Protocol
Förfaranden med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Virginia Commonwealth University och följa NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Framställning av Redskap Före kirurgi och mikroinjektion
- Ställ upp för materialberedning:
- Skaffa 26 G kanyl slang, 33 G obturator tråd, 33 G mikroinjektion nål slangar, microinjector plastslang (PE20 eller motsvarande), två medeltjockt raka peanger, lab tejp, linjal, märkpenna, 70% etanol (v / v), lagring flaskor (t.ex., 20 ml glasskintillations), superlim, små väger båtar, och roterande verktyget försett med ett icke-tung brytskiva.
Observera: Säkra roterande verktyget till en pipettspets ruta med hjälp av remmar eller band är bra, eftersom det höjer verktyget. Bära ögonskydd är viktigt för att undvika skador vid användning av ett roterande verktyg. - Bifoga en bitlab eller autoklav band till bänken.
- Skaffa 26 G kanyl slang, 33 G obturator tråd, 33 G mikroinjektion nål slangar, microinjector plastslang (PE20 eller motsvarande), två medeltjockt raka peanger, lab tejp, linjal, märkpenna, 70% etanol (v / v), lagring flaskor (t.ex., 20 ml glasskintillations), superlim, små väger båtar, och roterande verktyget försett med ett icke-tung brytskiva.
- Framställning av kanyler:
Obs: Minst två kanyler krävs per råtta för en bilateral injektion. Ytterligare en kanyl kommer att användas i ett senare steg.- Skaffa en sektion av kanyl rör av tillräcklig längd för att undvika böjning under processen för märkning och skärning.
- Rita en 15 mm referenslinje på bandet från steg 1.1.2 med hjälp av en spetsig penna. Detta kommer att fungera som en vägledning för märkning av sekventiella 15 mm sektioner på slangen med en vass permanent markör.
- Tryck kanylen slangen, vid markerade punkter, till den långsamma snurrbrytskivan hos det roterande verktyget för att notch slangen. Rotera kanylen 180˚ och Notch den motsatta sidan av slangen. Skär inte genom slangen helt, eftersom det kan leda till ocklusion.
- Kraftigt böja slangen för att dela upp den i ~ 15 mm sektioner.
- Håll varje skär änden av kanylen är vinkelrät mot brytskivan mellan tummen och pekfingret. Vrid kanyl slangen medan du rör spetsen till den stora främre ytan av cut-off-skiva (dvs. inte kanten). Detta kommer att generera en trubbiga spets. Obs: Böj inte kanylen, för det skulle kunna ge en off-site injektion.
- Ream båda ändarna av kanylen med en 26 G avfasad nål (brun nav) för att se till att alla grader har tagits bort och att kanylen är fri.
- Passera ett urval av obturatorn tråd klippa till ~ 35 mm genom snittet kanylen för att verifiera att det inte finns några interna hinder.
- Plocka upp varje kanyl individuellt med hjälp av ospänt peanger och mäta varje avslutad kanyl med en linjal för att se till att det är exakt 14 mm i längd.
- Framställning av tätningsanordningar:
- Klämma en kanyl på ungefär halv längd med medeltung, raka peanger. Lägg den låsta hemostat på bänken. Kanylen bör vara vinkelrät mot bänken.
Obs: Denna kanylbör inte användas vid kirurgi efter att ha hållits av låsta peanger, eftersom det är sannolikt böjd. - Mata ena änden av obturatorn kabeln i kanylen tills den har nått bänken. Bounce tråden i kanylen för att säkerställa att en Burr inte hindrar den från att nå bänken,. Dvs når botten av kanylen. Korrekt obturator längd kommer att förhindra igensättning och ytterligare vävnads ärrbildning.
- Böj tråden genom att nypa med fingrarna tills en ~ 30˚ vinkel uppnås utan att förlora kontakten mellan obturatorn och bänken. Se till att vinkeln av bojen är sådan att den fast jäms med huvud mössa, och överskottet är vänd framåt, vilket gör det svårare för råttan att avlägsna.
- Ta bort kabeln från kanyler och avbröt överskjutande del på ~ 2,5 mm från böjen med små diagonala fräsar (avbitare).
