Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.
1. إعداد ماوس
- استخدام الفئران أكثر ~ 20 غرام في وزن الجسم أو أعلى ~ 6 أسابيع في سن لإجراء عملية جراحية.
- قبل الجراحة، وإعطاء الفئران مختبر طعام والمياه الإعلانية بالمال وبالشهرة أيضا والحفاظ على دورة ضوء الظلام 0:12 ساعة.
- حلق المنطقة الجراحية مع المقص الشعر. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 80 ملغم / كغم من الكيتامين و 12 ملغ / كغ زيلازين. هذه الجرعة يضع الفئران إلى النوم في بضع دقائق وتقدم التخدير كافية لإجراء العمليات الجراحية التالية.
- تأكيد التخدير المناسبة استنادا إلى غياب منعكس القرنية والأطراف تراجع عند مقروص قاطع الطريق. تطبيق التشحيم مرهم على العينين لمنع جفاف.
- تعقيم الجلد بمحلول betadine.
2. أمراض المعدة والحموضة الجزر نموذج (الشكل 1B)
- جعل العلويشق خط الوسط من ~ 2 سم بدءا من الخنجري لافتا إلى فتحة الشرج.
- فتح تجويف البطن عن طريق خط الوسط. إزالة الخنجري لتعزيز التعرض مع زوج من مقص.
- فصل وقطع الأنسجة الضامة بين الكبد والمعدة. Ligate وقطع حزمة السفينة بين الطحال وقاع من أجل مجانية تماما عن قاع.
- تحويل قاع قليلا إلى اليسار وفضح الجانب الأيسر من تقاطع المعدي في هذا المجال. جعل 5 مم شق طولي على العضلات على طول المريء البعيدة باستخدام زوج من مقص حاد لفضح ظهارة.
- خفض فتح ظهارة على طول نفس الاتجاه (شق 1، الشكل 1B). جعل ثلاثة شقوق على forestomach (شق 2 و 3 و 4، الشكل 1B) بقطع معظم forestomach مع مقص التشغيل حادة. إذا كانت المعدة ليست فارغة، وإزالة بعناية محتويات المعدة.
- وضع sutu 8-0 البرولينإعادة (مع نقطة تفتق إبرة) من خلال النقطة (أ) (في المريء) والنقطة (أ) '(على forestomach) مع الغشاء المخاطي دقيقة المخاطية المعارضة. وبالمثل الغرز مكان من خلال نقطة ونقطة ب ب "، وغيرها من أزواج من النقاط، على التوالي. الفضاء بالتساوي هذه الغرز 3-4 ملم من بعضها البعض.
- يغسل تجويف البطن بمحلول ملحي طبيعي لتنظيف الدم ومحتويات المعدة. إغلاق جدار البطن مع خيوط الحرير والجلد مع مقاطع معدنية.
3. مختلط الجزر نموذج (الشكل 1C)
- اتبع الخطوات من 2،1-2،4 لفضح تقاطع المعدي.
- فصل بلطف الجانب الظهري من المريء من الأوعية الدموية خلف المريء. تمرير معلومات سرية صغيرة من القطن بين السفن المريء والدم.
ملاحظة: القطن يمكن إزالتها جزئيا من طرف لتقليل حجمها. هذا غيض من القطن يخدم غرضين، رافعين المريء وحماية الأوعية الدموية. - جعل المؤتمر الوطني العراقي اثنين 5 مم الطوليisions كل على مفرق المعدي ونهاية القريبة من الاثني عشر المجاورة لبوابة المعدة مع مقص التشغيل حادة. لشق على الاثني عشر، وتجنب الأوعية الدموية ووضع على الحدود المضادة للالمساريقي.
- يفاغر الشقوق مع الغشاء المخاطي دقيقة المخاطية المعارضة مع توقف 8-0 الغرز البرولين. عادة ما تضع 3-4 الغرز على الجانب الظهري و2-3 الغرز على الجانب الأمامي.
- إزالة غيض من القطن. يغسل تجويف البطن بمحلول ملحي طبيعي وإغلاق جدار البطن والجلد.
4. الاثنى عشر الجزر نموذج (الشكل 1D)
- اتبع الخطوة 3،1-3،4 لتوليد الجزر مختلطة.
- رفع بعناية المعدة لفضح الجانب الخلفي لها. A فص الكبد قد تكون اشتعلت من قبل الأنسجة الضامة بين الكبد والجزء الخلفي من المعدة. قطع بعناية الأنسجة الضامة، صحيح حماية الكبد، وفضح الأوعية الدموية على الجانب الظهري من المريء.
