Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Virginia Commonwealth University og holder seg til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Utarbeidelse av Redskaper før operasjonen og Mikroinjeksjon
- Satt opp for material forberedelse:
- Skaffe 26 G kanyle tubing, 33 G tetningsmiddel wire, 33 G mikroinjeksjon nål tubing, microinjector plastrør (PE20 eller tilsvarende), to mellomvekt rette hemostats, lab tape, linjal, permanent markør, 70% etanol (v / v), lagring ampuller (f.eks 20 ml glass scintillasjonsmetoder), superlim, små veie båter, og multiverktøy utstyrt med en ikke-heavy duty cut-off plate.
Merk: Feste multiverktøy til en pipette boksen med stropper eller bånd er nyttig, som det løfter verktøyet. Iført vernebriller er viktig for å unngå skade ved bruk av et multiverktøy. - Fest et stykkefra lab eller autoklav tape til benken.
- Skaffe 26 G kanyle tubing, 33 G tetningsmiddel wire, 33 G mikroinjeksjon nål tubing, microinjector plastrør (PE20 eller tilsvarende), to mellomvekt rette hemostats, lab tape, linjal, permanent markør, 70% etanol (v / v), lagring ampuller (f.eks 20 ml glass scintillasjonsmetoder), superlim, små veie båter, og multiverktøy utstyrt med en ikke-heavy duty cut-off plate.
- Utarbeidelse av kanyler:
Merk: I det minste to kanyler er nødvendig per rotte for en bilateral injeksjon. En ekstra kanyle skal brukes i et senere trinn.- Erverve en seksjon av kanyleslangen av tilstrekkelig lengde for å unngå bøyning under prosessen med å markere og skjæring.
- Tegn en 15 mm referanselinje på båndet fra trinn 1.1.2 med en fin-tipped penn. Dette vil fungere som en guide for merking av sekvensielle 15 mm seksjoner på slangen ved hjelp av en skarp permanent markør.
- Berørings kanyleslangen, ved merkede punkter, til den langsomme roterende kappeskive av den roterende verktøy for å hakk slangen. Roter kanylen 180˚ hakk og den motsatte siden av slangen. Ikke kutt gjennom slangen helt, fordi det kan føre til okklusjon.
- Kraftig bøye slangen for å dele det opp i ~ 15 mm seksjoner.
- Holde hver kuttet ende av kanylen vinkelrett på cut-offplate mellom tommel og pekefinger. Rotere kanyleslangen mens de berører tuppen til den store fremre flate av cut-off-plate (dvs. ikke kanten). Dette vil generere en avstumpet tips. Merk: Ikke bøy kanyle, for som kunne gi en off-site injeksjon.
- Ream begge ender av kanylen med en 26 G skrå nål (brun hub) for å sikre at alle grader har blitt fjernet og at kanylen er uhindret.
- Passere en prøve av tetningsmiddelet ledningen kuttet til ~ 35 mm gjennom kutt kanylen for å verifisere at det ikke er noen interne hindringer.
- Plukk opp hver kanyle individuelt ved hjelp unclamped hemostats og måle hver fullført kanyle med en linjal for å sikre at det er nøyaktig 14 mm i lengde.
- Utarbeidelse av obturatorer:
- Klem én kanyle på omtrent halv lengde med medium vekt, rette hemostats. Lå låst pinsetten på benken. Kanylen bør være vinkelrett på benken.
Merk: Denne kanylebør ikke brukes i kirurgi etter å ha blitt holdt ved låst hemostatene, som det er sannsynlig bøyd. - Mate en ende av obturatoren ledningen inn i kanylen før den har nådd benken. Sprette wire i kanylen for å sikre at en graden ikke hindrer den fra å nå frem til benken,. Ie, og nådde bunnen av kanylen. Riktig tetningsmiddelet lengden vil forhindre tilstopping og ekstra vev arrdannelse.
- Bend ledningen ved å knipe med fingrene til en ~ 30˚ vinkel oppnås samtidig opprettholde kontakt mellom tetningsmiddelet og benken. Sørg for at vinkelen på svingen er slik at den ligger i flukt med hodet cap, og det overskytende peker fremover, noe som gjør det vanskeligere for rotta å fjerne.
- Fjern ledningen fra kanyler og skjære av overskytende delen på ~ 2,5 mm fra bøyen med små sidekuttere (trådkappe).