Obs: Minst två obturatorer kommer att krävas per råtta för en bilateral injektion, eftersom varje implanterad kanyl kräver en obturator. Skapaen ytterligare ~ 35˚ böj halvvägs genom obturatorn kommer också att hjälpa till att förhindra avlägsnande av djuret. Lagra både kanylerna och tätningsanordningar i separata flaskor (t.ex.., 20 ml glasskintillations) innehållande 70% etanol (volym / volym) tills användning, men åtminstone O / N.
- Klämma en kanyl på ungefär halv längd med medeltung, raka peanger. Lägg den låsta hemostat på bänken. Kanylen bör vara vinkelrät mot bänken.
- Framställning och testning av microinjectors:
- Skaffa en bit microinjector nål slang som är ~ 1 m lång.
- Håll ena änden av microinjector slangen vinkelrätt med låsta raka peanger.
- Twist hemostat samtidigt hålla spänningen på slangen till spolen den tätt runt hemostat minst en gång.
- Mät 32 mm från den motsatta, lösa änden av microinjector slangen och att förstå denna punkt i rät vinkel med en andra rak, medeltung hemostat och lås dem. Ta tag i microinjector slang med peanger på sidan av de 32 mm markera närmast den lösa änden i stället för på sidan närmast hemostat med lindade tråden.
- Bend slangen och tillbaka samtidigt hålla spänningen på slangen tills den bryts.
Anmärkning: Ett enda, skarp uppåt och nedåt böj kommer att producera en trubbig brytning, vilket är önskvärt för att säkerställa att mikroinjektion sker i önskad hjärnregion. - Inspektera microinjector slang för att säkerställa att båda ändar är raka och att innerdiametern är fri.
- Förvärva kanyl slang som kommer att användas för att tillverka en mikroinjektor krage.
- Mät och markera sekventiella 5 mm sektioner av kanyl slang med hjälp av en märkpenna och en 5 mm referens linje dragen på band (steg 1.1.2).
Obs: Varje microinjector kräver en krage. Kragar är helt enkelt korta kanyler anslutit sig till microinjector tråden. - Tryck kanylen slangar, på markerade punkter, den långsamma spinning cut-off-skiva av roterande verktyg för att hack slangen. Rotera kanylen 180˚ och Notch den motsatta sidan av slangen. Cutting helt kan täppa till slangen.
- Kraftigtböja microinjector krage slang för att dela upp den i ~ 5 mm sektioner.
- Brotscha innerdiametern hos båda ändarna av kragen med en 26 G avfasad nål (brun nav) för att säkerställa att de flesta av graderna har avlägsnats. Några små grader kommer att fånga microinjector tråd och därmed underlätta limning.
- Skjut en krage på varje microinjector rör ~ 2 cm från slutet.
- Skapa en liten pool av superlim i hörnet av en liten väg båt.
- Använd skrot kanyl slang kapas till ~ 25 mm för att tillämpa en liten mängd superlim till microinjector röret ~ 5 mm från ena änden. Nästa Skjut kragen över denna super limsträngen så att det är ~ 1 mm från slutet av mikroinjektion röret. Täck båda ändarna av kragen med lim.
Obs! Undvik en stor ansamling av superlim på kragen, eftersom det kommer att förhindra plastslangen från tätning runt microinjector. Även om det är viktigt att undvika att få superlim på den öppna änden av microinjector slangar, eftersom detta kommer att göramicroinjector oanvändbar, är det också viktigt att glida kragen så nära slutet som möjligt för att minimera void (icke-injicerade) volym. - Luta avslutade microinjector på utsidan av en annan liten väger båt med kragen uppåt och låt torka i 24 timmar.
- Skaffa en ~ 8 cm bit microinjector plaströr (PE20 eller motsvarande), 1 ml spruta fylld med sterilt vatten, och 26 G avfasade nål (brun hubb).
- Bifoga en 26 G (brun hub) nål för att spruta och skjut skurna slangen på nålen, se till att inte punktera röret.
- Skjut plaströr över kragen änden av den torkade, komplett microinjector.
- Pressa den vattenfyllda sprutkolven till testet för öppenhet.
Obs: Vatten bör spraya mycket långt och rakt ut ur microinjector spets. Om strömmen inte är rak, kommer injektions plats inte vara korrekt. Källan till en sidledes eller diffus spray är en dålig paus (steg 1.4.5). En microinjector bör intet användas om sprayen är sidled eller diffus. Saline bör inte användas, eftersom det kan täppa microinjector eller nålen. - Dra sprutan tillbaka för att avlägsna vatten från microinjector. Förvaras torrt, förseglad flaska, till exempel en 20 ml glasscintillationsbehållare.