- وLigateقطع الأوعية الدموية. Ligate وقطع المريء عند تقاطع المعدي.
- Ligate الاثني عشر في بوابة المعدة. Ligate وقطع mesenterium. إزالة المعدة كلها.
- يغسل تجويف البطن بمحلول ملحي طبيعي. إغلاق جدار البطن والجلد.
5. علاج ما بعد الجراحة
- بعد جراحة المحافظة على درجة حرارة الجسم مع وسادة التدفئة. إلا بعد استعادة الاستلقاء القصية، وضع الفئران مرة أخرى مع غيرها من الحيوانات.
- إعطاء المضادات الحيوية والمسكنات لمنع العدوى وتخفيف الألم. حقن Baytril (10 ملغ / كغ، والملكية الفكرية، QD، لمدة 3 أيام) لمنع العدوى، وهيدروكلوريد البوبرينورفين (0.05 ملغ / كغ، SC، محاولة. لمدة يومين)، ومسكن للألم. الصيام ليس من الضروري بعد الجراحة.
قد يعطى حمية سائلة أو لينة. - تقييم الحالة الصحية العامة على basis.If يوميا تظهر الفئران العلامات التالية (فقدان الوزن مثيرة> 15٪، وعدم التطبيقetite، النطق، إفرازات من الفم أو الأنف أو العينين، لفتة منحنية والخمول والنشاط الاستمالة غير طبيعي)، الموت ببطء الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معظم الفئران (> 95٪) يمكن البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية. خلال الفترة المحيطة بالجراحة، والأسباب الرئيسية للوفاة وتشمل جرعة زائدة من التخدير، والنزيف، وأسباب غير معروفة.
أربعة أسابيع بعد الجراحة،> 90٪ الفئران مع ارتجاع المعدة أو ارتداد المختلط و> 80٪ الفئران مع الجزر الاثني عشر يمكن البقاء على قيد الحياة. خلال هذه الفترة، والفئران تموت في المقام الأول من تضيق المريء وعدم القدرة على تناول الطعام. تظهر هذه الفئران علامات الإجهاد الشديد (التقوس في الجلوس والخمول، والتقيؤ، والعيون الغارقة، النطق، الخ) وتحتاج إلى أن يتم التخلص. العلاج الطبي مع المضادات الحيوية والحقن عادة لا يمكن حفظ هذه الفئران من الموت. عادة ما يفقد الفئران وزن الجسم من خلال بضعة غرامات بعد الجراحة، وبخاصة مع الجزر الاثني عشر. ومع ذلك وزن الجسم سيتعافى وزيادة في وقت لاحق.
بعد أربعين أسابيع من الجراحة، ويمكن> 80٪ الفئران مع المعدة وارتجاع المختلط و> 70٪ الفئران مع الجزر الاثني عشر البقاء على قيد الحياة. الدرجي هذه الفترة، بعض الفئران قد يموتون من سوء التغذية أو لأسباب غير معروفة. أبقينا الفئران لمدة 80 أسابيع بعد الجراحة. بشكل عام، فإنها لا تزال نشطة جدا وصحي 9.
في أربعة أسابيع بعد الجراحة، وسوف يكون معطوبا بنية ظهارة المريء أكثر أو أقل عن طريق ارتداد. تحت المجهر، وتصبح البشرة أكثر سمكا ويستطيل حليمة. المفرط لخلايا الظهارية وتسلل من الخلايا الالتهابية (على سبيل المثال، العدلات، والخلايا البدينة والحمضات) هي علامات واضحة على المريء (الشكل 2). وارتقى السيتوكينات في ظهارة المريء (على سبيل المثال، IL1β، IL6 وIL8) لا سيما في ظل وجود الجزر الاثني عشر (11). تحت المجهر انتقال الإلكترون، الفضاء بين الخلايا تمدد يعكس ضعف وظيفة حاجز الظهارية 12. وظيفة الحكيمة، المقاومة الكهربائية عبر الظهارية وانخفض بشكل كبير، خصوصا في ظل وجود duodenآل الجزر.
الشكل 1: (A) تشريح الجهاز الهضمي العلوي في الفئران (عرض الجبهة وعرض الجانب)؛ (B) ارتجاع المعدة (عرض الجانب)؛ (C) الجزر مختلط (المشهد الأمامي)؛ (D) الجزر الاثني عشر (المشهد الأمامي).