Merk: Minst to obturatorer vil være nødvendig per rotte for en bilateral injeksjon, som hver implantert kanyle krever en tetningsmiddel. Oppretteen ytterligere ~ 35˚ bøye midtveis tetningsmiddelet vil også hjelpe til å hindre fjerning av dyret. Lagre både kanyler og obturatorer i adskilte beholdere (f.eks., 20 ml scintillasjons-glass) inneholdende 70% etanol (v / v) inntil bruk, men i det minste O / N.
- Klem én kanyle på omtrent halv lengde med medium vekt, rette hemostats. Lå låst pinsetten på benken. Kanylen bør være vinkelrett på benken.
- Utarbeidelse og testing av microinjectors:
- Skaff et stykke microinjector nål rør som er ~ 1 m lang.
- Hold den ene ende av slangen microinjector perpendikulært med låste rette hemostats.
- Tvinn pinsetten samtidig strekk på slangen for å kveile det tett rundt pinsetten i det minste en gang.
- Mål 32 mm fra det motsatte, løse enden av microinjector slangen og å forstå dette punktet vinkelrett med en annen rett, middels vekt hemostat og låse dem. Ta tak i microinjector slangen med hemostats på siden av de 32 mm markere nærmest løse enden i stedet for på siden nærmest pinsetten med såret wire.
- Bend slangen frem og tilbake samtidig som spenningen på røret før den bryter.
Merk: En enkel, oppadgående og nedadgående skarp bøyning vil produsere en stump brudd, noe som er ønskelig for å sikre at mikroinjeksjon skjer i ønsket hjernen regionen. - Inspiser microinjector slangen for å sikre at begge endene er rette og at den innvendige diameteren er uhindret.
- Erverve kanyle rør som vil bli brukt til å fremstille et microinjector krage.
- Mål og merk sekvensielle 5 mm deler av kanyleslangen bruke en permanent markør og en 5 mm referanse linje trukket på tape (trinn 1.1.2).
Merk: Hver microinjector krever ett krage. Krage er bare kort kanyler holdt microinjector wire. - Trykk kanyleslangen, på merkede punkter, til sakte roterende cut-off plate av roterende verktøy for å hakk slangen. Roter kanylen 180˚ hakk og den motsatte siden av slangen. Skjære helt kan tilstoppe røret.
- Kraftigbend microinjector krage rør for å dele det opp i ~ 5 mm seksjoner.
- Rømme den innvendige diameter av begge ender av vektrøret med en 26 G nål avfaset (brun hub) for å sikre at det meste av de ujevnheter har blitt fjernet. Noen små grader vil ta tak i microinjector wire og dermed hjelpe til liming.
- Skyv én krage på hver microinjector tube ~ 2 cm fra enden.
- Lag et lite basseng med superlim i hjørnet av en liten veie båt.
- Bruk skrap kanyleslangen kuttet til ~ 25 mm for å bruke en liten mengde av superlim til microinjector tube ~ 5 mm fra den ene enden. Deretter skyver kragen over dette superlim perle, slik at det er ~ 1 mm fra enden av mikroinjeksjon tube. Dekke begge ender av kragen sammen med lim.
Merk: Unngå en stor ansamling av superlim på kragen, da det vil hindre plastrør fra tetting rundt microinjector. Mens det er viktig å unngå å få super lim på den åpne ende av microinjector rør, da dette vil gjøreden microinjector ubrukelig, er det også viktig å skyve kragen så nær enden som mulig for å minimalisere hulrom (ikke-injisert) volum. - Len fullført microinjector på utsiden av en annen liten veie båten med krage side opp og la det tørke i 24 timer.
- Skaff en ~ 8 cm stykke microinjector plastrør (PE20 eller tilsvarende), 1 ml sprøyte fylt med sterilt vann, og 26 G skrå nål (brun hub).
- Fest en 26 G (brun hub) nål til sprøyten og skyv kutt slangen på nålen, og sikrer ikke å punktere tube.
- Skyv plastrør over kragen enden av det tørkede, hele microinjector.
- Klem vannet fylte sprøyten stempelet for å teste for åpenhet.
Merk: Vann bør spraye veldig langt og rett ut av microinjector spissen. Hvis strømmen ikke er rett, vil injeksjon plasseringen ikke være riktig. Kilden til en sidelengs eller diffus spray er en dårlig pause (trinn 1.4.5). En microinjector bør not brukes hvis spray er sidelengs eller diffuse. Saline bør ikke brukes, da det kan tette microinjector eller nål. - Trekk sprøyten tilbake for å fjerne vann fra microinjector. Oppbevares på et tørt, forseglet rør, for eksempel, en 20 ml scintillasjonsglass.