Obs: Microinjectors kan autoklaveras efter tillverkningen med de flesta super lim, 31 men detta måste bestämmas empiriskt. Alternativa steriliseringstekniker innefattar etylenoxid och gammastrålning.
2. Förberedelser för och Performing microinjections
- Skaffa förda microinjectors, microinjector plaströr (PE20 eller motsvarande), mikroinjektion pump, två små väger båtar, sterilt vatten, 70% etanol (volym / volym), aceton, två gastätt 1 pl glassprutor med en trubbig nål (25 G), bomull tippas trä applikatorer, reservdelar obturatorer, 1 ml spruta, 26 G (brun nav) nål, små böjda pincett (stil # 7 rekommenderas), och lab weuroinfoställen.
- Förbereda microinjectors för injektion:
- Böj avslutade microinjector 15 mm från änden motsatt kragen så att vinkeln mellan de två är ~ 95˚.
Obs: En exakt böj läge är absolut nödvändigt för korrekt injektions plats. Använda # 7 pincett (eller liknande) för att greppa microinjector och bockning uppåt är användbar. Alltid åter mäta längden innan du utför microinjections. - Skär plastslang (PE20) till ~ 70 cm och glida över microinjector kragen.
Obs: Lägga tejpflikar till ett plaströr nära både microinjector och lösa änden är användbar när du fyller injektioner, speciellt när du injicerar två olika lösningar. Flikar rekommenderas inte för båda rören när de blir besvärligt under injektionen.
- Böj avslutade microinjector 15 mm från änden motsatt kragen så att vinkeln mellan de två är ~ 95˚.
- Förberedelse pump för mikroinjektioner:
- Slå på pumpen.
- Ställ diameter mikroinjektion nål, önskad infusionshastighet och rikta injektionsvolym.
Obs: Infusions råttae och injektionsvolymen är beroende av experimentella krav. Detta närmare i diskussionen. Vissa pumpar har sprut tabeller förinstallerade. Om inte, kan en spruta tabell hittas på hemsidan tillverkning (s). - Ställ pumpläget till "Volym", så att en exakt volym levereras automatiskt. Om "Pump" -läge har valts istället måste försöksledaren manuellt stoppa pumpen.
- Justera pumpbackspärr för att tillåta sprutan för att fylla på injektionsvolymen plus ytterligare 0,2 l.
- Förbereda mikroinjektion spruta och microinjector för injektion:
- Lås varje gastät mikroinjektion spruta in racket av mikroinjektion pumpen.
- Placera spetsen på gastäta sprutan i sterilt vatten i en liten väger båt och försiktigt fladdrar kolven att smörja den inre tråden. Jämnt dra kolven till anslaget på pumpen för att fylla med vatten.
- Skjut PE20 slangen som är connected till microinjector (i steg 2.2) på en 26 G (brun hub) nål fäst till en 1 ml spruta som är fylld med sterilt vatten. Spraya sterilt vatten genom microinjector och inspektera sprutmönster och avstånd.
Obs: Vatten bör spraya mycket långt och rakt ut ur microinjector spets. Om strömmen inte är rak, kommer injektions plats inte vara korrekt. - Placera steriliserade microinjector på ett sterilt område.
- Skjut slangen bort från nålen, hålla microinjector slangen upprätt för att förhindra vatten från att droppa ut samtidigt skär slangen nedanför området skadats av nålen.
- Skjut mikroinjektion sprutkolven något framåt för att skapa en liten droppe på änden av nålen och skjut den vattenfyllda PE20-slang (som är ansluten till microinjector) på nålen.
Obs: Detta kommer att skapa en vätske-to-liquid anslutning som gör att lämpliga mottryck som kan rubba en träsko som kan bildas vidspets microinjector. - Tryck in kolven helt emot att förbereda sig för prov lastning och se till att inga spår etanol kvar i microinjector.
- Kontrollera inställningarna för läckor genom att trycka på vattendroppen som bildas vid spetsen av microinjector till en ren lab torka flera gånger.
- Obs: När du trycker till labbet torka, bör endast en våt fläck bildas. Om det finns fler droppar, det finns en läcka i systemet.
