Protocol
모든 동물 실험 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 준비
- 을 통해 마우스를 사용합니다 ~ 체중 20g 또는 수술 연령 6 ~ 위의 주.
- 수술 전, 쥐에게 실험 차우와 물 광고 무제한을 제공하고 12시 12분 시간의 명암주기를 유지한다.
- 머리 깎기와 수술 영역을 면도. 80 밀리그램 / kg 케타민, 12 밀리그램 / kg 자일 라진의 복강 내 주사하여 마우스를 마취. 이 용량은 몇 분 안에 잠에 마우스를두고 다음과 같은 외과 적 치료에 대한 충분한 마취를 제공합니다.
- 발바닥이 끼 때 각막 반사와 사지 수축의 부재에 따라 적절한 마취를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 윤활 적용합니다.
- betadine 용액으로 피부를 소독.
2. 위 역류 모델 (그림 1B)
- 위 확인항문을 가리키는 검상 돌기에서 시작 ~ 2cm의 중간 선 절개.
- 중간 선을 통해 복강을 엽니 다. 가위와 노출을 향상시키기 위해 칼 모양을 제거합니다.
- 별도의 간 및 위장 사이의 결합 조직을 잘라. 결찰 및 주문 안저까지 완전 무료로 비장과 안저의 혈관 번들을 잘라.
- 왼쪽으로 약간 안저를 켜고 분야에서 위식도 접합부의 왼쪽에 노출됩니다. 상피를 노출 예리한 가위를 사용하여 식도 따라 근육에 길이 5mm 절개를.
- 같은 방향 (절개 1, 그림 1B)를 따라 상피를 오픈. (절개 2, 3, 4, 그림 1B) 날카로운 운영 가위 forestomach의 대부분을 차단하기 위해 forestomach에 세 개의 절개를합니다. 위가 비어 있지 않은 경우,주의 깊게 위 내용물을 제거합니다.
- 8-0 prolene의의 수 투어를 배치재 정확한 점막에 지점을 통해 (forestomach에) (식도에) 및 포인트 '(테이퍼 포인트 바늘) 반대 점막합니다. 각각 점 B와 점 B ', 그리고 포인트의 다른 쌍을 통해 마찬가지로 장소 봉합. 균등 공간이 봉합 서로 3-4mm.
- 혈액과 위의 내용을 정리하는 생리 식염수로 복강을 세척 할 것. 실크 봉합사와 복부 벽과 금속 클립으로 피부를 닫습니다.
3. 혼합 환류 모델 (그림 1C)
- 팔로우는 위식도 접합부를 노출 2.4 2.1 단계를 반복합니다.
- 부드럽게 식도 뒤에 혈관에서 식도의 등 쪽을 분리합니다. 식도과 혈관 사이의 작은면 팁을 전달합니다.
주 :면이 부분적으로 그 크기를 줄이기 위해 선단으로부터 제거 될 수있다. 이면 팁 식도를 해제하고 혈관을 보호 두 가지 목적. - 두 5mm 길이 INC 확인위식도 접합부와 날카로운 운영 가위로 유문에 인접한 십이지장의 기단부에 isions 각. 십이지장에 절개를 들어, 혈관을 피하고 항 장간막 테두리에 배치했다.
- 중단 8-0 prolene의 봉합과 반대 점막 정확한 점막에 절개를 문합. 일반적으로 등쪽에 3-4 봉합과 전면에 2-3 봉합을 배치합니다.
- 면 팁을 제거합니다. 생리 식염수와 복강을 세척하고 복벽과 피부를 닫습니다.
4. 십이지장 역류 모델 (그림 1D)
- 혼합 역류를 생성하기 위해 3.4에 3.1 단계를 따르십시오.
- 조심스럽게 뒷면을 노출 위장을 들어 올립니다. 간 로브는 간, 위의 배면 사이의 결합 조직에 의해 잡힐 수있다. 결합 조직을 조심스럽게 잘라 적절히 간을 보호하고, 식도의 등쪽에 혈관을 노출.
- 결찰 및혈관을 절단. 결찰 및 위식도 접합부에서 식도를 잘라.
- 유문에 십이지장을 결찰. 결찰 및 mesenterium를 잘라. 전체 위장을 제거합니다.
- 생리 식염수로 복강을 세척 할 것. 복벽과 피부를 닫습니다.
5. 후 수술 적 치료
- 수술 후 가열 패드와 체온을 유지한다. 만 흉골 드러 누움을 회복 한 후, 다시 다른 동물과 마우스를 놓습니다.
- 감염을 예방하고 통증을 완화하기 위해 항생제와 진통제를 준다. Baytril를 주입 (10 ㎎ / ㎏, IP, QD, 3 일간) 감염을 방지하고, 부 프레 노르 핀 염산염 (0.05 ㎎ / ㎏, SC, 입찰. 이틀 동안) 진통제로. 금식은 수술 후 필요는 없습니다.
액체 또는 부드러운식이 요법을들 수있다. - 마우스는 다음과 같은 징후를 보여 매일 basis.If에 일반 건강 상태 (극적인 체중 감소> 15 %, 응용 프로그램의 부족을 평가etite, 발성, 쥐를 안락사, 입, 코, 눈, 구부리고 제스처, 활동, 비정상적인 정리 활동)에서 배출.
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Representative Results
대부분의 마우스는 (> 95 %)이 수술을 견딜 수. 수술 전후 기간 동안 사망의 주요 원인은 마취제의 과다, 출혈 및 알 수없는 이유를들 수있다.