Merk: Microinjectors kan autoklaveres etter produksjonen med de fleste super lim, 31 men dette må bestemmes empirisk. Alternative steriliseringsteknikker omfatter etylenoksid og gammastråling.
2. Å for og utøvende Microinjections
- Oppnå ferdige microinjectors, microinjector plastrør (PE20 eller tilsvarende), mikroinjeksjon pumpe, to små veie båter, sterilt vann, 70% etanol (v / v), aceton, to gasstett 1 ul sprøyter av glass med en butt nål (25 G), bomull tippet tre applikatorer, reserve obturatorer, 1 ml sprøyte, 26 G (brun hub) nål, små buede tang (style # 7 anbefales), og lab wIpes.
- Forbereder microinjectors for injeksjon:
- Bend fullført microinjector 15 mm fra enden motsatt av kraven, slik at vinkelen mellom de to er ~ 95˚.
Merk: En presis bend plassering er avgjørende for nøyaktig injeksjon plassering. Bruke # 7 pinsett (eller lignende) for å ta tak i microinjector og bøye oppover er nyttig. Alltid re-måle lengden før du utfører microinjections. - Kutt plastrør (PE20) til ~ 70 cm og gli over microinjector krage.
Merk: Legge tape faner til ett plastrør nær både microinjector og løse enden er nyttig når du fullfører injeksjoner, spesielt når injisere to forskjellige løsninger. Tabs er ikke anbefalt for begge rør som de blir tungvint under injeksjonen.
- Bend fullført microinjector 15 mm fra enden motsatt av kraven, slik at vinkelen mellom de to er ~ 95˚.
- Forbereder pumpe for microinjections:
- Slå på pumpen.
- Still diameter på mikroinjeksjon nål, ønsket infusjonshastighet, og målrette injeksjonsvolum.
Merk: Infusjons rottee og injeksjonsvolumet er avhengig av eksperimentelle krav. Dette er utdypet i diskusjonen. Noen pumper har sprøyte tabeller forhåndslastet. Hvis ikke, kan en sprøyte bord finnes på produksjon nettside (r). - Satt pumpe modus til "Volume", slik at et nøyaktig volum blir levert automatisk. Hvis "Pump" -modus er valgt i stedet, må eksperimentator manuelt stoppe pumpen.
- Justere pumpen backstop å la sprøyten for å fylle på injeksjonsvolumet pluss en ekstra 0,2 mL.
- Forbereder mikroinjeksjon sprøyte og microinjector for injeksjon:
- Lås hver gasstett mikroinjeksjon sprøyte inn rack av mikroinjeksjon pumpen.
- Plasser tuppen av gasstett sprøyte inn i det sterile vannet inneholdt i en liten veie båt og forsiktig flagre i stempelet for å smøre den indre ledning. Jevnt trekk stempelet til løpssperre på pumpen for å fylle med vann.
- Skyv PE20 rør som er connected til microinjector (i trinn 2,2) på en 26 g (brun hub) nål festet til en 1 ml sprøyte som er fylt med sterilt vann. Spray sterilt vann gjennom microinjector, og inspisere spraymønster og avstand.
Merk: Vann bør spraye veldig langt og rett ut av microinjector spissen. Hvis strømmen ikke er rett, vil injeksjon plasseringen ikke være riktig. - Plasser sterilisert microinjector på et sterilt felt.
- Skyv slangen ut av nålen, holde microinjector slangen stående for å unngå vann drypper samtidig kutte slangen nedenfor området skadet av kanylen.
- Skyv mikroinjeksjon sprøytestempelet litt forover for å lage en dråpe på enden av nålen og skyver den vannfylte PE20 rør (som er koblet til den microinjector) på nålen.
Merk: Dette vil skape en flytende-til-væske-tilkobling som vil tillate passende mottrykk som kan løsne en tresko som kunne dannetuppen av microinjector. - Skyv stempelet helt frem til forberede prøven lasting og sikre at ingen spor etanol forblir i microinjector.
- Sjekk oppsettet for lekkasjer ved å berøre vanndråpe som har dannet på spissen av microinjector til et rent lab tørke flere ganger.
- Merk: Når du trykker til laboratoriet tørke, bør bare én våt flekk danne. Hvis det er flere dråper, er det en lekkasje i systemet.