- Undvik läckage genom att kontrollera superlim ansökan (steg 1.4.14) och genom att trimma PE20 slangen med vass sax eller ett rakblad som helst att PE20 slangen tas bort från något samband. Dessutom, upprepa steg 2.4.3 till 2.4.8 för att åtgärda läckan.
- Dra sprutkolven tillbaka 0,2 pl; skapa en bubbla mellan det sterila vattnet i PE20 slangen / microinjector och den lösning som skall injiceras.
- Obs: Denna bubbla förhindrar utspädning av injektatet, förorening av vattnet, och gör det möjligtför övervakning av injektionsprocessen, eftersom den kommer att röra sig under injektionen. En enda, fast bubbla ska produceras. Om det är bruten, finns en läcka närvarande eller microinjector tips är tilltäppt; vilket tyder på att steg 2.4.8 (och den medföljande anmärkning) ska upprepas.
- Placera microinjector i reagens som ska injekteras och långsamt dra sprutkolven till anslaget.
- Förbereda djur för injektion:
- Håll råttans bröstet mot försöks bröst. Rengör området runt kanylerna med en bomulls applikator indränkt i 70% etanol (v / v).
- Obs: Med rätt hantering kan möss försiktigt fastspända i en kupad hand. Annars kan scruffing krävas.
- Ta obturatorer med små pincett och plats i väg båt med 70% etanol (v / v).
- Performing injektioner:
- Placera fylld microinjector (steg 2.4.10) i kanylen. Tryck på start på mikroinjektion pump och övervaka bubbla rörelse.
- Obs: Det may bli nödvändigt att tillämpa lätt tryck för att säkerställa att microinjectors inte lyfta. Bubblan (bildad i steg 2.4.9) bör ett enhetligt framåt och fullt in i microinjector.
- Ta bort microinjectors från kanylen och ersätta obturatorer, när injektionen är klar och efter injektionen diffusion perioden har gått.
- Obs: Typiska efter injektion diffusionstider är 2-4 minuter för farmakologiska reagenser, och 2-10 minuter efter virus. Lämnar microinjector i under efterinfusionsperioden förhindrar injektatet från återloppskokande tillbaka uppför kanyler snarare än diffundera in i vävnaden. Placera tätningsanordningar på sidan av etanolen fyllda väga båt för att göra det möjligt för etanol för att rinna innan du sätter tillbaka in i kanylen.
3. Post-Injection Clean Up
- Skaffa en liten flaska av varje: sterilt vatten, 70% EtOH, och aceton.
- Rengöring microinjector och mikroinjektion spruta:
- Ta bort glassprutas från pump spruta rack och mikroinjektion slangen från glasspruta.
- Koppla microinjector slangen från glasspruta och bifoga en 1 ml spruta fylld med sterilt vatten till microinjector slangen via en 26 G nål (brun hubb). Tryck 1 ml sprutkolven fram emot att utvisa ~ 0,3 ml. Därefter trycker du på spetsen av microinjector till en labb torka och dra luft tillbaka genom microinjector.
Obs! Microinjector och slangar kan återanvändas för liknande experiment om det bedöms försiktig. - Placera glasinjektionsnålen i sterilt vatten och dra kolven helt tillbaka. Nästa, tryck kolven helt emot att spola. Tryck på glas sprutspetsen till arbetskraft torka för att säkerställa att ingen vätska finns kvar.
- Upprepa steg 3.2.3 med sterilt vatten, luft, 70% EtOH och aceton i följande ordning: sterilt vatten, sterilt vatten, luft, luft, 70% EtOH, 70% EtOH, luft, luft, aceton, aceton, luft, luft. Utföra alla dessa rengörings steg bidrar till att bevara mikroinjektion spruta.
- Placera microinjector sprutan (s) till förpackning och dra tillbaka kolven till 0,05 l.
Obs: Detta är viktigt, eftersom det tillåter kolven att skjutas eller dras in för att rubba en fast kolv som kan uppstå bör alla saltavlagringar efter lagring.
4. Programmering av Motivation analys
- Logga in Graphic stat med administratörsbehörighet.
- Välj eller skapa relevant databas.
- Skapa progressiv förhållande förstärkningsschema:
- Välj listor> databasnivå listor> Händelse Transition parameterlistor.
- Välj "Lägg till". Ange lämplig listnummer (L #) och beskrivning.