수술 후 4 주> 십이지장 역류과 위 역류 또는 혼합 역류> 80 % 마우스와 90 %의 마우스는 살아남을 수 있습니다. 이 기간 동안, 마우스는 주로 식도 협착과 먹을 수없는 사망. 이 마우스는 심한 스트레스 (구부리고 자세, 활동, 구토, 침몰 한 눈, 발성 등)의 흔적을 보여 안락사 될 필요가있다. 일반적으로 항생제 투여와 의료 죽어에서이 마우스를 저장할 수 없습니다. 마우스는 일반적으로 수술 후 그램의 부부 십이지장 역류와 특히 자신의 체중을 잃게됩니다. 그럼에도 불구하고 체중은 회복 이후에 증가한다.
마흔 주 수술 후, 십이지장 역류와 위 및 혼합 역류와> 70 % 마우스와> 80 % 마우스는 살아남을 수 있습니다. 지속이 기간을 보내고, 일부 마우스는 영양 실조 또는 알 수없는 이유로 사망 할 수 있습니다. 우리는 수술 후 80주을 위해 마우스를 유지하고있다. 일반적으로, 그들은 여전히 매우 활동적이고 (9) 건강.
수술 후 사주에서 식도 상피의 구조는 역류에 의해 어느 정도 손상됩니다. 현미경 하에서 상피 두꺼워지고 돌기가 뻗어 형성. 상피 세포와 염증 세포 (예를 들면, 호중구, 비만 세포와 호산구)의 침투의 과다 증식 (그림 2) 식도염의 명백한 증거입니다. 식도 상피 (예를 들면, IL1β, IL6 및 IL8)의 사이토 카인, 특히 십이지장 환류 (11)의 존재하에 증가된다. 투과 전자 현미경, 팽창 상피 세포 간 공간은 장벽 (12)의 기능 장애를 반영한다. 기능 - 방식, 트랜스 - 상피 전기 저항은 특히 duoden의 존재하에, 극적으로 감소알 역류.
그림 1 : (A) 마우스 (정면 및 측면보기)에서 상부 소화 기관의 해부학; (B) 위 역류 (측면도) (C)를 혼합 환류 (전면보기) (D) 십이지장 역류 (전면보기).
도 2 : 마우스 식도 상피의 조직학 환류 (A)없이, 또는 위산 역류 (B), 혼합 된 환류 (C), 십이지장 환류 (D)와. 스케일 바는 50 μm의 =.
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Discussion
다양한 수술 모델은 설치류에서 위, 십이지장 및 혼합 역류을 모방하기 위해 설립되었다. 여기에 설명이 세 가지 절차는 수술 후 생존의 합리적인 가격과 장기적인 실험에 적합하다. 수술 경험이있는 연구원은 연습의 짧은 기간 후에 기술을 파악 할 수 있어야한다.
출혈은 수술, 간, 위, 및 혈관의 부주의 한 손상 사이의 결합 조직의 분리시 간 열상 전 마취제의 복강 내 주사에 기인 할 수있다. 이것은 가능한 한 피해야한다. 배터리 구동 미니 소작 적절한 경우 지혈하는데 사용될 수있다. 기관 및 조직이 조작 될 때 과도한 극력 피해야 연신. 핀셋의 끝은면으로 포장 될 수있다, 또는면 팁 핀셋을 대체하기 위해 젓가락처럼 사용할 수있다. 마우스 식도는 두 개의 층 또는 두 개의 & #이8220; 관 ", 외부 붉은"근육 관 "과 내부 희끄무레"상피 관 ". 절개는 식도에 이루어질 때, 양 층은 절개 할 필요가있다. 봉합은 균등하게 반대 점막 정확한 점막과 간격을해야합니다. 협착이 봉합 사이의 좁은 거리로 인해 생길 수있는 반면 누설, 봉합 사이의 넓은 거리에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 협착은 음식의 흐름을 차단할 수 있습니다 약간의 누설이 지역의 접착과 섬유화 반응에 의해 고정 될 수있는 반면, 수술 후 사망에이를 수 있으므로 일반적으로 생명을 위협하지 않습니다.
프로토콜 내에서 따라야 할 몇 가지 비판적 일반 원칙이있다. (실험실에서 약 20-30 분)이 가능하면 수술 시간을 단축해야한다. 수술 전후 금식하는 것은 불필요하다. 사실, 장기간 금식 (> 일일)은 유해 할 수 있습니다. 수술은 가장 한 외과 의사에 의해 수행된다. 조수는 쥐를 마취하고 surg를 제공 도움이 될 수 있습니다iCal을 재료. 외과 의사가 제대로 미세 훈련되지 않는 한 현미경이 필요하지 않습니다. 달리 수술 기간 이상 필요하므로 수술 생존 가능성 악화 될 수보다 쉽다.
이러한 절차는 이전의 공보에서 사용되어왔다과 만족스러운 결과를 생성 하였다. 야생 형 및 유전자 변형 쥐를 사용하여, 우리는 NFκB와 Nrf2 경로는 위식도 역류 (11, 12) 중 식도 상피의 장벽 기능을 조절 것을 보여 주었다. 그러나, 대신에, 이들 마우스에서 본격적인 바렛 식도 선암종 또는 생산할 수 없었다 점액 세포와 편평 상피 세포 암 (9)을 유도 하였다 흩어져. 마우스 식도 및 인간의 식도 사이의 조직 학적 차이는 바렛 식도 및 식도 선암에 대한 연구에서 이러한 수술 모델의 고유 제한 될 수 있습니다.
우리는이 SU를 생각rgical 모델은 위 식도 역류 질환에 대한 연구에 유용하다. 유전자 및 분자 경로의 기능 GERD의 분자 메커니즘을 이해하고기구 기반 치료법을 개발하기 위해 설명 될 수있다. 바렛 식도 및 식도 선암종의 제조에 사용하는 경우, 유전자 변형은 수술 환류와 함께 필요하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
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