Protocol
Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Mus Framställning
- Använd möss över ~ 20 g kroppsvikt eller högre ~ 6 veckor i ålder för kirurgi.
- Före operation, ge möss en laboratoriefoder och vatten ad libitum och upprätthålla på en 00:12 timmar ljus-mörker-cykel.
- Raka operationsområdet med en hårklippare. Söva möss genom intraperitoneal injektion av 80 mg / kg ketamin och 12 mg / kg xylazin. Denna dos sätter möss in i sömnen på några minuter och ger tillräckliga anestesi för följande kirurgiska ingrepp.
- Bekräfta korrekt anesthetization baserat på avsaknad av hornhinnan reflex och lem infällning vid trampdynan kläms. Applicera smörj oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet.
- Sterilisera huden med betadinlösning.
2. Gastric Reflux Model (Figur 1B)
- Gör en övremittlinjeincision av ~ 2 cm från och xiphoid pekar på anus.
- Öppna bukhålan genom mittlinjen. Ta xiphoid att öka exponeringen med en sax.
- Separat och skär den bindväv mellan levern och magen. Ligera och skär kärlet knippet mellan mjälten och fundus för att helt frigöra fundus.
- Vrid fundus något till vänster och exponera den vänstra sidan av den matstrupsövergången i fält. Gör en 5 mm longitudinellt snitt på muskeln längs den distala esofagus med användning av en vass sax för att exponera epitelet.
- Skär öppna epitel utmed samma riktning (snitt 1, Figur 1B). Gör tre snitt på förmagen (snitt 2, 3 och 4, Figur 1B) för att skära av de flesta av förmagen med vassa drifts sax. Om magen inte är tom, försiktigt bort maginnehåll.
- Placera en 8-0 prolen Suture (med en konpunkten nål) genom punkten A (på matstrupen) och punkt a '(på förmagen) med korrekt slemhinna till mukosala opposition. Likaså plats suturer genom punkt B och punkt b ', och andra par av poäng, respektive. Jämnt utrymme dessa suturer 3-4 mm från varandra.
- Tvätta bukhålan med normal saltlösning för att städa upp blod och maginnehåll. Stäng bukväggen med silkessuturer och huden med metallklämmor.
3. Blandad Reflux Model (Figur 1C)
- Följ steg 2,1-2,4 för att exponera matstrupsövergången.
- Separera försiktigt ryggsidan i matstrupen från blodkärlen bakom matstrupen. Passera en liten bomullsspets mellan matstrupen och blodkärlen.
Obs: Bomull kan delvis avlägsnas från spetsen för att minska sin storlek. Denna bomull spets tjänar två syften, att lyfta upp i matstrupen och skydda blodkärlen. - Gör två 5 mm längd incisions vardera på matstrupsövergången och den proximala änden av tolvfingertarmen intill pylorus med vassa drifts sax. För snittet på tolvfingertarmen, undvika blodkärl och placera på anti-mesenterial gränsen.
- Anastomos snitt med korrekt slemhinna till mukosala opposition med avbrutna 8-0 Prolene suturer. Vanligtvis placera 3-4 suturer på ryggsidan och 2-3 suturer på framsidan.
- Ta bomullsspetsen. Tvätta bukhålan med normal saltlösning och stäng den abdominala väggen och huden.
4. Duodenal Reflux Modell (figur 1D)
- Följ steg 3,1-3,4 för att generera blandade reflux.
- Lyft försiktigt upp magen för att exponera sin baksida. En LOB av levern kan omfattas av bindväv mellan levern och baksidan av magen. Skär försiktigt den bindväv, ordentligt skydda levern, och exponera blodkärlen på ryggsidan i matstrupen.
- Ligat ochklippa blodkärlen. Ligera och skär matstrupen vid matstrupsövergången.
- Ligate tolvfingertarmen vid pylorus. Ligera och skär mesenteriet. Ta hela magen.
- Tvätta bukhålan med normal saltlösning. Stäng bukväggen och huden.
5. Post-kirurgisk behandling
- Efter operation upprätthålla kroppstemperaturen med en värmedyna. Först efter att ha återupprättat sternala VILA, placera mössen tillbaka med andra djur.
- Ge antibiotika och smärtstillande för att förhindra infektioner och lindra smärta. Injicera Baytril (10 mg / kg, ip, qd, i 3 dagar) för att förhindra infektion, och buprenorfinhydroklorid (0,05 mg / kg, se, bud. Under två dagar) i form av smärtstillande medel. Fastan är inte nödvändigt efter operationen.
En flytande eller mjuk diet kan ges. - Utvärdera allmänna hälsotillstånd på dagliga basis.If mössen visar följande tecken (dramatisk viktminskning> 15%, brist på ca.etite, vokalisering, flytningar från mun, näsa och ögon, böjd gest, inaktivitet, onormal grooming verksamhet), euthanize möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De flesta möss (> 95%) kan överleva operationen. Under det perioperativa perioden, de vanligaste dödsorsakerna bland annat överdos av narkosmedel, blödningar och okända orsaker.
