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Behavior

啮齿动物脑显微注射学习动机行为的分子基板

doi: 10.3791/53018 Published: September 16, 2015

Protocol

涉及受试动物的程序已被批准的机构动物护理和使用委员会(IACUC)在弗吉尼亚联邦大学,并坚持美国国立卫生研究院指南实验动物的护理和使用。

1.准备实现了手术前和显微注射

  1. 建立了材料准备:
    1. 获得&G套管管道,33克闭孔丝,33克显微注射针管,微量塑料管(PE20或等效物),两个中重直止血剂,实验室卷尺,直尺,永久标记,70%的乙醇(体积/体积),存储小瓶例如,将20ml玻璃闪烁),超级胶,小称量皿,并且旋转工具配备有非重型截止光盘。
      注:固定旋转工具来使用带或磁带枪头盒子是有帮助的,因为它提升了工具。戴眼睛的保护是使用旋转工具时避免损伤重要的。
    2. 附上一张实验室或高压灭菌带了替补席上。
  2. 准备插管的:
    注:至少有两个套管需要每鼠的双侧注射。一个附加套管将在后面的步骤中使用。
    1. 获得足够的长度套管管道的部分,以避免标记和切割过程中的弯曲。
    2. 从用细尖笔1.1.2步上绘制带15毫米的基准线。这将作为对管连续15个毫米的部分,用锋利的永久性标记标记的导向。
    3. 触摸套管管道,在标记的点,到旋转工具的慢速纺丝截止光盘以缺口管材。旋转套管180˚和缺口管材的相对侧。不要通过管子完全切断,因为这可能会导致阻塞。
    4. 剧烈的弯曲管道,以便它分解成〜15毫米部分。
    5. 握住套管的各切端垂直于截止拇指和食指之间光盘。旋转套管管在触摸尖端截止盘( 即不是边缘)的大前锋表面。这将生成一个钝尖。注意:不要弯曲套管,为可能产生的异地注射。
    6. 令与&G斜口针(棕色毂)套管的两端,以确保所有的毛刺已被删除并且该套管是通畅。
    7. 通过闭孔线切割样品到〜35毫米的通切插管,以确认不存在任何内部障碍物。
    8. 拿起单独使用松开止血每个插管和衡量每完成插管用尺子来确保它的长度整整14毫米。
  3. 准备阻塞器的:
    1. 夹紧一个插管在大约半长与重量适中,直止血。躺在长椅上锁定的止血钳。套管应垂直于替补席。
      注:此套管不应该被用在外科手术被保持由锁定止血后,因为它很可能弯曲。
    2. 订阅闭孔线的一端插入套管,直到它达到了替补席上。弹起丝在插管以确保毛刺不阻止它到达替补; ,在到达套管的底部。正确的闭孔长度将防止堵塞和额外的组织疤痕。
    3. 弯曲的线用手指捏,直到同时保持闭孔和替补之间的接触〜30˚角来实现的。确保弯曲的角度是这样的,它规定与头帽齐平,和过量的面向前方,从而使其更难大鼠除去。
    4. 从套管中取出电线切断,在超出的部分约2.5毫米的小斜刀(线切割)的弯曲。
      注意:至少有两个密闭装置将需要每只大鼠的双侧注射,因为每个植入插管需要一个插塞。创建通过闭孔额外〜35˚弯曲中途也将有助于防止去除动物。同时存储插管和含70%乙醇(体积/体积),直到使用在分开的小瓶中充填器例如,20毫升玻璃闪烁),但至少O / N。
