Protocol
Alle dyreforsøk har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Mouse Forberedelse
- Bruk mus i løpet av ~ 20 g i kroppsvekt eller over ~ 6 uker i alder for kirurgi.
- Før operasjonen gi mus et laboratoriefor og vann ad libitum og opprettholde på en 12:12 timers lys-mørke-syklus.
- Barbere kirurgiske området med en hårklipper. Bedøve mus ved intraperitoneal injeksjon av 80 mg / kg ketamin og 12 mg / kg xylazin. Denne dosen setter mus i søvn på noen få minutter, og gir tilstrekkelig anestesi for følgende kirurgiske prosedyrer.
- Bekreft riktig anesthetization basert på fravær av hornhinnen refleks og lemmer tilbaketrekking når fotbladet blir klemt. Påfør smøre oftalmisk salve på øynene for å hindre tørrhet.
- Sterilisere hud med Betadine løsning.
2. Gastric Refluks Modell (figur 1B)
- Gjør en øvremidtlinjesnitt av ~ 2 cm med start fra xifoid peker mot anus.
- Åpne opp bukhulen gjennom midtlinjen. Fjern xiphoid å forbedre eksponering med en saks.
- Separat kuttes og bindevev mellom leveren og mage. Ligere og kutte beholderen bunten mellom milt og fundus for å fullstendig frigjøre fundus.
- Snu fundus litt til venstre og utsett venstre side av gastroøsofageal krysset i feltet. Foreta en 5 mm langsgående snitt på muskelen langs den distale spiserøret ved hjelp av en skarp saks for å eksponere epitel.
- Skjær åpne epitel langs samme retning (snitt 1, figur 1B). Lag tre snitt på forestomach (innsnitt 2, 3 og 4, figur 1B) for å avskjære det meste av forestomach med skarpe drifts saks. Hvis magen ikke er tom, forsiktig fjerne mageinnhold.
- Plassere en 8-0 prolene Suture (med en taper ålen) gjennom Point en (på spiserøret) og Point en "(på forestomach) med nøyaktig slimhinnene til slimhinne opposisjon. Likeledes sted sting gjennom punkt b og punkt B ', og andre par poeng, henholdsvis. Jevnt plass disse sting 3-4 mm fra hverandre.
- Vask bukhulen med fysiologisk saltvann for å rydde opp blod og mageinnhold. Lukk bukveggen med silkesuturer og huden med metallklips.
3. Blandet Refluks Modell (figur 1C)
- Følg trinn 02.01 til 02.04 for å avsløre gastroøsofageal krysset.
- Forsiktig skille ryggsiden av spiserøret fra blodkar bak spiserøret. Passere en liten bomulls tips mellom spiserøret og blodkar.
Merk: Cotton kan være delvis fjernet fra spissen for å redusere størrelsen. Dette bomull tips tjener to formål, å løfte opp i spiserøret og beskytte blodkar. - Lag to 5 mm lengde incisions hver på gastroøsofageal krysset og den proksimale ende av tolvfingertarmen ved siden av pylorus med skarpe drifts saks. For snittet på tolvfingertarmen, unngå blodårer og plassere på anti-mesenteriske grensen.
- Anastomose snittene med nøyaktig slimhinnene til slimhinne opposisjon med avbrutte 8-0 prolene sting. Vanligvis plasserer 3-4 sting på ryggsiden og 2-3 sting på forsiden.
- Ta av bomull spissen. Vask bukhulen med normal saltløsning og lukke bukveggen og huden.
4. Duodenal Refluks Modell (figur 1D)
- Følg trinn 03.01 til 03.04 for å generere blandet reflux.
- Løft forsiktig opp magen til å avsløre sin bakside. En flik av leveren kan bli fanget opp av bindevev mellom leveren og baksiden av magen. Skjær forsiktig bindevev, skal beskytte leveren, og eksponere blodkarene på den dorsale side av spiserøret.
- Ligere ogkuttet blodkar. Ligere og kutt i spiserøret ved gastroøsofageal krysset.
- Ligate tolvfingertarmen ved pylorus. Ligere og kutte mesenterium. Fjerne hele magen.
- Vask bukhulen med vanlig saltvann. Lukk bukveggen og huden.
5. Post-kirurgisk behandling
- Etter operasjonen opprettholde kroppstemperaturen med en varmepute. Først etter å gjenvinne sternal recumbency, plasserer musene tilbake med andre dyr.
- Gi antibiotika og smertestillende for å hindre smitte og lindre smerte. Injisere Baytril (10 mg / kg, ip, qd, for 3 dager) for å hindre smitte, og buprenorfinhydroklorid (0,05 mg / kg, sc, bud. For to dager) som smertestillende middel. Fasting er ikke nødvendig etter operasjonen.
En flytende eller myk diett kan gis. - Vurdere den generelle helsetilstanden på daglige basis.If musene viser følgende tegn (dramatiske vekttap> 15%, mangel på appetite, stemmebruk, utslipp fra munnen, nesen eller øynene, krum gest, inaktivitet, unormal grooming aktivitet), avlive mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fleste mus (> 95%) kan overleve operasjonen. Under den perioperative perioden, den ledende dødsårsaker omfatter overdose av bedøvelsesmidler, blødning og ukjente grunner.