- Välj "Lägg till händelser".
- Ange första förstärkningsschema värde och välj "Lägg till". Upprepa.
Obs: Värdena kan bestämmas med hjälp av en formel där den progressiva förhållandet schemat = 5e (j * (förstärkare intjänade + 1)) -5 7.För att anpassa denna ekvation att korrekt testa hypotesen måste värdet j bestämmas empiriskt eller erhållas från litteraturen. - Välj "För" inom "Selection Order rutan.
- Välj "Hold värde = till: ____" i den "när du är klar" rutan. Ange förstärkningsschema värde i textrutan som vida överstiger förväntas svara. Detta kommer att vara den nödvändiga insatsen för alla efterföljande poster när listan har uttömts.
- Skapa en försöksprotokoll:
Obs: Graphic State flyttar ämnet genom en rad stater som lämnat baserade på antingen tid eller prestandakriterier. Ställ alla diskreta och kontextuella ledtrådar och parametrar märkta nedan som "$" på lämpligt sätt testa hypotesen som undersöks.- Välj Arkiv> Skapa experiment protokoll.
- Ange önskat protokollnumret och beskrivning i lämplig textruta. Välj "State Creation".
- Ställ in alla stimuli för både "RDY - Ready stat" och "FIN - Färdig stat.
- Välj "Delstaten New" och namnge den "S2 - PR svara.
- Välj "Delstaten New" och namnge den "S3 -. PR Förstärkare och Cue"
- Välj "Delstaten New" och namnge det S4 - Timeout ".
- Markera "S1" och namnge den "S1 -. Tillvänjning"
- Välj Lägg till "Time Gå till."
- Ange lämplig tidpunkt ($) och enheter ($), t ex., Minuter och välj "S2" från TO S listrutan. Tidsenhet "enheter" bestämdes när databasen ursprungligen skapades.
Obs: Den skapade övergångstiden bör läsa liknar [Efter $ minuters GÅR P = 100% TILL S2] Figur 1 är ett exempel på denna händelse en gång skapat.
</ ol>
Figur 1. Representant programmering exempel # 1. I detta fall en tid avgränsat tillstånd illustreras där ett användardefinierat värde av $, som visas här på några minuter, indikerar när det aktuella läget ska avsluta att ange 2 (S2).
- Markera "S2 - PR svara.
- Välj Lägg till "Händelse Gå till."
- Ange listnamn som innehåller den progressiva förhållandet schema som skapades i steg 4.3 i den första textrutan som L $ (t.ex. L1), välja lämplig operandum (t.ex.., Spak eller näsa säcken) från den första listrutan, och välj " S3 "från TO S listrutan.
Obs: Den skapade händelsen kan läsa liknar [IF L $ 1 - Active GO P = 100%, till S3]. Identifieraren 1 - Aktiv utsågs under skapandet databas. Här, en - Aktivhänvisar till operandum ansluten till omkopplaren en. - Välj "Lägg till Time Gå till."
- Kontrollera R anger du lämplig tidpunkt och enheter ($), och välj "FIN" från TO S listrutan.
Obs: Den skapade engångsföreteelse kan läsa liknar [R (markerad) IF $ minuter GÅR P = 100% TILL FIN]. Detta kommer att säkerställa att sessionen avslutas om det inte finns någon aktivitet på den operandum efter den inställda tröskeln,. Dvs att sessionen timeout efter det att djuret undanhåller svara på förstärkare-parade operandum för viss tid. - Välj Lägg till "Händelse Gå till."
- Kontrollera R anger du en i den första textrutan, välj frisättningen av lämplig operandum från första listrutan, och välj "S2" från TO S listrutan.