  4. 制备及microinjectors的测试:
    1. 获取一块微量注射器针管的是约1米长。
    2. 握住微量管的一端垂直地锁定直止血。
    3. 扭动止血,同时保持张力的油管紧紧线圈它周围的止血钳的至少一个时间。
    4. 测量从微量管的对面,宽松的端部32毫米,垂直地抓住这一点与连续第二个,中等重量止血并将其锁定。抓住微量管上的32毫米边止血标志最接近宽松的结束,而不是最接近止血一边用绕线。
    5. 本D中的管来回,同时保持紧张油管直至其断裂。
      注意:一个单一的,尖锐的向上和向下的弯曲会产生一个钝断裂,这是所希望确保显微注射发​​生在期望的大脑区域。
    6. 检查微量管,以确保两端是直的并且其内径是通畅。
    7. 获得套管管道将被用于制造微量衣领。
    8. 测量并用永久性记号笔画和磁带上(步骤1.1.2)一个5毫米的基准线标记套管管连续5毫米部分。
      注意:每个微量需要一个项圈。项圈是简单的短套管坚持以微量电线。
    9. 触摸套管管,在标志点,以旋转刀具的缓慢旋转切断盘,以缺口管材。旋转套管180˚和缺口管材的相对侧。切割完全可能堵塞管道。
    10. 一针见血弯曲微量领管,以它分解成〜5毫米部分。
    11. 铰用&G斜口针(棕色毂)的套环的两端的内径,以确保大部分毛刺已被删除。一些小毛刺会抢了微量电线,从而有助于粘合。
    12. 1环滑动到每个微量管〜2厘米的结束。
    13. 小权衡船角落创建的强力胶一个小水池。
    14. 使用废料套管管道切成〜25毫米到涂抹少量强力胶到微量管〜5毫米,从一端。接着,滑动套环移到该超级胶水珠,以便它是从微注射管的端部〜1毫米。覆盖用胶水颈圈的两端。
      注意:避免强力胶大量堆积在衣领上,因为它会阻止塑料管从周围的微量密封。虽然,以避免强力胶的微量管的开口端,因为这会令是很重要的的微量不可用,这也是很重要的滑动轴环尽可能靠近端,以尽量减少空隙(未注射)的体积。
    15. 精益完成的微量上的另一个小权衡与衣领的一面朝上船外,并晾干24小时。
    16. 得到〜8厘米一块微量的塑料管(PE20或等效物),1毫升注射器填充有无菌水,和&G斜口针(棕色毂)。
    17. 附加26克(棕色集线器)针注射器滑动切管到针,确保不要刺破管。
    18. 滑动塑料管在干的,完全微量的衣领结束。
    19. 挤水填充针筒柱塞以测试通畅。
      注:水宜喷很远又直出微量尖。如果流是不直,注射位置将不正确。横盘或弥漫性喷雾的来源是一个贫穷的突破(步骤1.4.5)。微量注射器不应该T表示,如果喷雾是横盘或弥漫性使用。盐水不应该被使用,因为它会阻塞微量或针。
    20. 为了从微量去除水中拉出注射器回来。应贮存在干燥,密封的小瓶;例如,一个20毫升玻璃闪烁瓶中。
      注:Microinjectors可以制造与大多数超级胶水,31后进行高压灭菌,但是这必须根据经验来确定。替代灭菌技术包括环氧乙烷和γ照射。