- Unngå lekkasjer ved å kontrollere superlim søknad (trinn 1.4.14) og ved å trimme PE20 rør med skarp saks eller et barberblad helst at PE20 rør er fjernet fra noen sammenheng. I tillegg kan du gjenta trinn 2.4.3 via 2.4.8 for å bøte lekkasjen.
- Trekk stempelet forsiktig tilbake 0,2 ul; å skape en boble mellom det sterile vannet i PE20 slange / microinjector og løsningen som skal injiseres.
- Merk: Denne boblen hindrer fortynning av injektatet, forurensning av vann, og tillaterfor overvåking av injeksjonsprosessen siden den vil bevege seg under injeksjonen. Et enkelt, solid boble bør produseres. Hvis den er brutt, er en lekkasje tilstede eller microinjector spissen er okkludert; indikerer at trinn 2.4.8 (og medfølgende notat) bør gjentas.
- Plasser microinjector inn reagensen som skal injiseres og sakte drar du stempelet til løpssperre.
- Forbereder dyr for injeksjon:
- Hold rotte bryst mot eksperimentator bryst. Rengjøre området omkring kanyler med en bomulls applikator dyppet i 70% etanol (v / v).
- Merk: Med riktig behandling, kan mus være forsiktig behersket i en cupped hånd. Ellers kan scruffing være nødvendig.
- Fjern obturatorer ved hjelp av små tenger og sted til veie båt med 70% etanol (v / v).
- Utføre injeksjoner:
- Plasser fylt microinjector (trinn 2.4.10) inn kanyle. Trykk start på mikroinjeksjon pumpe og monitor boble bevegelse.
- Merk: Det may være nødvendig å bruke et lett trykk for å sikre at microinjectors ikke løfte. Boblen (dannet i trinn 2.4.9) bør jevnt avansere og fullt inn i microinjector.
- Fjern de microinjectors fra kanylen og erstatte obturatorer, når injeksjonen er ferdig og etter injeksjon diffusjon periode har gått.
- Merk: Typiske etter injeksjon diffusjon ganger er 2 - 4 min for farmakologiske reagenser, og 2 - 10 min for virus. Forlater microinjector i løpet perioden etter infusjonen hindrer injektatet fra refluksere tilbake opp kanyler i stedet for å spre inn i vevet. Plasser obturatorer på siden av etanolen fylte veie båt for å tillate etanol til å renne før den settes inn i kanylen.
3. Post-Injection Clean Up
- Få tak i en liten ampulle av hver: sterilt vann, 70% EtOH, og aceton.
- Rengjøring microinjector og mikroinjeksjon sprøyte:
- Fjern glassprøytes fra pumpesprøyte rack og mikroinjeksjon slangen fra glassprøyte.
- Koble microinjector slangen fra glass sprøyte og fest en 1 ml sprøyte fylt med sterilt vann til microinjector rør via en 26 G nål (brun hub). Skyv en ml sprøytestempelet frem til å utvise ~ 0,3 ml. Deretter trykker du på tuppen av microinjector til en lab-tørke og trekke luft tilbake gjennom microinjector.
Merk: microinjector og rør kan gjenbrukes for lignende eksperimenter hvis det anses forsvarlig. - Plasser glass kanylen inn sterilt vann og trekke stempelet helt tilbake. Deretter skyver stempelet helt frem til å tømme. Berøre glasset sprøytespissen til en lab tørke for å sikre at ingen væske gjenstår.
- Gjenta trinn 3.2.3 med sterilt vann, luft, 70% EtOH, og aceton i følgende rekkefølge: sterilt vann, sterilt vann, luft, luft, 70% EtOH, 70% EtOH, luft, luft, aceton, aceton, luft, luft. Utføre alle disse renhold trinnene vil bidra til å bevare mikroinjeksjon sprøyten.
- Plasser microinjector sprøyten (e) i emballasje og trekke stempelet tilbake til 0,05 mL.
Merk: Dette er viktig, fordi det gir stempelet skyves eller trekkes for å løsne en fastlåst stempelet som kan oppstå bør eventuelle saltavleiringer dannes etter lagring.
4. Programmering av motivasjon analysen
- Logg inn Grafisk State med administratorrettigheter.
- Velg eller opprett relevant database.
- Opprette progressiv ratio forsterkning tidsplan:
- Velger Lister> Database nivå Lister> Event Transition parameterlister.
- Velg "Legg til". Skriv inn riktig listenummer (L #) og beskrivelse.
- Velg "Legg Hendelser '.
- Skriv inn den første forsterkning tidsplan verdi og velg "Legg til". Gjenta.
