠퍼 세포를 염색. FL-2 채널 게이트 세포의 형광을 분석 할 수 있습니다.
(-CNTs F) 화학적으로 처리 된 탄소 나노 튜브의 5 배양
- 사용하기 전에 15 분 동안 초음파로 물에 F -CNTs (1 ㎎ / ㎖)의 분산을 준비합니다. F -CNTs 사내 (22) 준비가되어 있습니다.
- 배 농축 F-탄소 나노 튜브를 준비합니다 쿠퍼 세포 배양 배지에 분산. 대한 매질에 분산 초음파 처리 F-탄소 나노 튜브2 분) 단계 5.3를 진행하기 전에.
- 각 웰의 경우, 2 배 F -CNTs 분산의 250 μL와 함께 오래 된 매체의 250 μl를 교체합니다. 처리되지 않은 웰 (신선한 쿠퍼 세포 배양액의 조정 배지 + 250 μL의 250 μL) 및 10 % DMSO로 처리 웰 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용된다.
- 24 또는 72 시간 동안 CO 2, 37 ° C에서 쿠퍼 세포를 인큐베이션하고, 5 %.
수정 된 젖산 탈수소 효소 (LDH) 분석에 의한 쿠퍼 세포의 F -CNTs 6. 독성 평가
- 상층 액을 버린다.
- 용해 버퍼의 (24 웰 플레이트의 웰 당) 200 μl를 추가하고 30 분 - 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 10 분 세포 및 세포 파편에 의해 흡수 된 F -CNTs 펠렛 대한 격렬한 피펫 팅을 수행 한 후, 40,000 XG에서 마이크로 원심 튜브 원심 분리기로 쿠퍼 세포를 용해 모은다.
- 상층 액 (ƒ-CNT 무료)에 수집마이크로 원심 튜브 및 -20 ° C에서 저장 또는)은 6.5 단계로 진행합니다.
- 96- 웰 플레이트에 넣고 50 μL와 각 웰에 기질 혼합 용액 (LDH 키트)의 동일 부피를 추가한다. 플레이트를 덮고 정지 용액 (LDH 키트) 50 μl를 첨가하기 전에 15 분 동안 실온에서 배양한다. 용해 버퍼의 50 μL, 기판의 혼합 용액 50 μL 및 정지 용액 50 μl를 포함하는 빈 우물의 삼중를 추가합니다.
- 마이크로 플레이트 리더에서 490 nm에서 흡광도를 읽고 (%) 세포 생존율을 계산하려면 다음 수식을 사용합니다.
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Representative Results
비 정제 실질 세포의 수와 일치 하였다 (절연 부 (17)를 실시했다) 마우스 당 6 10 8 내지 14 X 세포였다. 각 마우스 격리는 16-28 우물을 판에 충분했다. 트립 판 블루 염색법에 의해 세포 생존율은 세포 생존 ~ 95 %를 보였다. 쿠퍼 세포들은 불완전한 접착 형태 (도 4a)과 관련된, 37 ° C에서 배양 한 후 30 분 이내에 둥근 형상을 나타내었다. 4 시간 배양과 이후에, 세포는 확산 및 세포 클러스터 형성하기 시작했다.
쿠퍼 세포는 그들의 순도 식세포 활성을 확인하는 것을 특징으로 하였다. 세포 쿠퍼 세포 순도를 입증하기 F4 / 80 항체로 염색 하였다. 유동 세포 계측법 분석은 95 % (그림 4B) 이상 쿠퍼 세포의 순도를 보여 주었다. 세포는 큰 입자를 수행 할 수있는 능력을 확인하기 위해 1 μm의 형광 구슬, 도금 후 12 시간으로 배양 하였다. 그쪽으로 보여 주었다 분석 유동 세포 계측법T 쿠퍼 세포의 85 % 이상이 1 ㎛ 구슬 (그림 4C)를 취할 수 즉, 식세포이다. 배양 72 시간 후, 쿠퍼 세포의 40 %는 쿠퍼 세포가 부분적으로 자신의 탐식 활성을 잃은 것을 나타내는 식균했다.
