Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная.
1. Подготовка Мышь
- Используйте мышь над ~ 20 г массы тела или выше ~ 6 недель в возрасте для хирургии.
- До операции, дать мышам лаборатории чау и воды вволю и поддерживать на 12:12 час свет-темнота цикла.
- Бритье хирургического зона с машинки для стрижки волос. Обезболить мышей внутрибрюшинным введением 80 мг / кг кетамина и 12 мг / кг ксилазина. Эта доза ставит мышей в сон в течение нескольких минут и обеспечивает достаточное обезболивание для следующих хирургических процедур.
- Подтвердите правильное обезболивания, основанный на отсутствии роговицы рефлекс и конечностей втягивания, когда разбойник зажат. Применить смазочных глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость.
- Стерилизовать кожу бетадином решения.
2. желудочного рефлюкса Модель (1В)
- Сделайте верхнийсрединный разрез от ~ 2 см, начиная с мечевидным указывая на анус.
- Откройте брюшной полости через линии. Удалить мечевидного для повышения экспозиции с ножницами.
- Отдельная и сократить соединительной ткани между печени и желудка. Лигировать и вырезать пучок сосудов между селезенки и глазного дна, чтобы полностью освободить дно.
- Поверните глазного дна немного влево и выставить левую сторону желудочно-перехода в поле. Сделайте 5 мм продольный разрез на мышцы вдоль дистального отдела пищевода с использованием пары острых ножниц, чтобы выставить эпителий.
- Разрежьте эпителий в том же направлении (разрез 1, 1В). Сделать три разрезы на forestomach (2 разреза, 3 и 4, Фигура 1В), чтобы отрезать большую часть forestomach с острыми ножницами эксплуатации. Если желудок не пуст, тщательно удалить содержимое желудка.
- Поставьте 8-0 проленовой ŞuţuRe (с конической точки иглы) через точку А (на пищеводе) и точка А '(на forestomach) с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции. Аналогичным образом место швы через точку В и точка В ', и другими парами точек, соответственно. Равномерно пространстве эти швы 3-4 мм друг от друга.
- Вымойте брюшной полости физиологическим раствором для очистки крови и содержимого желудка. Закройте брюшной стенки с шелковыми швами и кожу с металлическими зажимами.
3. Смешанный рефлюкс Модель (рис 1С)
- Последующие шаги 2.1 до 2.4, чтобы разоблачить желудочно-пищеводного соединения.
- Аккуратно отделить спинной стороне пищевода из кровеносных сосудов позади пищевода. Пройдите небольшой кончик хлопок между пищеводом и кровеносных сосудов.
Примечание: Хлопок может быть частично удаляют из наконечника, чтобы уменьшить его размер. Этот совет хлопок служит двум целям, поднимая пищевод и защиты кровеносных сосудов. - Сделайте два 5 мм продольное вклisions друг на желудочно-перехода и проксимальный конец двенадцатиперстной кишки, прилегающей к привратника с острыми ножницами эксплуатации. Для разреза на двенадцатиперстную кишку, во избежание кровеносные сосуды и разместить на анти-брыжеечной границе.
- Анастомозирует разрезы с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции прерванных 8-0 Prolene швов. Обычно место 3-4 швов на спинной стороне и 2-3 швов на лицевой стороне.
- Снимите наконечник хлопка. Промыть брюшную полость с физиологического раствора и закрыть брюшной стенки и кожу.
4. двенадцатиперстной рефлюкс Модель (рис 1D)
- Следуйте шаг 3.1 до 3.4 для создания смешанного рефлюкса.
- Осторожно поднимите живот, чтобы выставить свою обратную сторону. Выступ печени может быть захвачен соединительной ткани между печени и задней части желудка. Аккуратно вырежьте соединительной ткани, должным образом защитить печень, и выставить кровеносные сосуды на спинной стороне пищевода.
- Перевязывать исократить кровеносные сосуды. Перевязывать и сократить пищевод в желудочно-перехода.
- Перевязывать двенадцатиперстную кишку на привратника. Перевязывать и сократить брыжейки. Снять целый желудок.
- Промыть брюшную полость с физиологического раствора. Закройте брюшной стенки и кожу.
5. После хирургического лечения
- После операции поддержания температуры тела с грелку. Лишь после восстановления грудины лежачее положение, место мышей обратно с другими животными.
- Дайте антибиотики и обезболивающее для предотвращения инфекции и облегчить боль. Вводите Baytril (10 мг / кг, внутрибрюшинно, ежедневно, в течение 3 дней), чтобы предотвратить инфекцию, и бупренорфин гидрохлорид (0,05 мг / кг, подкожно, ставка. В течение двух дней), как болеутоляющее средство. Пост не является необходимым после операции.
Жидкость или мягкое диета может быть предоставлена. - Оценить общее состояние здоровья на ежедневной basis.If мышей показывают следующие признаки (драматическая потеря веса> 15%, отсутствие приложенияetite, вокализации, выделения из носа, рта или глаз, сгорбившись жест, бездействия, ненормальное уход деятельности), усыпить мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Большинство мышей (> 95%) может пережить операцию. В послеоперационном периоде, ведущие причины смерти включают передозировку анестетиков, кровотечение и неизвестные причины.