Note: Verdier kan bestemmes ved hjelp av en formel hvor det progressive forholdet tidsplanen = 5e (j * (tjent forsterker + 1)) -5 7.For å kunne tilpasse denne ligningen for å teste hypotesen på riktig måte, må verdien j bestemmes empirisk eller hentet fra litteraturen. - Velg I Order 'innenfor' Utvalg Bestill "-boksen.
- Velg "Hold Verdi = til: ____ 'innenfor" når du er ferdig "-boksen. Skriv inn forsterkning timeplanen verdi i tekstboksen som langt overstiger forventet å svare. Dette vil være nødvendig innsats for alle etterfølgende oppføringer når listen er oppbrukt.
- Opprette en eksperimentell protokoll:
Merk: Grafisk State flytter faget gjennom en rekke stater som er gått ut basert på enten tid eller ytelseskriterier. Sett alle diskrete og kontekstuelle signaler og parametere merket nedenfor som '$' å teste riktig hypotesen som undersøkes.- Velg Fil> Opprett Experiment Protocol.
- Skriv inn ønsket protokollnummer og beskrivelse inn aktuelle tekstboksen. Velg "State Creation".
- Sett alle stimuli for både "KLAR - Klar State" og "FIN - ferdige State".
- Velg "New State" og kaller det 'S2 - PR Svare.
- Velg "New State" og kaller det 'S3 -. PR forsterker og Cue'
- Velg "New State" og kaller det 'S4 - Timeout ".
- Merk "S1" og gi den navnet "S1 -. Tilvenning '
- Velg Legg til 'Time Gå til.'
- Skriv inn riktig tid ($) og enheter ($), f.eks., Minutter og velg "S2" fra TIL S drop down boks. Tidsenheten "enheter" ble bestemt når databasen ble opprinnelig opprettet.
Merk: Den opprettede tid overgangen bør lese lik [Etter $ minutter GÅ P = 100%, TO S2] Figur 1 er et eksempel på dette arrangementet en gang skapt.
</ ol>
Figur 1. Representant programmering eksempel nummer 1. I dette tilfellet en tid avgrenset tilstand er illustrert hvor en brukerdefinert verdi av $, her vist i minutter, indikerer når den nåværende tilstand bør avslutte for å oppgi 2 (S2).
- Merk "S2 - PR Svare.
- Velg Add 'Hendelses Gå til.'
- Skriv inn listenavn som inneholder den progressive forholdet tidsplan som ble opprettet i trinn 4.3 inn i den første tekstboksen som L $ (f.eks L1), velg riktig operandum (f.eks., Spak eller nesen rote) fra første drop down boksen, og velg ' S3 'fra TO S drop down boks.
Merk: opprettet arrangementet kan lese lik [IF L $ 1 - Aktiv GO P = 100%, TO S3]. Identifikatoren 1 - Active ble utpekt under database. Her, en - Activerefererer til operandum koblet til bryteren én. - Velg "Legg Tid Gå til. '
- Sjekk 'R' boksen angir passende tid og enheter ($), og velg "FIN" fra TIL S drop down boks.
Merk: Den opprettede tid hendelse kan lese lik [R (sjekket) IF $ minutter GÅ P = 100%, TIL FIN]. Dette vil sikre at økten vil ende hvis det ikke er aktivitet på at operandum etter innstilt terskel,. Dvs. vil session timeout etter at dyret holder tilbake svare på forsterker-paret operandum for settet periode. - Velg Add 'Hendelses Gå til.'
- Sjekk 'R' boksen, skriv en inn i den første tekstboksen, merker utgivelsen av aktuelle operandum fra første drop down boksen og velg "S2" fra TIL S drop down boks.
Merk: opprettet arrangementet kan lese lik [R (sjekket) Etter $ [1] Aktiv GO P = 100%, TO S2]. Dette trinnet sikrer at ved frigjøring av operandum(angitt med parentes ovenfor), at staten er reentered, og dermed tilbakestille timeout Session terskel (4.4.9.4). På dette punktet, vil staten gå ut når den progressive forholdet som finnes i listen er fullført (trinn 4.4.9.2) eller økt ganger ute (steg 4.4.9.4). Således, hver gang at operandum er aktivert, teller den mot progressive forholdet. . Og hver gang at operandum inaktiveres, for eksempel, er spaken slippes eller nesen rote forlates, er timeout Session terskel (trinn 4.4.9.4) reset figur 2 representerer alle overgangene som er programmert for 'S2 - PR Svare.. '
Figur 2. Representative programmering eksempel # 2. Her, blir den avsluttes ved en av to kriterier. L $ er den progressive forholdet tidsplanen opprettet i trinn 4.3. Ved tidsplan completion, avslutter stat til stat 3 (S3). Merk at dette kriteriet ikke har en R, som gjør at tidsplanen for å gå videre i stedet for å begynne på nytt på hver reentry inn i denne tilstanden. Staten kan også exit etter '$' minutter å oppgi FIN. Dette er den forhåndsbestemte timeout terskelen etter økten vil opphøre dersom ingen reagerer skjer innenfor dette vinduet. Dette forklares nærmere i diskusjonen. Endelig er det Session timeout terskelen null på hver operandum utgivelse. Således '[1]' indikerer frigjøring av operandum '1'.