2.准备和执行显微注射

  1. 获得完成microinjectors,微量塑料管(PE20或等效物),显微注射泵,两个小称量皿,无菌水,70%的乙醇(体积/体积),丙酮,二气密1μl的玻璃注射器的钝针(25 G)的棉签木喷头,备用密闭装置,1ml注射器,26 G(棕色集线器)的针,小弯钳(款式#7推荐),和实验室W¯¯IPES。
  2. 准备microinjectors注射:
    1. 弯曲完成微量注射器从相对的套环端15毫米,使两者之间的角度为〜95˚。
      注:精确的弯曲位置是刻不容缓的准确注射位置。使用#7镊子(或类似)抓住微量和弯曲向上是非常有用的。始终重新测量进行显微注射​​前的长度。
    2. 将塑料管(PE20)到〜70厘米,滑过微量衣领。
      注意:添加磁带选项卡,其中的一个塑料筒近两个微量和适度宽松的结束完成注射时,注射两种不同的解决方案,特别是当是很有用的。标签不推荐用于管,因为他们成为在注射过程中繁琐。
  3. 准备泵显微注射:
    1. 电源开泵。
    2. 设置直径显微注射针的,所需的输注率,和目标注射量。
      注意:输液鼠e和注射量取决于实验的要求。这是在讨论中阐述。有些泵有预装注射器表。如果不是这样,一个注射器表可以在制造网站(多个)中找到。
    3. 将泵模式为“音量”,这样一个精确的音量自动发送。如果选择“泵”模式,请实验者必须手动停泵。
    4. 调节泵逆止以允许注射器来填充到注射体积外加0.2微升。
  4. 准备显微注射的注射器和微量注射:
    1. 锁每个气密显微注射注射器插入微量注射泵的齿条。
    2. 放置气密注射器的尖端到包含在一个小的无菌水称重舟,轻轻扑柱塞以润滑内部导线。均匀地拉柱塞逆止泵,填补了水。
    3. 滑动PE20管材是合作nnected到微量(步骤2.2)在连接到一个1ml注射器填充有无菌水26克(棕色集线器)针。通过微量喷雾无菌水,并检查喷雾形状和距离。
      注:水宜喷很远又直出微量尖。如果流是不直,注射位置将不正确。
    4. 将灭菌微量到无菌区。
    5. 滑动管道落针,保持微量管直立,以防止水滴落出来,同时也降低了由针受损区域的下方的管道。
    6. 推显微注射针筒柱塞稍微向前以创建在所述针的端部的液滴和滑动充水PE20管(被连接到微量)到针。
      注:这将创建一个液 - 液连接,将允许适当的反压,可以赶走,可以形成以堵塞该微量的一角。
    7. 推动柱塞完全向前,以备样量,并确保没有一丝酒精留在微量。
    8. 通过触摸已经形成微量的尖端到一个干净的实验室擦拭多次水滴检查设置是否有泄漏。
  5. 注意:当接触到实验室擦拭,只有一个湿点应该形成。如果有更多的液滴,存在在系统中的泄漏。
  6. 通过控制超级胶水的应用程序(步骤1.4.14),并通过调整PE20管材用锋利的剪刀或刀片的PE20管从任何连接删除的任何时间,避免泄漏。此外,重复步骤2.4.3至2.4.8,以弥补泄漏。
  7. 拉注射器活塞回到0.2微升;创建无菌水在PE20管道/微量和溶液之间的气泡被注入。
  8. 注意:此气泡可防止稀释注射液中,水的污染,并允许用于监测注射过程的,因为它会在注射过程中移动。一个单一的,坚实的泡沫应该产生。如果它坏了,存在泄漏或微量尖闭塞;这表明步2.4.8(和附带的注释)应反复。
  9. 将在微量到试剂注入,然后慢慢将注射器柱塞,逆止器。
  10. 动物准备注射:
  11. 抓住老鼠的胸部对实验者的胸部。用棉涂敷器浸泡在70%的乙醇清洗围绕插管的区域(体积/体积)。
  12. 注意:使用适当的处理,老鼠可以轻轻地在杯形手的限制。否则,矿泉去油光可能需要。
  13. 删除使用小镊子和地方密闭装置进入称重舟用70%乙醇(体积/体积)。
  14. 执行注射:
  15. 将填充微量(步骤2.4.10)进入套管。按微量注射泵和监测气泡运动的开始。
  16. 注意:マŸ需要稍微用力,以确保microinjectors都不抬。泡沫(形成步骤2.4.9)应统一推进,全面进入微量。
  17. 除去从套管的microinjectors和替换密闭装置中,一旦注射完成和后喷射扩散周期已经过去。
  18. 注意:典型后喷射的扩散时间是2 - 4分钟药理试剂,和2 - 10分钟的病毒。留在微量在后输液期间防止注射液从回流备份插管,而不是扩散到组织中。在乙醇填充权衡船一侧放置密闭装置,使乙醇重新插入到插管前排水。

3.注射后清理

  1. 获取一个小瓶的每一个:无菌水,70%乙醇和丙酮。
  2. 清洗微量注射器和显微注射针筒:
    1. 卸下玻璃注射器- 从玻璃注射泵的注射器架和注射管。
    2. 从玻璃注射器断开微量管和附加1ml注射器经由&G针(棕色毂)充满无菌水到微量管中。按1毫升注射器活塞前锋驱逐-0.3毫升接下来,触摸微量的尖端实验室擦拭和拉风回通过微量。
      注意:微量和管道可以被重新用于类似的实验,如果认为谨慎。
    3. 将玻璃注射器针头插入无菌水,并绘制活塞完全恢复。其次,推动柱塞完全向前冲。触摸玻璃注射器尖端实验室擦拭,以确保没有液体的存在。
    4. 用无菌水,空气,70%乙醇和丙酮按以下顺序重复步骤3.2.3:无菌水,无菌水,空气,空气,70%乙醇,70%乙醇,空气,空气,丙酮,丙酮,空气,空气。执行所有这些清洁步骤将有助于维护显微注射针筒。
    5. 放置微量注射器(S)为包装和拉柱塞回0.05微升。
      注意:这是重要的,因为它允许在柱塞被推动或拉动,以便驱逐可能发生的应保存后的任何盐沉积物形成卡住柱塞。