Четыре недели после операции,> 90% мышей с желудочного рефлюкса или смешанной рефлюкса и> 80% мышей с двенадцатиперстной рефлюкса могут выжить. В течение этого периода, в первую очередь мышей умирают от пищевода стриктуры и невозможность поесть. Эти мыши обнаруживают признаки сильного стресса (сгорбившись позе, бездействия, рвота, запавшие глаза, вокализации, и т.д.) и должны быть умерщвлены. Медицина с антибиотиками и инфузии, как правило, не может спасти этих мышей от смерти. Мыши, как правило, теряют вес тела на пару граммов после операции, особенно с обратным холодильником в двенадцатиперстной. Тем не менее массы тела восстановится и увеличить в дальнейшем.
Сорок недель после операции,> 80% мышей с желудка и смешанного рефлюкса и> 70% мышей с двенадцатиперстной рефлюкса могут выжить. ДурING этот период, некоторые мыши могут умереть от недоедания или неизвестным причинам. Мы сохранили мышей в течение 80 недель после операции. В общем, они все еще довольно активной и здоровой 9.
В четырех недель после операции, архитектура эпителия пищевода будут повреждены более или менее рефлюкса. Под микроскопом, эпителий становится толще и сосок вытягивается. Гиперпролиферацию эпителиальных клеток и инфильтрации воспалительных клеток (например, нейтрофилов, тучных клеток и эозинофилов) явные признаки эзофагита (рис 2). Цитокины в эпителия пищевода (например, IL1β, IL6 и IL8) повышены в частности, в присутствии рефлюкса дуоденального 11. Под электронным микроскопом передачи, дилатационная межклеточное пространство отражает ухудшение эпителиальных барьерной функции 12. Функция стрелке, транс-эпителиального электрическое сопротивление резко уменьшилось, особенно в присутствии duodenаль рефлюкс.
Рисунок 1: (А) Анатомия верхних отделов пищеварительного тракта у мышей (вид спереди и вид сбоку); (B), желудочного рефлюкса (вид сбоку); (С) Смешанный рефлюкс (вид спереди); (D), двенадцатиперстной рефлюкс (вид спереди).
Рисунок 2: Гистология мыши эпителия пищевода без рефлюкса (А), или с желудочного рефлюкса (B), смешанный рефлюкс (C), двенадцатиперстной обратным холодильником (D). Масштабная линейка = 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные хирургические модели были созданы, чтобы имитировать желудка, язва двенадцатиперстной и смешанный рефлюкс у грызунов. Эти три процедуры, описанные здесь, подходят для долгосрочных экспериментов с разумным ценам послеоперационного выживания. Исследователь с опытом хирургического должны быть в состоянии понять технику после короткого периода практики.
Кровотечение может быть результатом внутрибрюшинной инъекции анестетиков до операции, рваные раны печени во время разделения соединительной ткани между печени и желудка, и случайного повреждения кровеносных сосудов. Этого следует избегать, насколько это возможно. Батарейках мини-прижигание могут быть использованы, чтобы остановить кровотечение, если это необходимо. Чрезмерного растяжения следует избегать, насколько это возможно, когда органы и ткани манипулировать. Кончики пинцета может быть обернута ватой или ватные палочки могут быть использованы как палочками, чтобы заменить пинцет. Пищевод мышь имеет два слоя или два и #8220; трубки ", внешняя красновато" мышцы труб "и внутренняя беловато" эпителий труб ". Когда надрез на пищевод, оба слоя должны быть разрезана. Швы должны быть равномерно распределены с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции. Утечка может привести из широкого расстояния между швами, а стриктуры может развиться из-за узкого расстояния между швами. Тем не менее, сужение может блокировать прохождение пищи и вызывают послеоперационную смерть, в то время как небольшая утечка может быть фиксированной местной адгезии и фиброзной реакцией и, таким образом, как правило, не опасны для жизни.
Есть несколько критически общие принципы, чтобы следовать в протоколе. Продолжительность операции должен быть сокращен, если это возможно (около 20-30 мин в лаборатории). Пост до и после операции не является необходимым. В самом деле, длительное голодание (> 1 день) может быть вредным. Хирургическое лучше всего проводить с помощью одного хирурга. Помощник может помочь обезболить мышей и поставить Surgские материалы. Микроскоп не надо, если хирург не был должным образом обучены микрохирургии. В противном случае продолжительность операции, как правило, длиннее, чем необходимо и, таким образом послеоперационная выживаемость может быть потенциально хуже.
Эти процедуры были использованы в предыдущих публикаций и сформировали удовлетворительные результаты. Использование дикого типа и генетически модифицированных мышей, мы показали, что NFκB и Nrf2 пути регулируются барьерную функцию эпителия пищевода во время желудочно-пищеводного рефлюкса 11,12. Тем не менее, мы не были в состоянии производить полномасштабный пищевод или аденокарциномы Барретта в этих мышей, а, разбросанных муцинозные клетки и плоскоклеточный рак были вызваны 9. Гистологические различия между пищеводом мыши и человека пищевода могут быть присущи ограничения этих хирургических моделей в исследованиях на пищевода и аденокарциномы пищевода Барретта.
Мы считаем, что эти суrgical модели полезны для исследований на ГЭРБ. Функции генов и молекулярных механизмов можно пояснить понять молекулярные механизмы ГЭРБ и разработать механизм на основе терапии. При использовании для изготовления пищевода и аденокарциномы пищевода Барретта, генетические модификации будут необходимы в сочетании с рефлюкс хирургии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