- Høydepunktet 'S3 - PR forsterker og Cue.
- Velg "Legg Tid gå til '
- Skriv inn riktig tid og enheter for å levere forsterkeren ($), og velg "S4" fra TIL S nedtrekkslisten.
Merk: Den opprettede tid hendelse kan lese lik [Etter $ sekunder GÅ P = 100%, TO S4].
- Høydepunktet 'S4 - Timeout.
- Skriv inn riktig tid og enheter for å forbli i en inaktiv tilstand ($) etter forsterker levering, og velg "S2" fra TIL S nedtrekkslisten.
Merk: Den opprettede tid hendelse kan lese lik [Etter $ sekunder GÅ P = 100%, TO S2]. Statens S4 - Timeout "kan ikke være nødvendig for alle design.
Merk: Denne protokollen er nå klar til å kjøre.
Representative Results
Her vi illustrere eksempler på resultater som kan oppnås med fremgangsmåten ovenfor. Vist første er et typisk område som er transfektert ved virale vektorer (figur 3). Generelt er en transfektert volum på ~ 1 mm 3 oppnådd i striatal vev. Volumet av det transfekterte region kan kvantifiseres på tvers av seriesnitt ved hjelp av Cavalieri metode 32 Viktigere er det transfekterte volum er avhengig av mange faktorer, slik som typen av vev som blir transfektert.; viral serotype; arrangøren; hastighet og volum injisert; antall partikler som er injisert; injektatet pH; og om hyperosmolar reagenser, som for eksempel mannitol, ble anvendt. 33,34 Vanligvis microinject vi 10 12 partikler / ml, 1 ul / side over 10 min, og tillate ytterligere 7 minutter før erstatte obturatorer. I tillegg er injektatet vanligvis rundt pH 8. Deretter viser vi at motivasjonen kan manipuleres ved enten transgene ekspresjon (figur 4)eller farmakologisk reagent mikroinjeksjon (Figur 5).
I figur 4, uttrykte vi en Designer Receptor Eksklusivt Aktiveres av Designer Drugs (DREADDs). Den DREADD reseptor-kodende region ble etterfulgt av en intern ribosom Entry nettstedet og mCitrine kassett. Den mCitrine gir praktisk visualisering av transfekterte celler. Den DREADD ble koblet til den heterotrimeric G-protein Gαq. Aktivering av Gαq-koplede DREADD kan stimulere astrocytter, 28,35 og DREADD i seg selv kan aktiveres ved systemisk administrering av klozapin-N-oksyd (CNO, 3 mg / kg, ip). 14,22,36 Rotter ble trenet til å spaken svare for etanol forsterkning, hvor 3 spak presser gitt en sjanse til å drikke under daglig 1 time økter over 60 sammenhengende dager. Deretter ble rottene tvunget inn i avholdenhet, og Gαq-koblede DREADDs ble uttrykt i nucleus accumbens kjerne astrocytter. Etter tre ukers avholdenhet, motivasjon til selv Admi nister etanol ble målt ved stoppunkt. 21,27-30 Aktivering av nucleus accumbens kjerne astrocytter, via systemisk CNO administrasjon, redusert motivasjonen for rotter å gjenoppta etanol selvstyre etter avholdenhet i forhold til bilen. Viktigere, hadde CNO ingen effekt i en like trent kohort som ble uttrykker grønt fluorescerende protein i stedet for DREADD.