4.编程动机测定

  1. 登录到图形状态具有管理员凭据。
  2. 选择或创建相关的数据库。
  3. 创建渐进比强化程序:
    1. 选择列表>数据库级列表>事件转换参数列表。
    2. 选择“添加”。输入相应的列表号(L#)和描述。
    3. 选择“添加事件”。
    4. 输入第一个强化程序的价值,并选择“添加”。重复。
      注意:值可以通过使用其中渐进比时间表= 5E(j *(加强件挣得+ 1))-5一个公式确定7。为了调整此公式来正确测试该假说,值j必须凭经验确定,或从文献中获得。
    5. 内的“选择订单”框中选择“为了'。
    6. 选择“保持值=为:____”中的“完成时”框。输入加固进度值到远远超过预期的响应文本框。这将是所有后续项目所需的努力,一旦名单已经用完。
  4. 创建一个实验方案:
    注意:图形状态移动通过一系列状态被退出基于时间或性能标准的受试者。设置如下标记为“$”下检查,以适当地测试假设所有离散和上下文线索和参数。
    1. 选择文件>新建实验方案。
    2. 输入所需的协议号和描述成相应的文本框中。 选择“国家创作”。
    3. 和“FIN - 完成国家” - 同时为“就绪状态RDY”将所有的刺激。
    4. 选择“新的国家”,并命名为“S2 - PR响应。
    5. 选择“新的国家”,并命名为“S3 - PR增强剂和提示”
    6. 选择“新的国家”,并命名为“S4 - 超时”。
    7. 突出显示“S1”并将其命名为“S1 - 习惯化。”
      1. 选择添加“时间定位。”
      2. 输入适当的时间($)和单位($), 例如 ,分钟,距离为s下拉框中选择“S2”。时间单位“单位”是最初创建数据库时确定的。
        注:创建的过渡时间应改为类似于[之后$分钟GO P = 100%,到S2 1是曾经创造了这个事件的例子。
    8. </ OL>

    图1
    图1代表编程实例#1中。在这种情况下一个时间分隔的状态示于其中$用户定义的值,在这里显示分钟,表示当目前的状态应退出到状态2(S2)。

    1. 突出“S2 - PR响应。
      1. 选择添加“活动回到”。
      2. 输入列表名称包含在步骤4.3创建到第一个文本框为L $( 例如,L1)的渐进比时间表,选择合适的operandum(例如,杆或鼻子戳)的第一个下拉框,选择“ S3“从送下拉框中。
        注:创建的事件可以读取类似[如果L $ 1 - 主动GO P = 100%,达到S3。标识符1 - 主动数据库创建时被指定。在这里,1 - 活动指的是插入到交换机的一个operandum。
      3. 选择“添加时间转到”。
      4. 检查“R”框中,输入适当的时间和单位($),并从送选“FIN”下拉框中。
        注:创建时间事件可以读取类似,[R(选中),如果$分钟GO P = 100%,达到FIN。这将确保该会议将结束,如果有在后的设定阈值operandum任何活动; 会话将超时动物隐瞒的强化物配对operandum了设定的时间段响应后。
      5. 选择添加“活动回到”。
      6. 检查“R”框中,输入1到第一个文本框,选择适当的operandum从第一个下拉框中的释放,而从送下拉框中选择“S2”。
        注:创建的事件可以读取类似,[R(检查)后$ [1]主动GO P = 100%,到S2。此步骤确保于operandum释放(方括号如上所述),这个状态重新进入,以此来重置会话超时阈值(4.4.9.4)。此时,状态将退出当包含在列表中的渐进比完成时(步骤4.4.9.2)或会话超时(步骤4.4.9.4)。因此,每当该operandum被激活时,它计数为逐步比。 ,而且,每次的operandum失活的时间; 在杆被释放或鼻子戳退出,会话超时阈值(步骤4.4.9.4)复位图2表示编程“S2所有过渡-公关回应。 “