Fire uker etter operasjonen,> 90% mus med gastrisk refluks eller blandet reflux og> 80% mus med duodenal reflux kan overleve. I løpet av denne perioden, mus primært dø av esophageal striktur og manglende evne til å spise. Disse musene viser tegn på alvorlig stress (krum holdning, inaktivitet, oppkast, innsunkne øyne, stemmebruk, etc.) og må avlives. Medisinsk behandling med antibiotika og infusjon vanligvis kan ikke lagre disse musene fra å dø. Mus vanligvis mister sin kroppsvekt av et par gram etter operasjonen, særlig de med duodenal tilbakeløp. Likevel kroppsvekt vil gjenopprette og øke senere.
Førti uker etter operasjonen, kan> 80% mus med mage og blandet reflux og> 70% mus med duodenal reflux overleve. During denne perioden, kan noen mus dør av underernæring eller ukjente årsaker. Vi har holdt mus i 80 uker etter operasjonen. Generelt, er de fortsatt ganske aktiv og sunn 9.
På fire uker etter operasjonen, vil arkitekturen i esophageal epitel bli skadet mer eller mindre av reflux. Under mikroskop, blir epitel tykkere og papilla elongates. Hyperproliferasjon av epitelceller og infiltrasjon av betennelsesceller (f.eks nøytrofiler, mastceller og eosinofile) er tydelige tegn på øsofagitt (figur 2). Cytokiner i esophageal epitel (f.eks IL1β, IL6 og IL8) er forhøyet spesielt i nærvær av duodenal 11 tilbakeløp. Under transmisjonselektronmikroskop, reflekterer dilatert intercellulært plass nedskrivning av epitel barrierefunksjon 12. Funksjonsmessig, trans-epitelial elektrisk motstand er dramatisk redusert, særlig i nærvær av duodenal reflux.
Figur 1: (A) Anatomy av øvre fordøyelseskanalen hos mus (sett forfra og fra siden); (B) Gastric refluks (sett fra siden); (C) Blandet refluks (forfra); (D) Duodenal refluks (sett forfra).
Figur 2: Histologi av muse-esophageal reflux epitel uten (A) eller med gastrisk refluks (B), blandet tilbakeløp (C), duodenal tilbakeløp (D). Scale bar = 50 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike kirurgiske modeller har blitt etablert for å etterligne mage, duodenal og blandet reflux hos gnagere. Disse tre prosedyrer beskrevet her er egnet for langvarige forsøk med rimelige priser på postoperativ overlevelse. En forsker med kirurgisk erfaring bør være i stand til å forstå teknikken etter en kort periode med praksis.
Blødning kan oppstå ved intraperitoneal injeksjon av bedøvelsesmidler før operasjonen, sårskader av leveren under separasjonen av bindevev mellom leveren og mage, og utilsiktet skade av blodkar. Dette bør unngås så mye som mulig. Batteridrevet miniKirurgi kan bli brukt for å stoppe blødning dersom det er hensiktsmessig. Overdreven strekking bør unngås så mye som mulig når organer og vev er manipulert. Tips av pinsett kan være pakket med bomull eller bomull tips kan brukes som spisepinner til å erstatte pinsett. Musen spiserøret har to lag eller to & #8220; rør ", ytre rødlig" muskel tube "og indre hvitaktig" epitel tube ". Når et innsnitt er gjort på spiserøret, begge lag må kuttes åpent. Stingene skal være jevnt fordelt med nøyaktig slimhinnene til slimhinne opposisjon. Lekkasje kan skyldes en bred avstand mellom sting, mens Innsnevringen kan utvikles på grunn av en smal avstand mellom suturer. Imidlertid kan innsnevring blokkere passasjen av mat og forårsake postoperative død, mens små lekkasjer kan være festet ved lokal adhesjon og fibrotisk reaksjon, og er derfor normalt ikke livstruende.
Det er flere kritiker generelle prinsipper å følge i protokollen. Varigheten av operasjonen bør forkortes hvis mulig (ca. 20-30 min i laboratoriet). Fastende før og etter operasjonen er unødvendig. Faktisk, langvarig faste (> 1 dag) kan være skadelig. Kirurgi er best utføres av en kirurg. En assistent kan hjelpe anesthetize musene og levere SurgiCal materialer. Et mikroskop er ikke nødvendig med mindre kirurgen har fått skikkelig opplæring i mikrokirurgi. Ellers varigheten av operasjonen tendens til å være lenger enn nødvendig og dermed postoperativ overlevelse muligens kan være verre.
Disse prosedyrene har blitt brukt i tidligere publikasjoner og har gitt tilfredsstillende resultater. Ved hjelp av villtype og genetisk modifiserte mus, viste vi at NFKB og Nrf2 trasé regulert barrierefunksjonen av esophageal epitel under gastroøsofageal refluks 11,12. Men vi var ikke i stand til å produsere full blåst Barretts øsofagus eller adenokarsinom i disse musene, i stedet, spredt mucinøst celler og plateepitelkarsinom ble indusert 9. Histologiske forskjeller mellom mus spiserør og menneskelige spiserøret kan være de iboende begrensningene i disse kirurgiske modeller i forskning på Barretts spiserør og esophageal adenokarsinom.
Vi tror disse surgical modeller er nyttige for studier på GERD. Funksjoner av gener og molekylære reaksjonsveier kan belyses å forstå de molekylære mekanismer av GERD og utvikle mekanismebasert terapi. Når den brukes for fremstilling av Barretts øsofagus og esophageal adenokarsinom, vil genetiske modifikasjoner være nødvendig i kombinasjon med tilbakeløp kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