Obs: Den skapade händelsen kan läsa liknar [R (markerad) Efter $ [1] Aktiv GO P = 100% TILL S2]. Detta steg säkerställer att vid frigöring av operandum(indikeras med parentes ovan), att staten åter in, vilket återställer Session timeout tröskeln (4.4.9.4). Vid denna punkt, kommer staten avsluta när den progressiva förhållandet som finns i listan är klar (steg 4.4.9.2) eller sessions timeout (Steg 4.4.9.4). Sålunda varje gång som operandum aktiveras, räknas det med att gradvis förhållandet. . Och varje gång som operandum inaktiveras, till exempel, är spaken släpps eller näsan poke avslutas, är Session timeout tröskeln (steg 4.4.9.4) reset Figur 2 representerar alla övergångar programmerade för "S2 - PR svara.. '
Figur 2. Representant programmering exempel # 2. Här är staten avslutas på endera av två kriterier. L $ är den progressiva förhållandet schema som skapades i steg 4.3. Vid schema completion, staten lämnar statligt 3 (S3). Observera att detta kriterium inte har en R, som medger att schemat för att avancera stället för att börja på nytt vid varje återinträde i detta tillstånd. Staten kan också avfarten efter "$" minuter att ange FIN. Detta är den förutbestämda timeout tröskel, varefter sessionen upphör om ingen svarar inträffar inom det här fönstret. Detta förklaras närmare i diskussionen. Slutligen är Session timeout tröskeln återställs på varje operandum release. Således "[1]" anger frisättning av operandum '1'.
- Markera "S3 - PR Förstärkare och Cue."
- Välj "Lägg till Time Gå till"
- Ange lämplig tidpunkt och enheter för att leverera förstärkare ($), och välj "S4" från S listrutan.
Obs: Den skapade engångsföreteelse kan läsa liknar [Efter $ sekunder GÅR P = 100% TILL S4].
- Markera "S4 - Timeout".
- Ange lämplig tidpunkt och enheter för att stanna kvar i ett inaktivt tillstånd ($) efter armerings leverans och välj "S2" från S listrutan.
Obs: Den skapade engångsföreteelse kan läsa liknar [Efter $ sekunder GÅR P = 100% TILL S2]. State "S4 - Timeout" kan inte krävas för alla mönster.
Obs: Detta protokoll är nu redo att köra.
Representative Results
Här visar vi exempel på resultat som kan erhållas genom ovanstående procedur. Visas först är ett typiskt område som transfekteras med virala vektorer (Figur 3). I allmänhet är en transfekterad volym av ~ 1 mm 3 erhållen i striatala vävnad. Volymen av den transfekterade regionen kan kvantifieras över seriesnitt med hjälp av Cavalieri metod 32 Viktigt är att transfekterade volymen beror på många faktorer, såsom typ av vävnad som transfekteras. virala serotyp; promotor; hastighet och volym injiceras, antalet partiklar injicerade; injektat pH; och om hyperosmolära reagens, såsom mannitol, användes. 33,34 Vanligtvis vi mikroinjicera 10 12 partiklar / ml, 1 l / sida under 10 minuter och låt 7 ytterligare min före ersätta obturatorer. Dessutom är injektatet allmänhet omkring pH 8. Därefter visar vi att motivationen kan manipuleras antingen transgenexpression (Figur 4)eller farmakologisk reagensmikroinjektion (Figur 5).
I figur 4, uttryckte vi en Designer Receptor Exklusivt Aktiveras av designer drugs (DREADDs). Den DREADD receptor kodande regionen följt av en inre ribosominträdesställe och en mCitrine kassett. Den mCitrine möjliggör bekväm visualisering av transfekterade celler. Den DREADD kopplades till heterotrimera G-protein Gαq. Aktivering av Gαq kopplade DREADD kan stimulera astrocyter, 28,35 och DREADD själv kan aktiveras genom systemisk administration av klozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip). 14,22,36 Råttor tränas att spak svara för etanol förstärkning, där 3 hävarmspressar gav en chans att dricka under dagliga 1 tim sessioner under 60 sammanhängande dagar. Nästa råttor tvingas in avhållsamhet, och Gαq kopplade DREADDs uttrycktes i nucleus accumbens kärn astrocyter. Efter 3 veckors avhållsamhet, motivation att själv admi Nister etanol mättes genom brytpunkt. 21,27-30 Aktivering av nucleus accumbens kärn astrocyter via systemisk CNO administration, minskade motivationen hos råttor att återuppta etanolsjälvadministration efter avhållsamhet jämfört med vehikel. Viktigt, CNO hade ingen effekt i en lika utbildad kohort som uttryckte grönt fluorescerande protein i stället för DREADD.