Figur 3. Representative ventral striatale region transfektert ved mikroinjisert virus. Dette bilde illustrerer området av nucleus accumbens astrocytter som ble transfektert ved å følge den ovenfor beskrevne fremgangsmåte. Data er gjengitt fra Bull et al. 13 med tillatelse fra rettighetsinnehaver. Detaljer kan finnes i at offentliggjøring og den tilhørende supplerende materiale.blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Motivasjon av rotter om å selvadministrere etanol ble redusert ved å aktivere et transgen som var over-uttrykt i nucleus accumbens kjerne astrocytter. Virus ble mikroinjisert og motivasjon målt via stoppunkt etter at en uke for viruset å uttrykke. Transgenet uttrykkes ble en Designer Receptor Eksklusivt Aktiveres av Designer Drugs (DREADDs). En en-veis ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), fulgt av en Scheffé post-hoc viste at aktivering av DREADD ved systemisk administrering av klozapin-N-oksyd (CNO, 3 mg / kg, ip ) betydelig redusert motivasjon av rotter om å selvadministrere etanol etter avholdenhet i forhold til kjøretøyet CNO hadde ingen effekt i en like trent kohort som ble uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i stedet for DREADD. Data er gjengitt fra Bull et al. 13 med tillatelse fra rettighetsinnehaver. Detaljer kan finnes i at offentliggjøring og den tilhørende supplerende materiale.
Figur 5. Mikroinjeksjon av gap junction blokkere økt motivasjon for rotter å selvadministrere etanol etter avholdenhet To gap junction blokkere ble evaluert for sin effekt på motivasjon (målt via stoppunkt) fra rotter til å selvadministrere etanol. Meflokin og 18- a-glycyrrhetinsyre (18-α). En to-veis ANOVA viste at mikroinjeksjon av gap-junction-stopper inn i nucleus accumbens kjernen økt motivasjon for rotter å selvadministrere etanol etter avholdenhet (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Data er gjengitt fra Bull et al. 13 med tillatelse fra rettighetsinnehaver. Detaljer kan finnes i at offentliggjøring ogmedfølgende supplerende materiale.
Discussion
Prosedyren som presenteres her er en effektiv måte å produsere mikroinjeksjon kanyler og microinjectors som vil hjelpe til å belyse de molekylære substrater for motivert atferd. Denne fremgangsmåte byr på flere fordeler. Først ved produksjon ens egne implantater og microinjectors, nye eksperimentelle parametre kan raskt optimalisert, dvs. en ikke trenger å vente på skreddersydde komponenter for å komme frem. For det andre, på grunn av den lille diameter av kanylen, flere kanyler kan samtidig implantert. Dette forkorter den nødvendige kirurgiske tiden, noe som kan forbedre overlevelsesevne, og også tillater flere implantater per dyr. For det tredje, den programvare som benyttes for å kontrollere driftsavdelingene lett rommer progressive forhold tidsplaner ettersom et fast forhold paradigme hurtig kan omdannes til en progressiv forhold paradigme ved ganske enkelt å bruke et arrangement overgang parameterliste som inneholder den ønskede forsterkning plan.
Å værebredt anvendelige, er en generisk mikroinjeksjon fremgangsmåte presenteres som bør være generelt anvendbar for mikroinjeksjon av nesten en hvilken som helst reagens som for tiden er tilgjengelig. Derfor forventer vi at denne teknikken vil fortsette å være av tilsvarende høy nytte i fremtiden med mindre endring. Ved å endre bare noen variabler kan denne tilnærming brukes til et stort antall reagenser. Parametere som vil oftest manipuleres omfatter den lengden som den microinjector stikker ut fra kanylen, volum av injeksjon, og injeksjonshastigheten. For eksempel kan en ønsker injektoren å stikke ytterligere fra kanylen tips for å unngå glial arr som vanligvis utgjør rundt kroniske implantater. I tillegg kan det være ønskelig å sprøyte inn et større volum. For striatale virus microinjections, blir et volum på 1 mL typisk benyttet, og dette volumet blir vanligvis injisert i løpet av et lengre tidsrom (ofte 7-10 min pluss 3 - 10 min ytterligere diffusjon tid) i forhold til bruksd for farmakologiske reagenser (typisk 0,3 - 0,5 uL mer enn 2 - 3 min pluss 1 - 3 min ekstra diffusjon tid). Brukeren bør konsultere litteraturen og / eller empirisk bestemme parametrene best egnet for deres behov. Uansett, er suksessen til denne prosedyren kritisk avhengig 4 variabler: 1) kanyle lengde, 2) microinjector lengde, 3) kvaliteten på microinjector spray mønster, og 4) systemintegritet før injeksjon. Fordi mikroinjeksjon plassering er avhengig av den dybde som den microinjector stikker ut fra kanylen, er det viktig at begge kanyler (trinn 1.2.8) og microinjector lengde (post-bøying, trinn 2.2.1) er både nøyaktig kjent og ensartet mellom alle fag . Dette kan lett kontrolleres ved lett forkaster enhver redskap som ikke er ønsket lengde ved den endelige re-måling. Dessuten kan injeksjons plassering bare kan forutsies dersom den skjer umiddelbart under lede kanyle. Dermed noen microinjector at does ikke spray en lang, fin strøm ved testing (Steps 2.4.6) bør avvises. En kvalitet injeksjon er også relatert til integriteten til systemet før injeksjon. Hvis du etter utlevering alt vann fra injektoren (før fylling med reagens) flere flekker er observert på lab-tørke, deretter en lekkasje som må utbedres (Merknad om Step 2.4.8). Videre, hvis boble (trinn 2.4.9) som skiller stoffet fra vannet i PE20 rør er ikke en enkelt boble (etter fylling av microinjector med reagens), og injektoren er delvis tilstoppet. Denne tette kan enten forebygge eller avlede injeksjon. Også dette kan lett utbedres (Note på trinn 2.4.8).