    图2
    图2.代表性的编程实例#2。在这里,状态在以下两种条件退出。大号$是4.3步创建的渐进比时间表。经日程COMPLET离子,国家退出到状态3(S3)。注意,该标准不具有R,其允许日程表前进,而不是再次开始在每次重新进入这个状态。国家还可以经过“$”分离开来说明FIN。这是预定的超时阈值后,如果没有响应该窗口中发生的会话将终止。这将在讨论进一步的解释。最后,会话超时阈值后,每operandum释放复位。因此,“[1]”表示operandum释放'1'。

    1. 突出“S3 - PR增强剂和提示。”
      1. 选择“添加时间去'
      2. 输入适当的时间和单位从送下拉框中提供的增强剂($),然后选择“S4”。
        注:创建时间事件可以读取类似[之后$秒钟GO P = 100%,至S4。
    2. 突出“S4 - 超时。” 选择添加“时间转到'
    3. 输入适当的时间和单位仍然处于非活动状态($)以下增强剂交付,并从送下拉框中选择“S2”。
      注:创建时间事件可以读取类似[之后$秒钟GO P = 100%,到S2。状态'S4 - 超时'可以不需要所有设计。
  5. 选择解决国家。
    注:此协议是现在就可以运行。

Representative Results

在这里,我们示出了可与上述方法获得的结果的例子。所示的第一是受病毒载体图3)转染的典型区域。在一般情况下,在纹状体组织中获得约1毫米3的转染体积。转染的区域的体积可以在使用卡瓦列的方法的连续切片进行定量32重要的是,转染的体积取决于许多因素,例如组织的转染的类型。病毒血清型;子;语速和音量注射;注入的粒子数;注射液pH值;和是否高渗试剂,例如甘露糖醇,使用了33,34典型地,我们microinject 10 12个粒子/ ml,1微升/侧,在10分钟,并允许额外的7分钟之前更换密闭装置。此外,注射液通常是约pH 8。接下来,我们表明,动机可以通过转基因表达被操作图4)或药理学试剂的显微注射图5)。

图4中,我们表达了设计师受体由设计师药物(DREADDs)独家激活。所述DREADD受体编码区之后是一个内部核糖体进入位点和一个mCitrine盒。所述mCitrine允许转染的细胞的方便可视化。该DREADD偶联至异G蛋白Gαq。所述Gαq耦合DREADD的活化可刺激星形细胞,28,35和DREADD本身可以通过氯氮平-N-氧化物(CNO,3毫克/ kg,腹腔)的全身给药被激活。14,22,36训练大鼠杠杆回应乙醇加固,其中3杠杆压力机产生1机会在超过60个连续几天每天1小时的会议喝酒。其次,老鼠被迫禁欲,和Gαq偶联DREADDs表达的伏隔核核心的星形胶质细胞。经过3周禁欲的动机自我ADMI尼斯特尔乙醇通过断点测量。21,27-30激活核伏隔核星形胶质细胞,经全身CNO管理,降低大鼠的积极性恢复乙醇的自我管理后禁欲相比,车辆。重要的是,CNO在这被表达绿色荧光蛋白代替DREADD同样受过训练队列没有影响。

图3
通过显微注射病毒转染的图3代表腹侧纹状体区域。此图说明核的区域伏按照上述方法转染星形胶质细胞。数据从公牛等13重印版权持有人的许可。详情可在出版物和所附补充材料中找到。空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.动机大鼠自己服用乙醇的减少通过激活转基因,这是过度表达于伏核的核心星形胶质细胞。病毒微量注射和通过断点测定动机允许一个星期的病毒表达后。转基因表达的是一个设计师受体由设计师药物(DREADDs)独家激活。甲单向ANOVA(F(2,30)= 3.29,p值= 0.04),随后是薛费事后表明活化DREADD的氯氮平-N-氧化物的全身施用(CNO,3毫克/ kg,腹腔)显著降低,而不是对DR大鼠自我管理乙醇戒断后的动机相比车辆CNO在这被表达绿色荧光蛋白(GFP同样受过训练队列没有影响)EADD。数据从公牛等13重印版权持有人的许可。详情可在出版物和所附补充材料中找到。