Figur 3. Representant ventrala striatum region transfekterades genom mikroinjicerade virus. Den här bilden visar regionen av nucleus accumbens astrocyter som transfekterades genom att följa ovanstående metod. Data omtryckt från Bull et al. 13 med tillstånd från upphovsrättsinnehavaren. Detaljer återfinns i denna publikation och tillhörande kompletterande material.blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Motivation av råttor att själv administrera etanol minskas genom att aktivera en transgen som var överuttryckt i nucleus accumbens kärn astrocyter. Virus mikroinjicerades och motivation mäts via brytpunkt efter att ha tillåtit en vecka för viruset att uttrycka. Transgenen uttryckte var en Designer Receptor Exklusivt Aktiveras av designer drugs (DREADDs). En en-vägs ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04) följt av ett Scheffé post hoc visade att aktivering av DREADD genom systemisk administrering av klozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip ) reducerade signifikant motivation hos råttor att själv administrera etanol efter avhållsamhet jämfört med vehikel CNO hade ingen effekt i en lika utbildad kohort som uttryckte grönt fluorescerande protein (GFP) i stället för DREADD. Data omtryckt från Bull et al. 13 med tillstånd från upphovsrättsinnehavaren. Detaljer återfinns i denna publikation och tillhörande kompletterande material.
Figur 5. Mikroinjektion av gap junction blockerare ökade motivationen hos råttor att själv administrera etanol efter avhållsamhet Två gap junction blockerare utvärderades för deras effekt på motivation (mäts via brytpunkten) hos råttor att själv administrera etanol. Meflokin och 18- a-glycyrretinsyra (18-α). En två-vägs ANOVA visade att mikroinjektion av gap-junction blockerare i nucleus accumbens kärnan ökade motivationen hos råttor att själv administrera etanol efter avhållsamhet (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Data omtryckt från Bull et al. 13 med tillstånd från upphovsrättsinnehavaren. Detaljer återfinns i denna publikation ochden åtföljande kompletterande material.
Discussion
Tillvägagångssättet som presenteras här är ett effektivt sätt att tillverka mikroinjektion kanyler och microinjectors som kommer att hjälpa att belysa molekylära substrat av motiverat beteende. Denna metod har flera fördelar. Först genom att tillverka sina egna implantat och microinjectors, nya experimentella parametrar kan snabbt optimeras, dvs behöver man inte vänta på skräddarsydda komponenter att komma fram. För det andra, på grund av den lilla diametern hos kanylen, fler kanyler kan samtidigt implanteras. Detta förkortar krävs kirurgisk tid, vilket kan förbättra överlevnadsförmåga, och tillåter också flera implantat per djur. För det tredje, den programvara som används för att styra operant kammare rymmer lätt progressiva förhållandet scheman sedan ett fast förhållande paradigm snabbt kan omvandlas till en progressiv förhållande paradigm genom att helt enkelt applicera en händelse övergångsparameterlista som innehåller den önskade förstärkningsschema.
Att varai stort sett bra, var en generisk mikroinjektion förfarande presenteras som bör vara brett tillämpbar för mikroinjektion av nästan alla reagens för närvarande finns. Därför räknar vi med att denna teknik kommer att fortsätta att vara av liknande hög användbarhet i framtiden med mindre modifiering. Genom att bara ändra några variabler, kan tillämpas denna inställning till ett stort antal reagens. Parametrar som oftast skulle manipuleras innefattar den längd som microinjector skjuter ut från kanylen, injektionsvolym, och injektionshastighet. Till exempel kan en vill injektorn att skjuta ut längre från kanylens spets för att undvika gliaceller ärr som typiskt bildas runt kroniska implantat. Dessutom kan man önska att injicera en större volym. För striatala virusmikroinjektioner, är en volym av 1 mikroliter användes typiskt och denna volym är typiskt injiceras under en längre tidsperiod (ofta 7-10 min plus tre - tio minuter extra diffusionstid) jämfört med denna användningd för farmakologiska reagenser (typiskt 0,3 - 0,5 mikroliter över 2 - 3 min plus 1 - 3 min ytterligare diffusionstid). Användaren bör konsultera litteraturen och / eller empiriskt bestämma parametrarna bäst lämpade för deras behov. Oavsett, är framgången för detta förfarande kritiskt beroende av 4 variabler: 1) kanyllängd, 2) microinjector längd, 3) Kvaliteten på microinjector spraymönster, och 4) systemets funktionsduglighet före injektion. Eftersom mikroinjektion läge är beroende av det djup som microinjector skjuter ut från kanylen, är det absolut nödvändigt att både kanyler (steg 1.2.8) och microinjector längd (efter-böjning, steg 2.2.1) är båda exakt känd och likformig mellan alla ämnen . Detta kan enkelt styras med lätt avvisa alla redskap som inte är önskad längd vid den slutliga re-mätning. Dessutom kan injektionen plats endast förutsägas om den inträffar omedelbart nedanför styr kanylen. Således någon mikroinjektor som does inte spraya en lång, fin ström vid provning (steg 2.4.6) bör förkastas. En kvalitet injektion är också relaterad till integritet systemet före injektion. Om efter doseringen allt vatten från injektorn (före fyllning med reagens) flera fläckar observeras på laboratorie torka, sedan en läcka måste åtgärdas (Notera på steg 2.4.8). Vidare, om bubblan (steg 2.4.9) som separerar läkemedlet från vattnet i PE20 slangen inte är en, enda bubbla (efter fyllning microinjector med reagens), då injektorn är delvis igensatt. Denna täppa kan antingen förhindra eller avleda injektionen. Även detta kan lätt åtgärdas (Obs på steg 2.4.8).