24, 72 시간 동안 F -CNTs 배양 쿠퍼 세포의 현미경 영상은 순진 세포 (그림 5A)에 비해 유사한 세포 형태를 한 것으로 밝혀졌습니다. 10 % DMSO (양성 대조군)와 함께 배양 쿠퍼 세포 괴사 형태 (도 5a)를 표시. 변성 LDH 분석의 분석 후, 쿠퍼 세포 24 10 % DMSO (양성 대조군)으로 처리하고 72 시간이 높은 독성 (도 5B)를 보였다. 비교에서, F는 세포 -CNTs 72 시간 (도 5B), 50 μg의 / ㎖에서 노출 된 경우에만 세포 생존에 약간이지만 상당한 감소를 유도.
도 4 : 쿠퍼 세포의 순도와 통풍 능력 (A), 30 분 또는 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 24 시간 후 도금 쿠퍼 세포의 현미경 이미지.. 스케일 바는 50 μm의를 제공합니다. (B) 쿠퍼 세포의 유동 세포 계측법 분석은 FSC / SSC 셀 게이팅 다음 행했다. 쿠퍼 세포의 순도는 F4 / 80 항체 염색을 이용하여 측정하고, 95 % 이상으로 보여 주었다. (C) 쿠퍼 세포들은 탐식 활성을 평가하기 위해 1 ㎛ 형광 비드의 존재하에 4 시간 동안 배양 하였다. 쿠퍼의 기능적 특성은 갓 삼일 후 테스트 세포에 비해 (12 시간 도금 후) 고립 된 세포에서 더 잘 유지되었다.
그림 5 : 통풍 관과의 독성 <쿠퍼 세포에서 EM> F- 탄소 나노 튜브. (A) 쿠퍼 세포의 현미경 이미지. 이미지 (24)와 72 시간 동안 37 ° C에서 F -CNTs 10 % DMSO, 50 ㎍ / ml의 쿠퍼 세포를 나타낸다. 스케일 바는 50 μm의를 제공합니다. (B) 수정 된 LDH 분석. 낮은 세포 생존율은 F -CNTs 크게 만 72 시간 동안를 50㎍ / ㎖로 한 후 엑스포 세포 생존율에 영향 동안 10 % DMSO 처리 된 세포 (포지티브 컨트롤)에서 관찰되었다. * P <Tukey에 시험으로 사후 분석으로 분산 (일방 ANOVA)을 이용하여 분석 나이브 조건 (10 % DMSO 상태를 제외)에 대하여 0.05. 스케일 바는 50 μm의에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다음 단계는 높은 수율 및 쿠퍼 세포의 높은 가능성을 달성하기 위해 중요하다. 무균 조건은 세균 및 진균의 오염의 위험을 제한하기 위해 사용되어야한다. 모든 장비는 사용하기 전에 소독해야합니다. 시약 갓 분리 절차를 수행하기 전에 준비를해야합니다.
콜라게나 제 IV의 선택은 낮은 트립신 활성, 결정적이다. 동일한 공급자로부터 다른 많은 다른 효소 활성을 가지고 있고 이들은 쿠퍼 세포 분리를위한 가장 적절한 배치를 선택하는 초기 비교 될 필요가있다. 이것은 세포 수율 및 세포 생존 능력을 평가하여 판단 할 수있다. 또한 유사한 응용 프로그램에 사용 된 배치를 제공하기 위해 공급 업체에 문의하는 것이 좋습니다. 일단, 사용 나중에 사용할 수 있도록 예약 할 수있는 배치에 결정했다.
삽관 절차는 훈련이 필요합니다. 포털 정맥과 자신감 여러 동물의 사용 계획삽관 절차. 연습 성공적인 삽관 쉽게 달성 될 것이고 절차는 하나의 사용자에 의해 처리 될 수있다. 무거운 동물의 사용이 문맥의 직경을 증가시키고, 따라서 절차를 용이합니다. 문맥의 뒷벽이 천공 될 때,이 절차 새로운 특히 다시 정맥에 액세스하는 것은 기술적으로 어렵고, 따라서, 새로운 동물로 시작하는 것이 바람직하다.
HBSS 및 콜라게나 솔루션은 pH가 7.4로 조정하고 37 ℃에서의 연동 펌프로부터 출력 온도를 달성하기 위하여 40 ℃에서 예열되어야 있어야한다. EGTA / HBSS 용액으로 관류 (칼슘과 마그네슘은 2 + 무료)를 포함 EGTA는 세포 - 세포 상호 작용을 약화, 칼슘 의존성 부착 분자라는 desmosome의 중단이 필요하다. 콜라게나 제 IV 형은 세포 외 기질로부터 간세포를 분리 등간에 유도하는 데 사용되는세포 해리. 이 솔루션에 대한 관류 시간은 CD1 마우스 있지만, 이러한 C57BL / 6와 같은 다른 균주, 15 분을 초과 약간 더 간 소화 시간을 필요가 없습니다.