Fyra veckor efter operationen,> 90% möss med sura uppstötningar eller blandad reflux och> 80% möss med duodenal reflux kan överleva. Under denna period, möss dör främst av esofagus striktur och oförmåga att äta. Dessa möss visar tecken på svår stress (krökt kroppshållning, inaktivitet, kräkning, insjunkna ögon, läte, etc.) och måste avlivas. Medicinsk behandling med antibiotika och infusion vanligtvis kan inte spara dessa möss från att dö. Möss förlorar vanligtvis sin kroppsvikt med ett par gram efter operationen, särskilt de med duodenal reflux. Ändå kroppsvikt återhämta sig och öka senare.
Fyrtio veckor efter operationen, kan> 80% möss med mag- och blandad reflux och> 70% möss med duodenal reflux överleva. During denna period kan vissa möss dör av undernäring eller okända skäl. Vi har hållit möss för 80 veckor efter operationen. I allmänhet är de fortfarande ganska aktivt och hälso 9.
Vid fyra veckor efter operationen, kommer arkitekturen i matstrupen epitel skadas mer eller mindre av återflöde. Under mikroskop, blir epitel tjockare och papilla förlänger. Hyperproliferation av epitelceller och infiltration av inflammatoriska celler (t.ex. neutrofiler, mastceller och eosinofiler) är tydliga tecken på esofagit (Figur 2). Cytokiner i esofagus epitel (t.ex. IL1β, IL6 och IL8) är förhöjda i synnerhet i närvaro av duodenal reflux 11. Under transmissionselektronmikroskop, speglar dilaterad intercellulära utrymmet nedskrivning av epitelbarriären funktion 12. Funktion-Wise, trans-epitelial elektrisk resistans är dramatiskt minskat, i synnerhet i närvaro av duodenal reflux.
Figur 1: (A) anatomi övre matsmältningskanalen hos möss (frontvy och sidovy); (B) sura uppstötningar (från sidan); (C) Blandad reflux (framifrån); (D) Duodenal reflux (framifrån).
Figur 2: Histologi av mus matstrupen epitel utan reflux (A), eller med gastrisk reflux (B), blandade reflux (C), duodenal reflux (D). Skalstreck = 50 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika kirurgiska modeller har upprättats för att härma mag-, duodenala och blandades återflöde hos gnagare. Dessa tre förfaranden som beskrivs här är lämpliga för långtidsförsök med rimliga priser för postoperativ överlevnad. En forskare med kirurgisk erfarenhet bör kunna förstå tekniken efter en kort period av praxis.
Blödning kan vara resultatet av intraperitoneal injektion av bedövningsmedel före operation, skärsår av levern under separation av den bindväv mellan levern och magen, och oavsiktlig skada av blodkärlen. Detta bör undvikas så mycket som möjligt. Batteridriven mini kauterisation kan användas för att stoppa blödning vid behov. Överdriven sträckning bör undvikas så mycket som möjligt när organ och vävnader manipuleras. Spetsarna på pincetten kan lindas med bomull, eller bomulls spetsar kan användas som pinnar för att ersätta pincett. Musen matstrupen har två lager eller två & #8220, rör ", yttre rödaktig" muskel rör "och inre vitaktig" epitel rör ". När ett snitt görs på matstrupen, båda skikten måste skäras upp. Suturer bör vara jämnt fördelade med korrekt slemhinna till mukosala opposition. Läckage kan resultera från ett stort avstånd mellan suturerna, medan striktur kan utvecklas på grund av en smal avstånd mellan suturerna. Emellertid kan förträngning blockera passagen av livsmedel och orsakar postoperativ död, medan smärre läckage kan fastställas genom lokal vidhäftning och fibrotisk reaktion och därför är oftast inte livshotande.
Det finns flera kritiskt allmänna principer att följa i protokollet. Varaktigheten av kirurgi bör förkortas om möjligt (ca 20-30 min i labbet). Fastan före och efter operation är onödig. I själva verket, utdragen fasta (> 1 dag) kan vara skadligt. Kirurgi utförs bäst genom en kirurg. En assistent kan hjälpa söva möss och leverera surgtiska material. Ett mikroskop är inte nödvändigt om kirurgen har lämplig utbildning i mikro. Annars varaktighet kirurgi tenderar att vara längre än nödvändigt och således postoperativ överlevnad kan vara potentiellt värre.
Dessa förfaranden har använts i tidigare publikationer och har genererat tillfredsställande resultat. Med hjälp av vildtyp och genetiskt modifierade möss, visade vi att NFkB och Nrf2 vägar reglerade barriärfunktion matstrupen epitel under gastroesofageal reflux 11,12. Vi var dock inte kunna producera fullt utvecklad Barretts esofagus eller adenokarcinom i dessa möss, istället spridda slem celler och skivepitelcancer inducerades 9. Histologiska skillnader mellan mus matstrupe och mänskliga matstrupen kan vara inneboende begränsningar av dessa kirurgiska modeller inom forskning om Barretts esofagus och esofagusadenokarcinom.
Vi anser att dessa surgical modeller är användbara för studier av GERD. Funktionen av gener och molekylära vägar kan belysas för att förstå de molekylära mekanismerna för GERD och utveckla mekanismbaserad terapi. Vid användning för framställning av Barretts esofagus och esofagusadenokarcinom, kommer genetiska modifieringar vara nödvändig i kombination med återlopps kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