Ska man vill mikroinjicera medan djuret är i stereotaxic ramen finns tre alternativ. För det första kunde en öka längden på microinjector kragen så att den kan hållas fast av stereotaxic manipulatorn och även sträcka sig tillräckligt långt för att tillåta anslutning till PE20-slang. För det andra, påe kan temporärt implantera en kanyl och använda standard microinjector presenteras här. För det tredje, en kunde använda dras och polerade glaspipetter. 16,17
En betydande begränsning av förfarandet som presenteras här är att det är bäst bedrivs i väl hanteras råttor som är bekanta med förfarandet. Råttor som används för de uppgifter som beskrivs i avsnittet resultat krävs hantering inga speciella rutiner eftersom samma utredare hanteras råttorna dagligen i över två månader. Detta inkluderade daglig observation och manipulering av kirurgiska implantat för minst 2 veckor. Emellertid kan råttor snabbt habituated genom ett antal tekniker som används för att före förpulsen inhibitionsanalysen, som kan påverkas av stress. Dessa särskilda tillvänjning tekniker har varit snyggt detalj tidigare. 43 Förutom dessa förfaranden, är det lämpligt att råttor ska vana vid mikroinjektion förfarande där förkortade microinjectors används during "simulerad" injektioner. Under dessa simulerade injektioner, är det viktigt att microinjector inte sticka in i vävnaden för att begränsa vävnadsskada. Med andra ord bör microinjector böjas inte längre än 14 mm. Sålunda kunde grundlig tillvänjning krävs för optimalt genomförande av denna teknik ses som en begränsning.
Medan flera beteende paradigm finns för att mäta motivation, är den progressiva förhållandet vanligen används för att kvantifiera den ansträngning som motivet är villig att utöva för att få en förstärkare. Den progressiva förhållandet paradigm ger ett mått som kallas brytpunkt, som ofta definieras som det maximala antalet hävarmspressar i det senast avslutade förhållandet,.. Dvs maximal svarar som genererade en förstärkare 21 progressiva förhållandet är känslig för förstärkare storlek. Exempelvis högre kokain (eller sackaros) doser producera en högre brytpunkt och lägre kokain (eller sackaros) doser ge en lägre breakpGemensamma. 21,22 Följaktligen är brytpunkt ett rutinmässigt används proxy för motivation och / eller förstärka effekten. 21,23-26 Eftersom avsikten med brytpunkten är att avgöra när djuret slutar svara, en viktig parameter för den progressiva förhållandet paradigm är sessionslängd. Finita sessionslängder kan sätta en falsk mössa på brytpunkts värderingar och detta kan förvärras av förbehandlingar som onormalt minskar graden av självadministrering eller som ökar efter förstärkning paus. Denna FÖRBRYLLA kan övervinnas genom ett antal tillvägagångssätt,.. T.ex. sessioner som avslutas när djuret har undanhållit att svara med en multipel av den genomsnittliga mellan infusionsintervallet 44 En mer allmänt tillämpade variant av denna metod är att avsluta sessioner en gång svara har undanhållits av vissa empiriskt bestämt värde som hålls konstant över ämnen. Vi har gett metoden för att tillämpa denna metod i steg 4.4.9.11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