Skulle man ønske å microinject mens dyret er i stereotaksisk ramme er det tre alternativer. For det første kan man øke lengden av microinjector kragen slik at den kan holdes fast i stereotaktisk manipulator, og også strekker seg langt nok til å tillate tilkobling til PE20 slange. Sekund, påe kunne timelig implantere en kanyle og bruke standard microinjector presenteres her. Tredje, kan man bruke trukket og polert glass pipetter. 16,17
En betydelig begrensning av fremgangsmåten som presenteres her, er at den utføres best i godt håndtert rotter som er kjent med fremgangsmåten. Rotter som brukes til de dataene som er beskrevet i resultatene delen kreves ingen spesielle håndteringsprosedyrer fordi samme etterforsker håndtert rottene på en daglig basis i over to måneder. Dette omfattet daglig observasjon og manipulering av det kirurgiske implantat i minst 2 uker. Imidlertid kan rotter hurtig tilvendt ved et antall teknikker som brukes til å før pre-puls inhiberingsanalysen, som kan påvirkes av stress. Disse spesielle tilvenning teknikker har blitt pent beskrevet tidligere. 43 I tillegg til disse prosedyrene, er det tilrådelig at rotter bli tilvendt mikroinjeksjon prosedyre hvor forkortede microinjectors brukes during 'humbug' injeksjoner. I løpet av disse simulert injeksjoner, er det avgjørende at microinjector ikke stikker inn i vev for å begrense skade på vev. Med andre ord, bør den microinjector bøyes ikke lenger enn 14 mm. Således kan den grundige tilvenning som kreves for optimal gjennomføring av denne teknikken bli sett på som en begrensning.
Mens flere atferds paradigmer eksisterer for å måle motivasjon, er den progressive forholdet vanligvis brukes til å kvantifisere innsatsen at faget er villig til å øve for å få en forsterker. Den progressive forholdet paradigmet frembringer et mål som kalles brytningspunkt, som ofte er definert som det maksimale antallet håndtakpressinger i den siste fullførte forhold;.. Dvs. maksimal respons som genererte en forsterker 21 den progressive forholdet er følsom for forsterkeren størrelsesorden. For eksempel, høyere kokain (eller sukrose) doser produsere en høyere brytningspunkt og lavere kokain (eller sukrose) doser ga en lavere breakpoint. 21,22 Følgelig er stoppunkt en rutinemessig brukt proxy for motivasjon og / eller forsterkende effekt. 21,23-26 Fordi hensikten med stoppunkt er å bestemme når dyret slutter å svare, en viktig parameter for den progressive forholdet paradigme er innloggingstid. Finite session lengder kan sette en falsk cap på stoppunkt verdier, og dette kan bli forverret av pre-behandlinger som unormalt reduserer frekvensen av selv administrasjon eller som øker etter forsterkning pauser. Dette forvirre kan overvinnes av en rekke tilnærminger.. For eksempel økter som avsluttes når dyret har holdt tilbake reagerer med noen flere av den gjennomsnittlige inter-infusjon intervallet 44 A oftere brukt variant av denne tilnærmingen er å avslutte økter en gang svarer har blitt holdt tilbake av noen empirisk bestemt verdi som holdes konstant på tvers av fag. Vi har gitt den metoden for å bruke denne tilnærmingen i trinn 4.4.9.11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
