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Medicine

胃食管反流与小鼠手术模型

doi: 10.3791/53012 Published: August 25, 2015

Protocol

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所有的动物实验已批准的机构动物护理和使用委员会。

1.鼠标准备

  1. 过使用小鼠约20克体重或以上〜6周龄进行手术。
  2. 手术前,给小鼠实验室饲料自由采食和饮水,并在12:12小时的明暗周期维护。
  3. 剃了头发剪手术区。通过腹膜内注射80毫克/千克氯胺酮和12毫克/千克甲苯噻嗪麻醉的小鼠。该剂量使小鼠进入睡眠在几分钟后,并提供足够的麻醉以下手术程序。
  4. 确认基于无角膜反射和肢体回缩适当的麻醉,当脚垫被挤压。应用润滑油眼药膏的眼睛,以防止干燥。
  5. 皮肤消毒用聚维酮碘溶液。

2.胃反流模型(图1B)

  1. 使上的〜2厘米从剑突指向肛门起始中线切口。
  2. 通过中线打开腹腔。删除剑突,提升曝光剪刀。
  3. 分开和割肝和胃之间的结缔组织。结扎和切断脾和眼底的血管束,以完全自由了眼底。
  4. 转动眼底稍微向左和胃食管接头的左侧露出在该领域。使上沿采用一对锋利的剪刀,露出上皮食管远端肌肉5mm的纵形切口。
  5. 切割沿相同的方向(切口1, 图1B)打开上皮。使三切口上forestomach(切口2,3和4, 图1B),以切断大部分forestomach与尖锐操作剪刀。如果胃不空,小心地取出胃内容物。
  6. 将8-0普理灵苏图重(带锥形尖的针)通过一个点(在食管)和点A'(在forestomach)准确粘膜粘膜反对。同样的地方缝合线通过点B和点B',以及其他对点,分别为。均匀空间这些缝线3-4毫米彼此。
  7. 用生理盐水冲洗腹腔,清理血液和胃内容物。关闭腹壁丝线缝合并用金属夹皮。

3.混合反流模型(图1C)

  1. 按照步骤2.1至2.4,露出胃食管交界处。
  2. 轻轻分开食道的背侧从食道后面的血管。通过食管和血管之间的小棉签。
    注意:棉可能从尖被部分地去除,以减少其尺寸。此棉尖端有两个目的,举起食道和保护血管。
  3. 做两个5毫米纵向INC过程中反冲每个上胃食管接头和十二指肠相邻尖锐操作剪刀幽门近端。对十二指肠的切口,避免血管和放置在反肠系膜边界。
  4. 吻合准确粘膜切口粘膜间断8-0普理灵缝线反对。一般放置3-4缝线上背侧和2-3缝线上的前侧。
  5. 取出棉签。冲洗腹腔用生理盐水并关闭腹壁和皮肤。

4.十二指肠反流模型(图1D)

  1. 按照步骤3.1到3.4,以生成混合回流。
  2. 小心地抬起肚子,露出它的背面。肝脏的叶可被捕获的肝和胃的背面之间结缔组织。小心切割结缔组织,妥善保护肝脏,并露出血管的食道的背侧。
  3. 结扎和切割血管。结扎并切断食道在胃食管接头。
  4. 结扎十二指肠的幽门。结扎并切断肠系膜。删除整个胃。
  5. 用生理盐水冲洗腹腔。关闭腹壁和皮肤。

5.手术后治疗

  1. 手术后保持体温有一个加热垫。只有恢复胸骨斜卧后,将小鼠背部与其他动物。
  2. 给予抗生素和止痛药,以预防感染,减轻疼痛。注入拜有利(10毫克/ kg,腹腔,连用 ,3天),以防止感染,而丁丙诺啡盐酸盐作为止痛药(0.05毫克/公斤,SC,出价。两天)。手术后禁食是没有必要的。
    液体或软食,可给予。
  3. 评估日常basis.If的小鼠表现出下列迹象的一般健康状况(戏剧性的体重减轻> 15%,缺乏应用的etite,发声,从口,鼻或眼睛,弯腰驼背的姿态,不活动,不正常的疏导活动)排出,安​​乐死小鼠。

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Representative Results

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大多数小鼠(> 95%)可以存活手术。在围手术期,导致死亡的原因包括过量麻醉药,出血及原因不明。