图5
图5的显微注射的间隙连接阻滞剂增加大鼠的动机禁欲后自己服用乙醇的两个间隙连接阻滞剂进行了评价的大鼠上的动机它们的效果(通过断点测量)自己服用乙醇甲氟喹和18- α-甘草次酸(18-α)。的双向方差分析表明,显微注射的间隙连接阻滞剂到伏隔核芯大鼠的动机增加自己服用禁欲后乙醇(F(3,40)= 5.56,p值= 0.003)。数据从公牛等13重印版权持有人的许可。细节可以在该出版物中找到并且附带的补充材料。

Discussion

这里介绍的方法是制造显微注射插管和microinjectors将阐明的动机的行为的分子底物辅助的有效手段。此方法提供了几个优点。首先,通过制造自己的植入物和microinjectors,新颖的实验参数可以迅速地优化;也就是,一个不需要等待定制组件到达。第二,由于小直径的套管,多个套管可以同时注入。这缩短了所需的手术时间,从而可提高生存性,而且还允许每只动物的多个植入物。第三,用于控制操作室的软件容易地适应渐进比时间表自一个固定的比率范例可以迅速地通过简单地施加含有所需强化程序的事件过渡参数列表转换为渐进比范例。

成为广泛有用的,但是一般的显微注射过程被提出,应该是广泛地适用于现有的几乎任何试剂的显微注射。因此,我们预期,这种技术将继续以类似的高实用程序在将来有轻微变形。通过只改变几个变量,这种方法可以应用到试剂的宽数。这将最常被操纵参数包括该微量从套管伸出的长度,注射的体积,以及注射速度。例如,人们可能想要喷射器,以进一步从套管末端突出,以避免神经胶质疤痕,通常形成围绕慢性植入物。此外,人们可能希望注入量较大。为纹状体病毒显微注射,1微升的体积中通常使用这种卷典型地注入在一段较长的时间(通常10 - 10分钟加3 - 10分钟额外扩散时间)相比,使用d表示药物试剂(通常为0.3 - 0.5微升了2 - 3分钟加1 - 3分钟附加的扩散时间)。用户应该查阅文献和/或凭经验确定最适合自己需要的参数。无论如何,这个过程的成功是关键取决于4个变量:1)套管的长度,2)微量长度,3)微量喷雾图案的注射前的质量,以及4)系统的完整性。因为显微注射位置取决于该微量从套管伸出的深度,当务之急是两插管(步骤1.2.8)和微量长度(后弯曲,步骤2.2.1)都精确所有受试者之间已知的和均匀的。这可以容易地通过容易地拒绝任何实施不是在最终重新测量所需的长度来控制。此外,注射位置只能如果它立即发生的引导套管下方预测。因此,任何微量能源部在测试不是喷长,细流(步骤2.4.6),应予以拒绝。甲质量注射还涉及该系统的完整性在注射前。如果分配所有的水从注入后(装填试剂之前)多点是在实验室观察擦拭,然后泄漏需要纠正(请注意:步骤2.4.8)。此外,如果气泡(步骤2.4.9),其从水在PE20管分离所述药物是不是一个,单泡(填充试剂的微量之后),则喷射器部分堵塞。这种堵塞既可以防止或转移注射。这也可以很容易地补救(注上的步骤2.4.8)。

如果一个希望microinject而动物是在立体框架有三个备选方案。首先,人们可以增加微量颈圈,使得它可以通过立体定向操纵器牢固地保持并延伸得足够远以允许连接到PE20管道的长度。第二,上Ë可以暂时植入插管,并使用标准的微量这里介绍。第三,人们可以使用拉伸和抛光玻璃吸管16,17

这里提出的步骤的一个显著限制是,最好是在良好的处理大鼠中所熟悉的方法进行。因为同样的调查处理的大鼠,每天超过2个月的用于在结果部分中描述的数据大鼠不需要特别的处理程序。这包括每日观察手术植入物和操纵至少2周。然而,大鼠可迅速通过多种技术,用于前预脉冲抑制试验,这可受应力习惯于。这些特殊习惯化技术已被很好地先前详述。43除了这些程序,可取的做法是可以的大鼠习惯于其中缩短microinjectors使用杜显微注射过程环'假'注射。在这些假注射剂,可以认为微量不会突出到组织,以限制组织损伤是至关重要的。换句话说,该微量应不超过14毫米弯曲。因此,需要对这种技术的最佳实施彻底的习惯可能被视为一种限制。