الشكل 2: الأنسجة من الماوس ظهارة المريء دون ارتداد (A)، أو مع ارتجاع المعدة (B)، ويخلط الجزر (C)، الجزر الاثني عشر (D). = شريط نطاق 50 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وضعت نماذج الجراحية المختلفة لتقليد المعدة، والاثني عشر الجزر مختلطة في القوارض. هذه الإجراءات الثلاثة المذكورة هنا هي مناسبة لتجارب طويلة الأمد مع معدلات معقولة من البقاء على قيد الحياة بعد العملية الجراحية. باحث من ذوي الخبرة الجراحية وينبغي أن تكون قادرة على استيعاب هذه التقنية بعد فترة قصيرة من الممارسة.
النزيف قد تنجم عن حقن داخل الصفاق من التخدير قبل الجراحة، تهتك في الكبد خلال فصل الأنسجة الضامة بين الكبد والمعدة، والأضرار غير مقصود في الأوعية الدموية. وينبغي تجنب هذا بقدر الإمكان. ويمكن استخدام يعمل بواسطة بطارية مصغرة الكي لوقف النزيف إذا كان ذلك مناسبا. الإفراط تمتد يجب تجنبها قدر الإمكان عندما يتم التلاعب الأعضاء والأنسجة. قد تكون ملفوفة على نصائح من ملاقط مع القطن، أو يمكن استخدام النصائح القطن مثل عيدان ليحل محل ملاقط. المريء الفأر لديه طبقتين أو اثنين & #8220؛ أنابيب "، المحمر الخارجي" أنبوب العضلات "والداخلي بيضاء" أنبوب ظهارة ". عندما يتم إجراء شق في المريء، تحتاج كل من طبقات إلى قطع مفتوحة. الغرز ينبغي متباعدة بشكل متساو مع الغشاء المخاطي دقيقة المخاطية المعارضة. تسرب قد تنجم عن مسافة واسعة بين الغرز، في حين قد تتطور تضيق يرجع إلى مسافة ضيقة بين الغرز. ومع ذلك، تضيق قد تمنع مرور الطعام ويسبب الموت بعد العملية الجراحية، في حين تسرب طفيف يجوز أن تحدد التصاق المحلي ورد فعل متليفة، وبالتالي هي عادة ليست مهددة للحياة.
هناك العديد من المبادئ العامة للغاية لاحقة ضمن البروتوكول. يجب تقصير مدة الجراحة إذا أمكن (حوالي 20-30 دقيقة في المختبر). الصيام قبل وبعد الجراحة غير ضرورية. في الواقع، والصوم لفترات طويلة (> 1 اليوم) قد تكون ضارة. ومن الأفضل إجراء جراحة بواسطة جراح واحد. مساعد قد يساعد على تخدير الفئران وتوريد سورغالمواد كال. المجهر ليس ضروريا إلا إذا تم تدريبهم الجراح بشكل صحيح في المجهرية. وإلا فإن مدة الجراحة تميل إلى أن تكون أطول من البقاء على قيد الحياة، وبالتالي من الضروري بعد العملية الجراحية قد تكون محتملة أسوأ.
وقد استخدمت هذه الإجراءات في المنشورات السابقة، وقد ولدت نتائج مرضية. عن طريق النوع البري والفئران المعدلة وراثيا، أثبتنا أن NFκB وNrf2 مسارات ينظم وظيفة حاجز البشرة المريء خلال المعدي الجزر 11،12. ومع ذلك، لم نكن قادرين على إنتاج المريء باريت كاملة أو غدية في هذه الفئران، بدلا من ذلك، متناثرة استميلت خلايا موسينية وسرطان الخلايا الحرشفية 9. قد تكون هناك اختلافات النسيجية بين المريء والمريء الماوس البشري القيود المتأصلة في هذه النماذج الجراحية في البحوث المتعلقة غدية المريء والمريء باريت.
ونعتقد أن هذه سونماذج rgical مفيدة لدراسات حول GERD. وظائف الجينات والمسارات الجزيئية يمكن توضيح لفهم الآليات الجزيئية من GERD وتطوير العلاج القائم على الآلية. عند استخدامها لإنتاج غدية المريء والمريء باريت، وسوف تكون هناك حاجة إلى تعديلات وراثية في تركيبة مع الجراحة الجزر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