성공적인 분리를 달성하기 위해서는 높은 수율과 세포 생존 능력을 얻을 필요가있다. 실험자 간 세포 분리에 경험이없는 경우, 트리 판 블루 배제 분석에 의해 세포를 50 XG에서 처음 3 회 원심에서 간세포의 알약을 결합하여 계산하는 것이 좋습니다. 간세포 수율은> 20 × 10 6 세포와 간세포 생존> 50 %이어야한다. 낮은 금리는 쿠퍼 세포 수율을 낮추는 간접적으로 최고의 가난한 세포 분리에서 본질적으로 결과. 그것은 간 제대로 관류 단계의 끝에서 분해되어 있음을 확인해야한다. 적합한 간세포 수율이 낮은 생존 간세포와 조합하여 실현 될 때, 이는 지나친 콜라게나 제 분해에 기인 할 가능성이 있지만, 부적절한 간하여 설명관류 절차 나 오염 시약 / 물질의 용도.
도금 후, 쿠퍼 세포는 민감하고 부드럽게 세척해야한다. 최소한 4 시간이 자신의 부착 형태를 취득 쿠퍼 세포가 필요하다. 쿠퍼 세포 도금 후 일일 식세포 내에서 최대 활성을 나타내는 바와 같이 처리는 일반적으로, 도금 후 4-24 시간을 행한다.
우리의 프로토콜에서는 접착하여 밀도 구배 원심 분리 및 선택에 의한 쿠퍼 세포의 정제 하였다 CD1 마우스 간 세포의 분리를 설명한다. 쿠퍼 세포의 특성은 유세포, 쿠퍼 세포의 높은 수율 및 순도가이 방법을 이용하여 달성 할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이 쿠퍼 세포 분리 방법은 복잡성과 세포 수율 사이의 가치있는 타협을 나타냅니다. 그러나, 특정 쿠퍼 세포가 이러한 방법에 의해 기술 된 프로토콜로, 수행 될 수 있음을 쉽게보고우 등., 간 생체 (23) 소화한다. 그러나, 우 동부 등에 의해 기재된 방법. 세포의 제한된 양의 낮은 세포 순도로 연결. 높은 수율 및 순도를 얻을 수 있지만, 필요 비용 및 / 또는 정교한 장비와 시간이 소요될 수 있습니다 할 수 있습니다.
Smedsrød 외. (16)에 의해 개발 된 기존 프로토콜 퍼콜 구배 및 표면 점착에 의해 추가의 정제를위한 낮은 퍼콜 쿠션의 선택에 대한 원심 분리 2 단계 관류 법 (HBSS + 콜라게나 제 소화)에 기초한 유사한 프로토콜을 사용했다. 원심 분리 과정을 수정하고 상부 퍼콜 쿠션를 수집하여, 우리는 간 g 당 8.2 × 106 세포를 5.25 × 106 (6)로부터 농축 된 쿠퍼 세포 분획을 증가시켰다. 이러한 개선은 간 세포의 분리를 용이하게하기 위해 초기 단계 동안 관류 EGTA의 사용에 기인 할 수있다. Moreover, 유세포 분석의 사용은 쿠퍼 세포 순도 및 탐식 활성의 신뢰성을 정량적으로 특성화시켰다. 마우스 간 당 14 × 10 6 정제 비 실질 세포의 최대 수율. 본 분리 방법은 문헌 24에보고 된 것과 마우스 간 당 쿠퍼 세포의 더 많은 양을 달성한다. 이러한 개선은 다른 방법에 비해 무거운 24 마우스 (35-45g)의 사용에 의해 설명 될 수있다. 세포의 수율이 증가 게다가, 큰 동물의 사용은 현저하게 문맥 삽관의 절차를 용이하게한다.
시험 관내 시험에서 높은 처리량 따라서 나노 입자의 생체 내 독성 효과를 모방이 기본 모델 식세포를 사용하여 수행 될 수있다. 나노 독성학의 전반적인 이해는 임상 번역을위한 나노 입자의 선택이 더 효율적, 같은 모델의 혜택을 누릴 수 있습니다. 또한, 라인에 인동물 생물 의학 연구에 3 R (감소, 정제 및 교체)의 개념을 구현.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | - | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. |
References
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