虽然若干行为范例存在测量动机,所述进行比通常用于量化该受试者愿意施加以获得加强件的工作。渐进比范例产生被称为断点的量度,其通常被定义为在最后一个完整比杠杆压力机的最大数目; ,最大响应生成一个加强件21的渐进比是敏感的加强件大小。例如,更高的可卡因(或蔗糖)的剂量产生较高的断点和低级可卡因(或蔗糖)的剂量得到降低breakpoint。21,22因此,断点为动机和/或增强功效的常规使用的代理。21,23-26由于断点的意图是确定当动物停止响应,逐步比范例的一个重要参数是会议的长度。有限会话长度可以穿上断点值的假帽,这可以通过预治疗,异常降低的自我管理,或增加后加固暂停的速度加剧。这变乱可以通过任何数目的方法来克服。 例如 ,会话终止时动物已经版主由平均内输注间隔的某一倍数响应44这种方法的一个更普遍应用于变型是终止会话一次响应具有被扣缴一些保持跨学科常凭经验确定的值。我们已经提供了应用这种方法的步骤4.4.9.11的方法。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cannula Tubing Amazon Supply/ Small Parts HTXX-26T-60 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
Obturator Amazon Supply/ Small Parts GWXX-0080-30-05 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
Microinjector Wire MicroGroup 33RW 304 33 gauge
Super Glue Loctite 3924AC Liquid, Non-gel, can be autoclaved
Microinjector Plastic Tubing Becton Dickson 427406 PE20
Medium Weight Hemostats World Precision Instruments 501241-G
Ruler Fisher 09-016 150 mm
#7 Forceps Stoelting 52100-77 Dumont, Dumostar
Rotary Tool Dremmel 285 Two-speeds
Cut-off Disc McMaster Carr 3602 15/16" x 0.025"
Microinjection Pump Harvard Apparatus PhD 2000
1 ul Glass Syringe Hamilton 7001KH Needle Style: 25s/2.75"/3
Cotton Tipped Applicator Fisher 23-400-101
Lab Wipes Kimwipes 34133
Operant Software Coulbourn Graphic State
Operant Chambers Coulborun Habitest

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References

  1. Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35, (1), 217-238 (2010).
  2. Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6, (6), 339-344 (2006).
  3. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229, (3), 453-476 (2013).
  4. Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35, (3), 912-938 (2011).
  5. Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37, (3), 770-786 (2012).
  6. Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30, (35), 11771-11780 (2010).
  7. Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72, (3), 221-227 (2012).
  8. Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42, (2), 269-281 (2004).
  9. Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
  10. Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19, (12), 1295-1304 (2014).
  11. McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21, (21), 8655-8663 (2001).
  12. Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26, (13), 3584-3588 (2006).
  13. Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53, (2), 138-146 (2001).
  14. Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
  15. Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14, (1), 22-24 (2011).
  16. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
  17. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
  18. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
  21. Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66, (1), 1-11 (1996).
  22. Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6, (2), 127-132 (1995).
  23. Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31, (8), 1614-1624 (2007).
  24. Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
  25. Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, (3483), 943-944 (1961).
  26. Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45, (3), 539-548 (1993).
  27. Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (34), 12533-12538 (2008).
  28. Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39, (12), 2835-2845 (2014).
  29. Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34, (9), 1565-1573 (2010).
  30. Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65, (5), 682-694 (2010).
  31. Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
  32. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, (Pt 3), 229-263 (1987).
  33. Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3, (2), 225-232 (2001).
  34. Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11, (2), 327-331 (2005).
  35. Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591, (22), 5599-5609 (2013).
  36. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104, (12), 5163-5168 (2007).
  37. Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101, (33), 12364-12369 (2004).
  38. Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23, (5), 550-557 (2008).
  39. Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
  40. Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20, (16), 6210-6217 (2000).
  41. Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
  42. Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9, (5), 631-638 (1978).
啮齿动物脑显微注射学习动机行为的分子基板
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Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018, doi:10.3791/53018 (2015).More

Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018, doi:10.3791/53018 (2015).

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