四周手术后,> 90%的小鼠胃返流或混合反流和> 80%的小鼠十二指肠反流可以生存。在此期间,主要小鼠死于食管狭窄和无法吃。这些小鼠表现出严重的压力(驼背的姿势,不活动,呕吐,眼睛凹陷,发声 )的迹象,需要进行安乐死。用抗生素及输液药物治疗通常不能从垂死保存这些老鼠。小鼠通常由几个克失去手术后的体重,特别是那些与十二指肠回流。不过体重就会恢复,增加以后。

手术后四十周,> 80%的小鼠胃和混合回流和> 70%的小鼠十二指肠反流可以生存。 DUR荷兰国际集团这期间,一些老鼠可能死于营养不良或原因不明。我们已经在手术后保持小鼠80周。在一般情况下,他们仍然相当活跃和健康的9。

在手术后4周,食管上皮的结构将被损坏或多或少由回流。镜下上皮变厚和乳头拉长。上皮细胞和炎症细胞如,嗜中性粒细胞,肥大细胞和嗜酸性粒细胞)的浸润的过度增殖是食道炎的明显迹象( 图2)。在食管上皮细胞如IL1β,IL6和IL8)细胞因子尤其是十二指肠反流11的存在提高。透射电镜下,扩张的细胞间隙反映的上皮屏障功能12的损害。功能方式,反式 - 皮电阻被显着地降低,特别是在duoden的存在下人回流。

图1
图1:(A)在小鼠中(前视图和侧视图)的上消化道解剖; (B)的胃回流(侧视图); (C)的混合回流(正视图); (D)的十二指肠回流(正视图)。

图2
图2:小鼠食管上皮组织学无反流(A),或胃反流(B),混合反流(C),十二指肠反流(D)。比例尺= 50微米。

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Discussion

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各种手术模型已经建立了模拟胃,十二指肠和混合回流的啮齿动物。这里介绍这三种方法都适用于术后生存的合理的价格长期的实验。与手术经验的一位研究人员应该能够练习后短期内掌握的技术。

出血可能源于腹膜内注射麻醉剂的手术,肝和胃,和血管无意损害之间的结缔组织的分离期间肝脏裂伤之前。应该避免这种情况尽可能。电池操作的微型烧灼可被用于停止,如果适当的出血。过度拉伸应避免尽可能时器官和组织被操纵。镊子的尖端可以与棉包裹,或棉花提示可以像使用筷子替代镊子。鼠标食管有两层或两个“管“,外微红”肌管“和内心的白色”上皮管“。当一个切口是在食道,两个层需要被切开。缝合线应均匀分布的准确粘膜粘膜反对。泄漏,可能会导致从缝线之间的距离宽,而狭窄可能发展由于缝线之间的窄距离。然而,狭窄可能阻止食物的通道,并导致术后死亡,而轻微泄漏可以固定由本地粘附和纤维化反应,因此,通常不危及生命。

有几个对协议中严格遵循的一般原则。手术的持续时间应尽可能(约20-30在实验室分钟)被缩短。手术前后禁食是不必要的。事实上,长期空腹(> 1天)可能是有害的。最好由一位外科医生进行手术。一个助理可以帮助麻醉小鼠和供应外科iCal的材料。显微镜是没有必要的,除非医生已适当培训显微外科。否则手术的持续时间趋于长于必要,因此术后存活可能是潜在的恶化。

这些程序已被用于在以前的出版物和已生成满意的结果。用野生型和转基因小鼠中,我们表明,在胃食管反流11,12和NFκB的Nrf2途径调节的食管上皮的屏障功能。然而,我们不能产生完全成熟的Barrett食管腺癌或在这些小鼠中,相反,分散的粘液细胞和鳞状细胞癌诱导9。小鼠食管和食管的人之间的组织学差异可能对Barrett食管和食管腺癌这些手术模型研究的固有限制。

我们相信,这些苏rgical模型是对胃食管反流病的研究很有用。基因和分子通路的功能可以阐明了解GERD的分子机制和开发机制为基础的治疗。当用于生产巴雷特食管和食管腺癌,遗传修饰,将需要在有回流手术组合。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #1 Forceps Dumostar Tip  Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Clip Applying Forceps 5.5" Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Halsey Needle Holder 5" Smooth Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)
PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 Ethicon US, LLC
Ringer's solution Henry Schein, Inc.
ketamine Henry Schein, Inc.
xylazine Henry Schein, Inc.

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References

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He, J., Fang, Y., Chen, X. Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice. J. Vis. Exp. (102), e53012, doi:10.3791/53012 (2015).More

He, J., Fang, Y., Chen, X. Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice. J. Vis. Exp. (102), e53012, doi:10.3791/53012 (2015).

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