ניטור נייד Orthotopic השרשה והיקפי חיסון במודל השני-45 syngeneic עכברוש מזותליומה
Summary
הדור של מודל עכברים orthotopic של מזותליומה pleural הממארת על ידי השתלה של תאי II-45 מזותליומה לתוך חלל pleural של חולדות המוסמכות חיסוניים מוצג. שיטת cytometric זרימה לנתח שבע תת תא חיסון בבעלי החיים אלה מדגימת דם 25 μl גם מתוארת.
Abstract
התגברות העצומה של עניין בטיפולים מבוסס חיסון לסרטן כגון חיסונים ומעכבי מחסום חיסוניים, והבנה מוגברת של התפקיד של מייקרו-הסביבה של הגידול בתגובה לטיפול, באופן קולקטיבי מצביעה על הצורך במודלים orthotopic חיסון מוסמך לבדיקות פרה-קליניות טיפולים החדשים אלה. מסמך זה מדגים כיצד להקים מודל חולדה חיסון מוסמך orthotopic של מזותליומה pleural הממארת. התקדמות מחלה ניטור בדגמי orthotopic מסכלת את המיקום הפנימי של הגידולים. לlongitudinally לעקוב אחר התקדמות מחלה והשפעתה על מחזור תאים חיסוניים בזה ומודלים של עכברים אחרים של סרטן, צינור יחיד cytometry זרימת assay דורש רק 25 μl כל הדם מתואר. זה מספק כימות מדויק של שבעה פרמטרים חיסוניים: ימפוציטים מוחלט, מונוציטים ונויטרופילים, כמו גם תת-T תאי CD4 ו CD8, B-תאים ותאים קטלניים. צוללות שונותETS של פרמטרים אלה הם שימושיים בנסיבות ובדגמים שונים, עם נויטרופילים יחס הלימפוציטים שיש התועלת הגדולה ביותר לניטור התקדמות מחלה במודל מזותליומה. ניתוח במחזור רמות תא חיסון בשיטת צינור יחיד זה גם יכול לסייע בניטור התגובה לטיפולים מבוסס חיסון והבנת המנגנונים שבבסיס המוביל להצלחה או כישלון של טיפול.
Introduction
מזותליומה ממאירה (MM) היא גידול ממאיר אגרסיווי שנובע מהתאים הפכו בקרום (mesothelium) שקווי הריאות וחללים בטן, לב ואיברי רבייה פנימי, והוא הגידול הראשוני הנפוץ ביותר של חלל הריאות או 1,2 הצדר . חשיפה לסיבי אזבסט מהווה 80% מכל MM, ותוך איסור על שימוש אזבסט הוכנסו לפני עשרות שנים ברוב מדינות מערב, השימוש הנרחב שלה בקהילה השאיר מורשת קטלנית. ארגון הבריאות העולמית מעריך כי 107,000 אנשים ברחבי העולם מת מדי שנה ממחלות הקשורות לאזבסט, עם שיעורי תמותה ממשיכים להגדיל. גל שכיחות שאינה בעיסוק חדש הוא גם מתעורר ויש הבנה קטנה של מתי, ובאיזו רמה זה יהיה שיא 3.
רוב האנשים עם MM מאובחנים מאוחר כאשר כימותרפיה מערכתית מייצגת את אחד מאפשרויות קיימא רק 4. רוב effectiיש כימותרפיה ו'טיפול סטנדרטי 'הנוכחי (pemetrexed יחד עם ציספלטין 5) זוהה לפני מעל 10 שנים. עם זאת כישלון של טיפול זה הוא בלתי נמנע ואין אפשרויות מוכחות שני קו, עוזבים חולים עם פרוגנוזה עגומה וחציון הישרדות של 12 חודשים בלבד 2. לכן, יש צורך מסופק דחוף לטיפולים יעילים יותר. למרות הבדיקה של מספר הטיפולים חדשניים בניסויים קליניים אף אחד מהם הביא לשינויים בפרקטיקה. זה נובע בחלקו (5%) ההעברה הנמוכה של תוצאות פרה-קליניות, מבוצעת בדרך כלל בדגמי עכבר xenograft, להגדרה הקלינית 6-8. מודלים כאלה בנאמנות לא לשחזר את ההיבטים המורכבים של מייקרו-הסביבה של הגידול המתרחש במקומות שאינם פיסיולוגיים, לעתים קרובות בהעדר מערכת חיסונית מתפקדת 9.
דגמי orthotopic syngeneic ליצור סביבת גידול משמעותי יותר מציאותית מגommonly השתמש במודלי xenograft תת עורית כגידולים להתרחש במיקום הפיזיולוגי הנכון עם 10,11 מערכת חיסוני בשלמותה. הגודל הגדול יותר של העכברוש משפר את השימוש בו כמודל מחלה מכרסם, במיוחד במחקרי סמים שבו דם סידורי שואב נדרשים כדי להעריך את התגובה לטיפול ורעילות 12. יתר על כן, בדגמים שבי ניטור התקדמות מחלה קשה בשל המיקום של הגידולים (כגון בחלל פלאורלי), את היכולת לעקוב אחר התקדמות מחלה באמצעות גורמים הנמצאים במחזור הוא מאוד אטרקטיבי. הדור של מודל orthotopic syngeneic של מזותליומה pleural באמצעות חולדות חיסון מוסמכת מתואר. בנוסף, שיטה קלה ויחסית לא פולשנית לניטור התקדמות המחלה pleural על ידי מדידת תאים חיסוניים במחזור מתואר גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מפרט שיטה לייצור מודל syngeneic עכברוש orthotopic של מזותליומה pleural ושיטה פשוטה לניטור התקדמות מחלה באמצעות דגימת דם אורך.
המודל השני-45 פותח על ידי חשיפת פישר 344 חולדות לסיבי אזבסט 13. למרות חשיפה זו מייצגת את הדינמיקה האמיתית ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.
Materials
| EDTA Collection tube (0.5ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount™ Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1mL Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur™ 4 colour | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail?. Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What’s wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats!. Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
